急性排斥反应移植肾组织转录因子活性变化

目的筛选与肾移植急性排斥反应相关的转录因子。方法应用转录因子芯片技术,在功能水平分析3份肾移植急性排斥反应患者病理组织与3份正常组织中细胞核内转录因子活性的差异,并作电泳迁移率变动分析验证芯片检测结果。结果与正常组织相比,在急性排斥反应移植肾病理组织标本中,从345个候选的转录因子中筛选出99个有活性差异的转录因子,其中活性上调的转录因子有95个,活性下调的转录因子有4个。电泳迁移率变动分析显示AP-1、Pbx1和MEF-2活性上调,与芯片分析结果一致。结论转录因子活性异常与肾移植急性排斥反应有关,这些异常可能有助于揭示肾移植急性排斥反应的分子生物学机制和预测指标及干预治疗的靶点。     

转录因子激活蛋白-4在结直肠癌中的表达及与细胞凋亡的相关性

目的 观察转录因子激活蛋白(AP)-4在正常直肠、腺瘤和结直肠癌组织中的表达,探讨其表达与临床病理、转移相关基因血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶(MMP)-9的表达、细胞凋亡间的关系.方法 利用组织芯片和免疫组织化学技术,检测正常直肠、腺瘤组织标本各16例及结直肠癌80例中AP-4蛋白的表达,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组VEGF、MMP-9 mRNA的转录水平,以缺口末端标记技术(TUNEL)检测结直肠癌细胞的凋亡指数.结果 (1)正常直肠组织、直肠良性腺瘤、结直肠癌组织AP-4的阳性表达率分别为12.50%(2/16),25.00%(4/16),56.25%(45/80),其中良性直肠组织18.75%(6/32),良性直肠组织AP-4的阳性表达率与结直肠癌组织比较,两者差异有显著的统计学意义(x2=12.96,P<0.01);结直肠癌患者不同年龄、性别、肿瘤部位、大小、血清CEA水平、组织学类型的AP-4表达程度比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同分化程度、病理分期、淋巴转移、5年生存率的AP-4表达程度比较,差异有统计学意义(P<0.05);(2)结直肠癌组织VEGF和MMP-9转录水平显著高于正常直肠组织和腺瘤(P<0.05),结直肠癌组织AP-4结合活性增强与VEGF和MMP-9高表达显著相关(P<0.01);(3)结直肠癌AP-4基因表达程度不同的结直肠癌细胞凋亡指数(AI)间的差异有统计学意义(F=58.76,P<0.01).结论 AP-4基因表达升高可能与结直肠癌的发生密切相关,AP-4可能参与了结直肠癌的发生、发展和侵袭转移.     

Hint1基因抑制HepG2细胞AP-1转录因子活性的实验研究

目的 探索体外过表达Hint1基因对人肝肿瘤HepG2细胞AP-1转录因子活性的影响.方法 分子克隆获得Hint1基因序列,构建pHA-Hint1重组融合基因表达载体.阳离子脂质体介导,pHA-Hint1转导人肝母细胞瘤HepG2细胞,RT-PCR和Western blot检测HepG2细胞中外源HA-Hint1表达.pHA-Hint1质粒、启动子荧光素酶报告质粒AP-1/Luc及巨细胞病毒-β-半乳糖酶报告质粒(β-gel)共转导HepG2细胞.36 h后测定荧光素酶活性及β-gel活性.结果 重组质粒经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,获约100 bp特异条带,测序证实成功构建pHA-Hint1表达载体.pHA-Hint1及空载体pcDNA3/HA转导HepG2细胞,半定量RT-PCR结果显示pHA-Hint1组Hint1mRNA表达高于空载体组(t=3.89,P<0.05);Western blot结果显示pHA-Hint1组HA标签蛋白表达高于空载体组(t=3.12,P<0.05).AP-1转录因子活性检测结果:pHA-Hint1终浓度为0 μg/ml,0.5 μg/ml,1.0 μg/ml,1.5 μg/ml,2.0 μg/ml时,AP-1转录因子相对活性(106)为:5.12±0025、4.24±0.74、3.43±0.31、2.62±0.48、2.09±0.21.随着pHA-Hint1浓度增加,荧光素酶活性呈明显下降,当pHA-Hint1浓度达到1.5 μg及2.0 μg时,差异有统计学意义(F=72.009,P<0.05).结论 过表达Hint1基因可抑制HepG2细胞AP-1转录因子活性.     

