FISH在产前诊断及遗传咨询中的应用

荧光原位杂交(FISH)是近年发展起来的一种分子生物学、细胞遗传学及免疫学技术相结合的全新技术,在基础生物学领域和临床研究中得到广泛应用。FISH是一种非放射原性杂交法,它利用特殊的荧光素标记DNA探针,在染色体制片、细胞滴片或组织切片上进行DNA杂交,经免疫荧光显色,可以检测细胞内DNA或RNA存在与否,既可以显示染色体中期分裂相,又能显示未培养的间期核[1]。可用于性别鉴定、染色体非整倍体诊断、染色体结构异常诊断、基因定位、间期细胞遗传学及肿瘤遗传学方面的研究。一、FISH在产前诊断中的应用1.用于绒毛样本(CVS)的染色体分析绒毛细胞是胚胎外胚层细胞,其遗传信息与胎儿相同。因为绒毛膜绒毛取材获取的绒毛量相对较少,有时不能得到足够可够分析的染色体中期分裂相,给诊断带来困难,故同时应用FISH进行分析以提供更多的遗传信息,可及早做出诊断。孕早期的早检查、早诊断,可及时发现胎儿染色体异常,使孕妇在早期终止妊娠。当孕早期对绒毛检测无结果时,还可进一步于孕中期羊水细胞检测。Toth[2]等人为研究FISH技术用于诊断Down综合征,取331份标本,至少分析了50个细胞,无1例假阳性与假阴性。间期细胞FISH所分析...     

武汉地区77例流产绒毛细胞的染色体核型分析

目的分析早期自然流产绒毛样本的细胞染色体核型,探讨孕早期绒毛染色体分析技术在流产查因中应用现状。方法应用长期培养法对77例早期流产的胎儿绒毛组织进行细胞培养,对培养成功的绒毛细胞进行染色体核型分析。结果 77例自然流产的绒毛组织中细胞培养成功40例(51.9%)。其中,检出染色体异常25例(62.5%),数目异常17例(68%),结构异常6例(24%),数目异常合并结构异常2例(8%)。结论胚胎染色体异常是早期自然流产的主要原因,绒毛染色体的检查有利于查明流产原因,但实际应用中培养成功率不高,可结合其它分子技术共同应用于临床。     

214例孕早期流产患者绒毛细胞培养及其遗传学分析

目的探讨绒毛细胞染色体异常与孕早期自然流产间的临床关系。方法对214例妊娠早期自然流产患者绒毛细胞进行培养,染色体制备及核型分析。结果进行绒毛细胞染色体培养214例,培养成功201例,总体成功率达93.9%,可用于染色体核型分析报告198例,分析成功率为92.5%。共分析绒毛标本198例,其中检出正常核型101例,占51.0%(101/198);异常核型97例,占49.0%(97/198)。异常核型中以数目异常为主,其中常染色体三体最多见,61例(63%);三倍体13例(13%);性染色体异常9例(9%);结构异常8例(8%)。结论胚胎染色体异常时导致妊娠早期自然流产的重要因素之一,临床上开展流产绒毛染色体检查有利于判断本次流产原因,合理指导下次妊娠。     

简便绒毛细胞培养法制备染色体

目的探讨一种简便的绒毛细胞培养方法以及绒毛和胚芽染色体核型一致性分析。方法将33例标本(包括17例胚胎停育组和16例正常对照组)分别用胰蛋白酶法、胰蛋白酶加机械研磨法制备细胞悬液,培养后制备染色体,比较这两种消化方法在培养周期、核分裂相数等方面的差异;比较16例对照组标本在培养周期、分裂指数等方面的差异;将20例标本分别行绒毛、孕囊壁、胚芽染色体核型分析,比较三者染色体核型是否一致。结果 33例标本中有1例培养失败,培养成功率97%,16例胚胎停育组中检出异常核型7例。两种消化方法在绒毛细胞培养周期上具有显著相关性,但与核分裂相的数目无相关性。16例对照组中,与其他胎龄组相比,12周胎龄绒毛组织原代培养周期最长,有显著差异;二次传代周期和平均分裂指数均明显优于与原代。20例标本中有1例绒毛和胚芽染色体核型不一致。结论应用胰酶消化加机械研磨法制备绒毛细胞悬液,培养后制备染色体,方法简单高效;第二次传代培养有助于提高培养成功率并节约核型分析时间;对于同一标本,绒毛和胚芽染色体核型可能不完全一致。     

