抗HTNV mAb 3G1单链抗体基因转化植物的研究

目的 构建抗HTNV mAb 3G1 scFv的转基因拟南芥植株.方法 从含有3G1 scFv基因的重组质粒中酶切获得含有该目的基因的表达框,将其克隆入载体pCAMBIA2301,构建植物表达载体3G1scFv-pCAMBIA2301.通过农杆菌介导的花粉管法将其转入拟南芥,PCR和Southern blotting检测是否获得转基因植株.组织化学染色检测标记基因GUS是否表达.结果 限制性内切酶酶切鉴定结果证明3G1 scFv基因被成功克隆入植物表达载体pCAMBIA2301,构建获得3G1scFv-pCAMBIA2301重组质粒.PCR和Southern blotting检测证明获得抗HTNV mAb 3G1 scFv的转基因拟南芥植株.组织化学染色结果表明,标记基因亦高效表达.结论 成功地将外源基因转入拟南芥中并表达,为进一步研究利用植物表达医用抗体奠定了基础.     

重组人β-防御素-2基因的植物表达载体的建立

目的许多证据表明利用转基因植物作为生物反应器规模化生产高附加值的药用重组蛋白质,其技术可行、成本低廉、效益显著,具有广阔的应用开发前景.本研究拟运用植物转基因技术,尝试构建高效表达hBD-2的植物生物反应器的可能性.方法将C端带Myc和6xHis双标记的hBD-2的重组DNA克隆到植物真核表达载体pCAMBLA1303中,构建C端带Myc和6xHis双标签的hBD-2的重组植物真核表达载体;并将此载体转化根癌农杆菌LBA4404,利用卡那霉素进行抗性基因筛选,确定根癌农杆菌的阳性克隆;通过根癌农杆菌将外源基因转入马铃薯植物愈伤组织细胞,利用潮霉素抗性基因筛选及PCR检测,监测hBD-2在其中的遗传表达.结果(1)酶切分析、PCR验证和DNA测序等证据表明,C端6个组氨酸的hBD-2已被正确地插入pCAMBIA1304载体中CaMV35S和Nos终止子之间,成功构建了重组hBD-2/His基因的植物表达载体rpCAMBIA1304/hBD-2/His.(2)rpCAMBIA1304/hBD-2/His已成功地转化根癌农杆菌LBA4404,阳性克隆菌株已获得.(3)潮霉素抗性进行筛选及PCR检测结果提示hBD-2cDNA基因已整合到马铃薯植物愈伤组织的基因组中.结论结果表明,重组hBD-2/His基因的植物表达载体通过根癌农杆菌介导进入了马铃薯细胞植物愈伤组织.利用植物转基因技术,构建高效表达hBD-2的植物生物反应器具有可能性.     

昆虫抗冻蛋白MpAFP149抗血清的制备及转基因烟草免疫定位的检测

目的:制备昆虫抗冻蛋白MpAFP149特异性抗血清,以便从细胞水平阐明昆虫抗冻蛋白在转基因烟草中的功能基础。方法:将具有完整读码框的MpAFP149基因连接到真核表达载体pcDNA3上,用做DNA免疫质粒。另外,将编码成熟肽的抗冻蛋白基因片段MpsAFP149插入原核表达载体pGEX-4T-1中,形成的重组质粒pGEX-4T-1-MpsAFP149转化大肠杆菌BL21(DE3),获得融合蛋白GST-sAFP149,用于蛋白免疫。采用"DNA初免-蛋白质加强"的策略免疫小鼠,制备抗血清,Western blot检测抗血清的特异性。制备野生型和转有MpAFP149转基因烟草叶片的超薄切片,利用免疫胶体金技术检测异源抗冻蛋白的表达及亚细胞水平的表达定位。结果:构建了昆虫抗冻蛋白基因MpAFP149的原核和真核表达载体;获得了预期的相对分子质量(Mr)约为36 000的融合蛋白。Western blot和转基因烟草的免疫定位结果表明此免疫策略可使小鼠产生特异性的昆虫抗冻蛋白抗血清。抗冻蛋白MpAFP149在转基因烟草中得到了表达并主要分布植物细胞质外体中的细胞壁上。结论:含有抗冻蛋白基因MpAFP149的真核表达质粒pcDNA3-MpAFP149和融合蛋白GST-sAFP149,通过"DNA初免-蛋白质加强"的免疫策略,可使小鼠产生专一性的抗血清。该抗血清可有效地用于抗冻蛋白基因MpAFP149转基因烟草的免疫定位研究。     

人源轮状病毒vp7基因的克隆与转基因植物研究

目的：克隆人源轮状病毒外壳蛋白vp7基因，以制备转基因植物疫苗。方法：用RT-PCR方法制备vp7基因，以植物高效表达质粒PBI121为载体，构建重组DNA质粒。重组体用载体上的通用引物为测序引物，鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用农杆菌介导法转染马铃薯外植体，分别用PCR、Western blot法鉴定阳性转化植株中vp7基因的表达。结果：成功地将vp7转入马铃薯植株中，并且在转化植株中检测出了vp7的表达。结论：成功地构建了重组PBI121/hvp7质粒，获得表达外源基因vp7的转基因马铃薯。     