创伤后IL-2表达受抑与核转录NFAT和AP-1变化的关系

目的探讨创伤后脾细胞活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)和激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)的DNA结合活性、部分家族成员c-Fos,c-Jun,JunB蛋白的表达和白细胞介素2(IL-2)表达的动态变化及它们间的关系.方法采用小鼠双后肢闭合性砸伤+骨折模型,于创伤后6、12h,1、4、7、10、14d处死动物,分离脾细胞,经ConA刺激细胞后收集培养上清以测定IL-2活性;提取脾细胞RNA以测定IL-2 mRNA;提取脾细胞核蛋白,用电泳迁移率改变试验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测NFAT、AP-1的DNA结合活性,用免疫蛋白印迹法(Western blot assay)检测c-Fos,c-Jun,JunB蛋白的表达.结果和正常对照组相比,创伤后IL-2活性均有不同程度的降低,其受抑的程度在创伤后4d更为明显.创伤后脾细胞NFAT和AP-1的DNA结合活性亦逐渐下降,至伤后4d时下降最明显,为正常对照组的41%和49%.这与创伤后脾细胞IL-2的活性和IL-2 mRNA的降低相一致.c-Fos蛋白水平在伤后1、4d明显降低;c-Fos蛋白表达无明显变化;JunB蛋白水平仅在伤后1d明显表达.结论上述结果提示,创伤后脾细胞IL-2表达受抑至少部分是由于核转录因子NFAT和AP-1的DNA结合活性降低所导致;而NFAT和AP-1的DNA结合活性降低可能部分由于创伤影响c-Fos蛋白的生成所致.     

流动激活血管内皮细胞中转录因子核因子-кB和激活蛋白-1的表达

目的比较血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)在不同流场中转录因子核因子-кB(nuclear factor-кB,NF-кB)和激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)的表达规律,为力学信号对基因调控模式的影响提供依据。方法将培养的人脐静脉ECs加载于层流和湍流的离体流室模型中,以作用时程的不同分为6个时间点(0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h和5 h),运用共聚焦显微镜,从蛋白水平观察ECs中NF-кB和AP-1在不同流室中表达的时间规律和空间规律。结果层流中NF-кB的表达高峰出现在1 h段(26.49±1.63,P<0.05),随后转行向下;湍流中NF-кB表达在3 h段升至峰值(34.41±6.43,P<0.05);层流中c-Jun/AP-1表达一过性增高,0.5 h到达峰值(18.95±5.38,P<0.05),随即下降至基线水平;湍流中c-Jun/AP-1表达呈持续缓慢上升趋势(P<0.05)。结论湍流流场对血管ECs中NF-кB和AP-1表达的影响不同于层流,湍流对NF-кB和AP-1的持续激活上调作用可能引起了ECs形态结构和功能行为的病理学改变。     

豚鼠哮喘模型单个核细胞及嗜酸细胞与肺微血管内皮细胞粘附性的研究

目的观察哮喘豚鼠模型嗜酸细胞和淋巴细胞与肺微血管内皮细胞的粘附率,探讨肺微血管内皮细胞在哮喘模型发病中的功能变化及炎症细胞与其粘附的分子基础.方法复制豚鼠哮喘模型;分离、培养和鉴定肺微血管内皮细胞;转染核因子(NF)-κB反义寡核苷酸;分别用对照组血清和模型组血清孵育;分离外周血淋巴细胞和嗜酸细胞;采用RT-PCR法测定内皮细胞和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)及嗜酸细胞趋化因子(eotaxin)mRNA的表达强度,EMSA法测定内皮细胞NF-κB、活化蛋白(AP-1)的DNA结合活性.结果(1)肺微血管内皮细胞在模型组血清刺激下,与两组外周血淋巴细胞及仅与模型组嗜酸细胞的粘附率显著升高,内皮细胞与嗜酸细胞两者的激活,在嗜酸细胞粘附中起明显的协同作用;(2)肺微血管内皮细胞经模型组血清刺激后,VCAM-1和eotaxin mRNA表达量显著增多,NF-κB、AP-1的DNA结合活性也显著升高.结论肺微血管内皮细胞可被哮喘模型血清激活,使粘附分子、趋化因子及核转录因子的合成和分泌增多,从而显著提高其与炎症细胞的粘附率,核转录因子NF-κB和AP-1对内皮细胞合成炎症因子可能起调控作用.淋巴细胞与嗜酸细胞的粘附机制不尽相同.     

mitofusin-2对乳腺癌细胞RECK基因表达及MMPs活性的影响

目的 探讨线粒体融合素基因-2(mitofusin-2)对乳腺癌MCF-7细胞株中RECK表达及MMP-9,MMP-2活性的影响.方法 利用脂质体lipofectamine2000将构建的重组真核表达质粒pEGFPmfn2转染MCF-7细胞.RT-PCR检测细胞mfn2和RECK基因mRNA的转录水平;Weastem Blot法检测mfn2及RECK蛋白的表达;明胶酶谱试验检测转染前后MMP-9及MMP-2的活性.结果 转染pEGFP-mfn2质粒的MCF-7细胞可以稳定高表达Mfn2;RECK基因在转染空质粒组和未转染组细胞中无表达;转染mfn2基因后RECK基因mRNA转录及蛋白的表达显著升高,且MMP-9及MMP-2的活性显著降-低(P＜0.05).结论 mfn2基因可激活MCF-7细胞中RECK基因的表达,并显著抑制其MMP-9及MMP2的活性.该途径可能是mfn2基因抗肿瘤作用的新机制.     