绒毛细胞培养方法的比较及绒毛细胞核型分析在胚胎停育中的应用

目的探讨两种绒毛细胞培养方法对绒毛细胞培养结果的影响以及其染色体核型分析在胚胎停育中的应用。方法取103例胚胎停育的绒毛细胞分别采用胰酶与胶原酶混合消化法和组织块直接培养法进行细胞培养、染色体核型分析。结果 103例绒毛组织两种方法均培养成功98例,培养成功率为95.1%,胰酶与胶原酶混合消化法比组织块培养法培养时间更短。共分析绒毛标本98例,发现异常核型42例,异常率42.86%,其中数目异常最多(39例)。结论胰酶与胶原酶混合消化法可以缩短绒毛细胞培养时间,绒毛染色体核型异常是胚胎停育的重要因素。     

人早孕绒毛滋养层细胞原代培养:差异贴壁法与消化排除法联合应用的可行性

背景:国内外有关人绒毛膜滋养层细胞的体外培养方法,大多步骤繁琐,细胞纯度低而且成本很高,不适于普通实验室推广应用。目的:拟求建立一种人妊娠5～10周绒毛滋养层细胞简便有效的分离培养及鉴定方法。方法:采用改进的胰酶消化法分离培养妊娠5～10周人绒毛滋养层细胞,加0.0625%胰酶,37℃消化25～40min;以差速贴壁法和消化排除法纯化细胞,倒置显微镜观察细胞形态,细胞免疫化学方法鉴定细胞来源和纯度。结果与结论:倒置显微镜下原代培养滋养层细胞接种后见大量圆形细胞悬浮存在,1h后可见部分细胞贴壁,24h后70%～80%细胞贴壁,五六天细胞数量明显增多,细胞呈三角形、多边形平铺片状生长,核大卵圆形居中,部分细胞连接成片,部分细胞呈长梭形。七八天长满瓶壁的80%～90%可传代。9～10d铺满培养瓶底部。细胞碎屑不贴壁。传代接种后1.5h贴壁,迅速增长,三四天爬满瓶底,各代细胞形态基本一致。可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长。细胞角蛋白染色阳性,波形蛋白染色阴性细胞达70%～80%。采用低浓度胰酶进行长时间消化分离培养人早孕绒毛滋养层细胞,利用差异贴壁法和消化排除法以及反复换液法进行纯化,可简单、快捷地获得较高纯度的人早孕绒毛滋养层细胞。     

两种方法培养人早孕绒毛滋养层细胞的比较***

背景：人早孕绒毛滋养层细胞体外培养是研究各种妊娠疾病的基础,如何获得纯度高、数量多的滋养层细胞以及如何简化实验步骤,仍是目前研究的热点。 目的：寻求一种培养高纯度人早孕绒毛滋养层细胞方法。 方法：取5~10周正常绒毛组织,胰酶消化和差速贴壁联合应用法与组织块培养法分别进行人早孕绒毛滋养层细胞原代培养,免疫组织化学观察细胞角蛋白7和波形蛋白的表达,进行滋养层细胞纯度的鉴定。 结果与结论：两种方法均能培养出人早孕绒毛滋养层细胞,呈三角形,多边形。抗-细胞角蛋白7阳性表达,抗-波形蛋白阴性表达。胰酶消化和差速贴壁联合应用法培养细胞纯度高于组织块培养法(P < 0.05)。提示胰酶消化和差速贴壁联合应用法是一种培养人早孕绒毛滋养层细胞较好的方法。      

DC-SIGNR在人胎盘滋养层细胞中的表达及意义

目的:探讨DC-SIGNR在人胎盘绒毛组织中的定位及在体外培养滋养层细胞上的表达.方法:建立稳定的滋养层细胞原代培养体系,采用免疫组化单染及荧光双染的方法检测不同孕期正常胎盘绒毛组织及体外培养滋养层细胞上DC-SIGNR的表达.结果:DC-SIGNR主要表达于胎盘滋养层细胞、Hofbauer细胞及胎盘微血管内皮细胞的胞质及包膜,在原代培养的人绒毛膜滋养层细胞中的DC-SIGNR的表达与在体组织表达一致.结论:DC-SIGNR表达于不同孕期的胎盘组织及体外分离培养滋养层细胞,为研究滋养层细胞上该受体在宫内感染中的作用提供体外实验的细胞学基础.     