大肠杆菌不耐热肠毒素LT基因双价植物表达载体的构建

目的：构建可高效表达不耐热肠毒素LT的双价植物表达载体。方法：采用PCR的方法从强致病菌株中K88ac中,分别克隆了LTA和LTB基因,将LTA和LTB基因同时连接到植物表达载体pBI121上。结果：成功构建了带有内质网滞留信号RDEL/KDEL的不耐热肠毒素A、B亚单位基因双价植物表达载体pCAMBIA2300-LTA-LTB。结论：构建的双价植物表达载体pCAMBIA2300-LTA-LTB,为研究LT全毒素在植物中的正确组装及进一步构建带有保护性抗原类全毒素嵌合植物疫苗奠定基础。     

人干扰素基因植物表达载体的构建及其在人参愈伤组织细胞中的表达

目的：利用组织培养人参愈伤组织细胞表达人干扰素，探讨用植物细胞表达人类基因的可行性。方法：用PCR从pBV889扩增人干扰素α2b（hIFN-α2b）编码基因，将其克隆于pMD18-T载体和pBI121，进而构建植物细胞表达载体pBIFN。用冻融法将pBIFN导入根瘤农杆菌LBA4404，经卡那霉素和利福霉素筛选后利用农杆菌介导的转化法将hIFN-α2b基因导入人参愈伤组织细胞。经G418筛选，形成阳性细胞。用PCR、RT—PCR、Western blot和WISH／VSV系统检测转基因组织。结果：经PCR检测表明hIFN-α2b基因已成功整合到人参愈伤组织细胞基因组中。RT-PCR证明存在hIFN-α2b基因的转录产物。Western blot分析表明转基因人参愈伤组织细胞能有效表达hIFN-α2b蛋白。WISH／VSV系统检测分析表明表达的hIFN-α2b具有生物学活性。结论：本研究利用转基因人参愈伤组织细胞成功地表达了人干扰素，为进一步提高口服干扰素的疗效打下基础。     

HCMV pp150抗原基因在蚕豆中的遗传转化及鉴定

目的研制人巨细胞病毒（HCMV）口服疫苗。方法根据HCMV基质磷蛋白PP150基因序列设计引物，PCR法从HCMV AD169株基因组DNA中扩增出编码PP150抗原决定簇区域的基因片段。将Kozak序列插入pp150基因的起始密码子的上游，3＇端引入了内质网滞留信号KDEL序列，将修饰后的基因片段克隆进载体pBI121，构建了带潮霉素（Hyg）选择抗性基因的植物表达载体pCAMBIA1300／pp150和根癌农杆菌工程菌EHA105；采用叶盘法转化蚕豆，获得了5株抗性植株，通过PCR、Southern blot和RNA dot blot分析鉴定，确认了3株为转基因植株。通过ELISA和Western blot对这3株的蛋白萃取物进行分析，以鉴定其免疫学活性。结果这3株转基因植株表达的PP150蛋白具有免疫原活性。结论这些转基因植株为HCMV口服疫苗的研究提供了条件。     

A组轮状病毒结构蛋白基因在马铃薯细胞中的初步表达

目的 在马铃薯细胞中表达轮状病毒结构蛋白。方法采用RT-PCR扩增截短VP4蛋白基因，克隆于植物表达载体paBI221，再双酶切pBI221，将带有CaMV35S启动子、外源基因及终止子的片段转入pSB11，通过三亲杂交方法，制备农杆菌转化载体pSB111-VP4，并对pSB111-VP4作点杂交检测，筛选鉴定重组子，对马铃薯组织细胞进行转化。结果转化细胞经Western印迹检测其免疫活性，具有良好的抗原性。结论为研制轮状病毒重组疫苗、亚单组疫苗、转基因植物口服疫苗做了前期准备。     

转人溶菌酶基因小鼠乳腺生物反应器的建立

目的 研究人溶菌酶（human lysozyme，hLYZ）动物乳腺生物反应器制备的可行性。方法 将hLYZ基因与动物乳腺特异表达载体p205C3连接，所得重组载体p205C3-hLYZ用显微注射法建立转基因小鼠。结果 共出生了136只F0代小鼠，PER和Southern杂交检测基因整合阳性率分别为5．15％（2♀5♂）和2．94％（1♀3♂）。Western印迹检测结果表明，分泌在小鼠乳汁中的表达产物与正常hLYZ具有相同的分子量。目前转基因小鼠已经繁殖到B代，每一代基因整合阳性母鼠的乳腺均表达hLYZ，乳汁中的表达量最高达750mg/L。斑点杂交试验证明，表达有较强的组织特异性，除在乳腺表达外，仅在脾脏和小肠有一定的异位表达。结论 成功建立了hLYZ小鼠乳腺生物反应器。     