转录因子NF-E2相关因子2-氧化反应元件通路在抗心肌再灌注损伤中的作用

背景 转录因子NF-E2相关因子2(Nf-E2 related factor-2,Nrf2)抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)通路广泛分布于机体心血管系统中,激活后可上调内源性抗氧化系统减轻心肌的氧化损伤. 目的 阐述Nrf2-ARE通路作为抗心肌缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/RI)的潜在靶点,并探讨其可能的保护机制.内容 Nrf2-ARE通路处于氧化应激、炎症反应的中心地位,介导编码抗氧化蛋白和二项解毒酶基因的基础表达和诱导表达;多种外源性化合物可以激活Nrf2-ARE通路,在转录水平上调节抗氧化蛋白及二项解毒酶基因的表达,增强内源性抗氧化系统的能力从而在减少氧自由基产生、抗炎症反应、减轻钙超载、抗心肌细胞凋亡等方面减轻心肌I/RI.趋向 激活Nrf2-A RE通路可为临床抗I/RI提供新的策略.     

白细胞介素-1β激活核转录因子-kB介导A549细胞分泌白细胞介素-8的研究

目的研究白细胞介索-1β（IL-1β）对肺Ⅱ型上皮A549细胞分泌白细胞介素-8（IL-8）的诱导作用，探讨相关的细胞内信号通道的激活和传导的机理。方法以1ng／ml终浓度的IL-1β干预经核转录因子-KB（NF-KB）的IKK2复合物抑制物（AS602868）预处理的A549细胞，Western blot检测IL-1β干预后细胞内磷酸化IKBa（p-IKBu）和IkBα蛋白的表达水平；激光扫描共焦显微镜（LSCM）检测NF-KB的p65和p50蛋白的核转移过程；ELISA检测NF-KB的p65和p50蛋白与DNA结合活性及IL-8蛋白的释放。结果IL-1β干预后细胞内p-IKBa蛋白明显升高，IKBd蛋白明显下降；LSCM扫描显示p65和p50蛋白从胞浆向胞核转移，同时p65和p50与DNA结合活性明显升高（P〈0．01）；IL-8的蛋白表达水平明显升高（P〈0．01）。细胞经AS602868的预处理，阻断了细胞内p-IxBa蛋白升高和IkBa蛋白降解；减少了p65和p50蛋白的核转移和与DNA结合活性（P〈0．01）；降低了IL-8蛋白的表达水平（P〈O．01）。结论IL-1β通过激活NF-KB介导了A549细胞分泌IL-8，结果提示可能通过抑制NF-kB信号通道的方法，减轻呼吸机相关肺损伤（VALI）的生物性损伤。     

激活态雪旺细胞生长相关蛋白43 mRNA表达的研究

目的分析激活态雪旺细胞较正常雪旺细胞生长相关蛋白43(growthassociatiopnrotein43,GAP43)的基因表达变化。方法选取10只SD大鼠,将大鼠右上肢正中神经在腋部切断,预变性,1周后取1cm长正中神经采用双酶消化法获取雪旺细胞并进行激活得到激活态雪旺细胞;取左上肢正常正中神经经双酶消化法获取正常态雪旺细胞作为对照。自雪旺细胞提取mRNA,应用rt-PCR的方法扩增GAP43基因,取PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳,用低浓度的绿色荧光核酸胶染剂染色,测量荧光强度,计算目标基因和内标基因(GAPDH)PCR产物的荧光强度比值,以配对t检验比较实验组和对照组结果。结果激活态雪旺细胞GAP43PCR产物荧光强度比值较正常雪旺细胞明显增高,差异有统计学意义(P=0.003)。表明激活态雪旺细胞较对照组正常雪旺细胞GAP43mRNA表达明显增多。结论激活态雪旺细胞GAP43的基因表达较正常雪旺细胞增强,这可能是其促进神经再生的重要机制。     

激活态雪旺细胞信号转导通路的初步研究

目的培养、鉴定激活态的雪旺细胞，探索激活态雪旺细胞信号转导通路。方法用改良成年sD大鼠雪旺细胞培养法激活态的雪旺细胞，S-100染色鉴定，Western Blot法测定ERK1／2水平，初步探索激活态雪旺细胞的信号转导通路。结果光镜下激活态雪旺细胞和正常态的雪旺细胞形态上无差异，S-100染色均为阳性，Western Blot法检测细胞内的ERK1／2水平无明显的差异，但P-ERK1／2水平两者差异有统计学意义（P〈0．01）。这可能是雪旺细胞被激活的一个关键。结论激活态雪旺细胞和正常态雪旺细胞是同一细胞的二种不同存在的状态，有活性的P-ERK1／2水平的升高可能是雪旺细胞激活的关键。对于激活态雪旺细胞完整的信号转导通路尚需要进一步研究。     