低分子量肝素对滋养层细胞MMP-2、TIMP-2表达及侵袭力的影响

目的:探讨低分子量肝素对体外培养人早孕绒毛滋养层细胞MMP-2、TIMP-2表达及侵袭力的影响。方法:将经胰蛋白酶/DNA酶Ⅰ联合消化,通过Percoll细胞分离液纯化得到的绒毛滋养层细胞进行体外培养。采用不同浓度低分子量肝素干预培养24h后,ELISA法测定细胞上清液中MMP-2、TIMP-2的浓度;采用Tr-answell小室观察滋养层细胞的侵袭能力。结果:不同浓度的低分子量肝素(1.0×102IU/L,1.0×103IU/L,1.0×104IU/L)干预人早孕绒毛滋养层细胞后,与对照组相比,MMP-2的表达上调,滋养层细胞侵袭力增强,在1.0×103IU/L时MMP-2表达最高,滋养层细胞侵袭力最强(P0.05)。TIMP-2的表达随着低分子量肝素浓度的增加而逐渐下降,与对照组比较,在1.0×103IU/L、1.0×104IU/L组明显降低(P0.05),但1.0×103IU/L组与1.0×104IU/L组之间TIMP-2的表达无差异(P0.05)。结论:低分子量肝素可能直接通过影响绒毛滋养层细胞MMP-2、TIMP-2的表达进而影响绒毛滋养层细胞的侵袭能力。     

胚胎停育绒毛染色体培养与分析

目的探讨胚胎停育绒毛染色体分析在诊断流产病因的作用,以及原位培养法在实际工作中的可行性推广应用。方法对53例自然流产患者取无菌绒毛进行细胞培养和染色体制备及核型分析。结果 53例流产绒毛中培养成功51例(96.2%)。51例染色体中异常31例(60.8%),异常核型以数目异常为主,并以三体征最常见。结论胚胎染色体异常是导致早期自然流产的重要原因,流产绒毛染色体检查有利于查明本次流产的原因,并对下次妊娠有较好的指导意义,原位培养法在实际工作中可推广应用。     

分散人绒毛膜滋养层细胞及细胞培养

目的获取人绒毛膜滋养层细胞.方法应用胰酶/DNA酶法进行消化后进行培养.经光镜和电镜观察.结果我们获取了人绒毛滋养层细胞并成功培养.结论取人妊娠45～55D刮宫术后的绒毛组织,经胰酶、DNA酶消化可得绒毛滋养层细胞.     

孕早期流产60例绒毛染色体核型和病原体检测分析

目的了解绒毛染色体核型及解脲支原体(UU)、沙眼衣原体(CT)感染与自然流产的关系.方法取60例孕早期自然流产者的绒毛与同期人工流产者作对照,进行UU、CT、DNA检测和绒毛染色体核型分析.结果实验组病原体总感染率40.00%,绒毛染色体核型异常10例,对照组分别为11.67%和0例.两组间的差异均有非常显著性意义(P<0.005).实验组内正常核型与异常核型在病原体感染人数间无显著性差异(P>0.05).第1次与第2次自然流产在病原体感染和核型异常方面也无显著性差异(P>0.05).结论除绒毛染色体核型异常外,UU和CT感染胚胎也是引起自然流产的重要原因,但两种原因之间无明显因果关系.绒毛染色体核型异常及UU、CT感染可发生在任何一次妊娠时.     

451例孕早期绒毛染色体结果分析

目的评价绒毛细胞染色体核型分析在孕早期产前诊断中的应用价值。方法对有产前诊断指征的孕妇在B超引导下经腹绒毛穿刺取绒毛组织行细胞培养、染色体制备及核型分析。结果成功培养绒毛细胞451例,培养成功率为97.41%,共发现胎儿染色体核型异常136例,异常检出率为30.16%。136例异常核型中染色体数目异常79例（58.09%）,其中包括常染色体三体型55例,性染色体数目异常23例,三倍体1例。检出染色体结构异常11例,嵌合体16例,染色体多态性30例。超声筛查胎儿异常及夫妇染色体结构异常携带这两个指征检出胎儿染色体异常率最高。结论孕早期绒毛细胞染色体检查结合孕早期超声筛查及血清学筛查能及早发现胎儿染色体异常并早期干预,对于减少染色体畸形儿的出生具有重要的意义。     

改良的直接法和培养法制备绒毛膜细胞染色体

直接法制备绒毛膜细胞染色体与培养法相比,具有快速诊断、简单、母体细胞污染少等优点。然而,直接法的不足之处是分裂相少,染色体形态不佳,所以许多实验室仍用培养法作为常用的检查方法。本文介绍一种直接法,能够制备分裂相较多、染色体形态好的显带中期分裂相。同时,进一步改良培养法,缩短培养时间,一般在培养后3～4天就能收获细胞制备染色体。     

824例胚胎停育绒毛染色体核型分析结果探讨

目的分析早期胚胎停育绒毛组织的染色体核型,探讨胚胎停育与绒毛染色体核型异常的关系。方法对824例早期胚胎停育的胎儿绒毛组织进行细胞培养,对培养成功的绒毛细胞进行G显带及核型分析。结果 824例胚胎停育的绒毛组织中细胞培养成功811例(98.4%),失败13例。其中,检出染色体异常458例(55.6%),数目异常438例(95.6%),结构异常20例(4.4%)。结论胚胎染色体异常是早期胚胎停育的主要原因,绒毛细胞的染色体检查有利于查明流产原因以及为优生指导提供重要的依据。     