鼠源轮状病毒vp7基因的表达载体构建及转基因植物的研究

目的：构建表达鼠源轮状病毒抗原基因vp7的植物表达载体及植物转化研究。方法：抗原基因vp7经PCR扩增后直接克隆到PUC－T载体，双酶切目的片断和植物表达载体，以T4连接酶将目的片断与载体相连接，电转化方式将重组质粒转入农杆菌。结果：以重组农杆菌为介导将靶基因转入到马铃薯外植体。成功地将目的基因定向克隆到表达载体，并转入到农杆菌中；以农杆菌为介导获得抗性转基因马铃薯植株。结论：通过PCR检测，初步确定轮状病毒外壳蛋白基因vp7已成功地整合到马铃薯植株中。     

A modified viral satellite DNA-based gene silencing vector is effective in association with heterologous begomoviruses

We have previously reported effective gene silencing of a transgene and endogenous plant genes in tobacco and tomato plants using a modified viral satellite DNA associated with Tomato yellow leaf curl China virus (TYLCCNV). In this study, we constructed a similar gene silencing vector (DNADeltaC12beta) based on the satellite DNAbeta associated with Tobacco curly shoot virus (TbCSV) by replacing its betaC1 gene with a multiple cloning site. Strong and stable silencing of cognate genes was achieved when this vector, carrying a fragment of the green fluorescent protein (GFP) transgene or a sulfur (Su) endogenous gene encoding one unit of the chloroplast enzyme magnesium chelatase required for chlorophyll II production, was co-agroinoculated with TbCSV used as a helper virus. GFP silenced transgenic Nicotiana benthamiana plants appear red under UV illumination due to loss of green fluorescence, while the Su silenced plants appear white as a result of failure to synthesize chlorophyll. Our results show that the efficiency of Su silencing is independent of the insert orientation in both N. benthamiana and N. glutinosa plants. Most significant however, is the observation that in association with heterologous begomoviruses, such as TYLCCNV or Malvastrum yellow vein virus, the DNADeltaC12beta vector could still effectively induce transgene and endogenous gene silencing in tobacco plants. These observations suggest that the modified viral satellite DNA vector can be applied as a reverse genetics tool for the study, analysis and discovery of gene function in more plants.     

酸性成纤维细胞因子基因体外转染肌卫星细胞

背景：研究报道外源性酸性成纤维细胞生长因子既可调节肌卫星细胞增殖和分化,又具有预防运动终板退变及肌萎缩的作用。 目的：通过酸性成纤维细胞因子基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞,检测目的基因转染肌卫星细胞效果及基因表达情况,探讨建立有效预防运动终板退变及肌萎缩种子细胞可行性。 方法：取Wistar成年大鼠后肢肌肉,差速贴壁培养法分离纯化肌卫星细胞,观察细胞生长特性并做免疫组织化学鉴定;取第2代细胞,LipofectamineTM2000 Reagent转染试剂介导,将重组真核表达质粒pEGFP-N1-aFGF转染肌卫星细胞为实验组;阴性对照组转染空载质粒pEGFP-N1;空白对照组仅加入转染试剂。转染后24-72 h和传代后分别用倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达情况,计算转染效率。转染细胞行Western Blot检测酸性成纤维细胞因子表达。提取转染后72 h 细胞总RNA, 实时荧光定量PCR检测酸性成纤维细胞因子基因mRNA表达。 结果与结论：分离纯化细胞经免疫组织化学鉴定为肌卫星细胞。荧光显微镜观察到细胞转染6 h后即有绿色荧光发出,荧光强度和表达细胞总数在72 h达到高峰,传代后仍可观察到绿色荧光蛋白表达。实时荧光定量PCR证实目的基因mRNA表达水平远远高于对照组,Western Blot检测实验组有大量酸性成纤维细胞因子产生。提示酸性成纤维细胞基因转染肌卫星细胞可表达基因产物,有望作为基因工程种子细胞预防失神经支配后运动终板退变及肌萎缩。     

重组人aFGF的克隆、表达及活性测定

目的：为了研究酸性成纤维细胞生长因子（aFGF)的临床应用价值,将其开发为多肽类药物。方法：以RT－PCR从人肺成纤维细胞钓取人aFGF全编码区cDNA,使用Pichia分泌型酵母表达系统表达重组人aFGF,重组蛋白经肝素亲和层析纯化后,以NIH3T3成纤维细胞增殖实验、鸡胚尿囊膜法血管生成实验及小鼠创伤愈合实验检测活性。结果：重组人aFGF蛋白在酵母系统中得到较高量表达（12mg/L,并能够促进NIH3T3增殖、促进血管增生、促进伤口愈合,而且这种活性能被受体（FG－FR）的细胞外段拮抗。结论：重组人aFGF在酵母系统中实现高效表达,并具有很好的生物学活性。