肿瘤细胞株的自发的及射线引起的不正常分裂

利用培养的人肿瘤细胞株(自骨软骨肉瘤分离的515纯株),在装有小片的卡氏瓶内进行连续培养。培养24小时后,细胞经Co~(60)照射或与放射性同位素P~(32)接触处理后的细胞继续进行培养。不经处理的细胞作为对照。每天各取一瓶细胞,用Carnoy固定液固定,Feulgen染色,连续七至九天。在染色片中计算分裂指数、正常分裂与不正常分裂百分数。从五批不经处理的培养细胞得出其逐日分裂指数平均在1.5％至2.5％之间。在逐日取片的标本中,都出现有各种类型的不正常分裂,如中期有落后染色体、后期有落后染色体、后期桥、不均等分等、多极、多极有落后染色体染色体断裂以及染色体粘连等。不正常分裂百分数随着培养时间增长而增多,主要表现在中期有落后染色体的不正常分裂相增多。培养细胞经1000伦琴Co~(60)照射或5微居里P~(32)接触后,细胞分裂暂时受到抑制后分裂指数增高并超过对照组,然后又下降,但P~(32)接触后继续培养的细胞,其分裂指数曲綫波动情况没有Co~(60)照射后明显。Co~(60)照射后的不正常分裂主要为染色体断裂,而P~(32)接触后所出现的大多为染色体粘连成块。在正常连续培养与用不同射綫影响下都出现较多的不正常分裂,但表现形式各有不同。影响不正常分裂的原因曾加以讨论。     

四倍体滋养层干细胞的分离培养与鉴定

目的建立可在体外培养的小鼠四倍体滋养层干细胞(TTSCs)系,为研究胎盘发育提供新的细胞模型。方法用电融合的方法获得四倍体胚胎并进行体外培养,挑取克隆并传代后获得细胞系。通过中期染色体计数检测染色体数目; RT-qPCR、Western blot、免疫荧光检测标志基因表达;显微注射检测细胞的体内发育潜能。结果建立了可以传代培养并且可在体内发育的TTSCs。分化条件下,TTSCs分化基因的表达量与二倍体滋养层干细胞(TSCs)存在差异(P0.001)。结论可传代的TTSCs系可以在体外建立,但其维持自我更新及分化的机制与二倍体TSCs有所不同。     

佳木斯地区125例胚胎停育患者绒毛细胞染色体分析

目的探讨胚胎停育与绒毛细胞染色体异常的关系。方法收集佳木斯地区125例胚胎停育患者的绒毛细胞,通过对绒毛细胞染色体的培养和制备,对其染色体进行观察和分析。结果 125例胚胎停育患者,绒毛细胞培养失败7例,检出异常核型49例,染色体数目异常47例,染色体结构异常2例。结论胚胎染色体异常是胚胎停育的重要原因。     

印迹基因p57~(kip2)蛋白在水泡状胎块诊断和分型中作用

目的 探讨p57kip2蛋白表达在水泡状胎块诊断和分型中的作用和意义.方法 应用免疫组化SP法检测p57kip2蛋白30例在完全性水泡状胎块(complete hydatidiform moles,CHMs)、25例部分性水泡状胎块(partial hydatidiform mole,PHMs)和20例水泡状流产(hydropic abortions,HAs)三组病变中的表达情况,正常成熟胎盘(normal mature placentas,NMPs)为正常对照.结果 p57kip2蛋白在10例NMPs、20例HAs组织中的细胞滋养层细胞、绒毛间质细胞和绒毛外滋养细胞团核表达阳性,合体滋养层细胞不表达;CHMs的绒毛间质细胞和细胞滋养层细胞p57kip2蛋白不表达,阳性表达仅见于绒毛外散在滋养细胞团中;25例CHMs的绒毛间质细胞和细胞滋养层细胞p57kip2均表达阳性.结论 p57kip2蛋白在CHMs和PHMs的表达和分布有明显差异,可作为胎块分型诊断的客观辅助指标,值得在国内妇产科病理诊断常规工作中推广应用.     

105例胚胎停育绒毛细胞遗传学分析

目的探寻胚胎停育与绒毛细胞染色体异常的关系。方法收集2012年2014年2月佳木斯医学院105例胚胎停育患者,对其绒毛细胞进行培养和染色体核型分析。结果 105例胚胎停育患者,绒毛细胞培养失败6例,检出异常核型43例,染色体数目异常39例,染色体结构异常4例。结论胚胎绒毛细胞染色体异常是导致胚胎停育的重要原因。