激活态雪旺细胞在细胞培养下的生长规律

目的　了解激活态雪旺细胞在细胞培养下的生长规律。方法　应用改良的雪旺细胞培养法体外培养激活态雪旺细胞 ,通过激活态雪旺细胞在各生长点 (3d ,5d,7d ,9d,1 1d ,1 3d)的计数 ,绘制激活态雪旺细胞的生长曲线。作Lowry蛋白测定 ,H3 胸腺嘧啶核甙测定 ,了解激活态雪旺细胞在细胞培养下的生长情况。结果　每个时间段检测激活态雪旺细胞的生长繁殖能力 ,Lowry蛋白含量 ,H3 胸腺嘧啶核甙的含量 ,均数倍于正常态的雪旺细胞 ;两者差异均有非常显著性意义 (t =2 2 3、67 1、72 4,P <0 .0 0 1 )。结论　激活态雪旺细胞在细胞培养下具有旺盛的生长繁殖能力     

激活态雪旺细胞恶性潜能的实验研究

目的 探索来源于成年大鼠周围神经体外培养的激活态雪旺细胞是否具有恶性潜能.方法 从成年大鼠坐骨神经中分离、体外培养激活态雪旺细胞.通过对细胞形态连续动态观察、免疫学标志物鉴定、增殖率和纯度检测、迁移和侵袭能力检测、染色体核型分析及全基因组表达谱基因芯片、细胞因子抗体芯片检测,对激活态雪旺细胞是否具有恶性潜能进行评估.同时做自体体内接种试验,观察经体外激活、扩增后的激活态雪旺细胞接种到自体内是否可以致瘤.结果 激活态雪旺细胞在体外培养形态较均一,无异质性变化.连续传代不丢失S100、P75LNGFR、GFAP等免疫标识物,激活前后迁移和侵袭能力略有增加,但远低于恶性细胞.染色体仍为2倍体.基因和蛋白表达存在动态平衡,第2、3代总体表达最高.动物自体接种可见细胞在体内非正常内环境下至少存活2个月,未见肿瘤生长.结论 从成年大鼠周围神经分离、体外培养获得的激活态雪旺细胞,基本不具备恶性潜能,可用于填充人工神经导管修复周围神经缺损.     

巨噬细胞条件培养基影响乳鼠雪旺细胞分泌神经生长因子的实验研究

目的探讨巨噬细胞对雪旺细胞分泌神经生长因子（ＮＧＦ）的影响。方法制备脂多糖激活的和未激活的成年大鼠腹腔巨噬细胞的条件培养基，取３种不同浓度，分别施加于纯化培养的乳鼠雪旺细胞，作用２４、４８、７２小时，取细胞上清液，用间接ＥＬＩＳＡ法测定细胞上清液中ＮＧＦ的含量。结果脂多糖激活的巨噬细胞条件培养基和未激活者取不同浓度作用不同时间后均能不同程度的促进乳鼠雪旺细胞分泌ＮＧＦ。结论实验结果表明，巨噬细胞条件培养基中含有促进雪旺细胞分泌ＮＧＦ的因子，提示巨噬细胞可能通过分泌细胞因子调节雪旺细胞对ＮＧＦ的分泌。     

激活的Notch信号系统对许旺细胞调控作用的影响

目的 研究体外激活的Notch信号系统对许旺细胞的调控作用.方法 培养成年SD大鼠坐骨神经许旺细胞,分别加入Notch信号激活剂Recombinant rat jagged1/FC chimera和抑制剂DAPT,空白对照加PBS缓冲液.通过免疫荧光检测细胞Notch信号蛋白激活状态,MTT检测细胞增殖情况,酶联免疫吸附试验检测细胞分泌NGF情况.结果 倒置显微镜下观察Notch激活组细胞生长优于其他各组;MTT检测该组促细胞增殖作用明显(P＜0.05),且增殖效果在72 h内逐渐增强;ELISA显示Notch激活组细胞培养上清液中NGF蛋白浓度[(60.11±2.61)pg/ml]较对照组[(51.29±3.59)pg/ml]及抑制组[(43.43±2.82 pg/ml]明显升高(P＜0.05).结论 一定剂量的Notch信号激活剂不仅促进体外培养的许旺细胞增殖,而且促进许旺细胞分泌NGF增多.     

脑源性神经营养因子在激活态雪旺细胞中表达的初步实验研究

目的 分析激活态雪旺细胞的脑源性神经营养因子(brain—derived neurotrophic factor，BDNF)表达及其对神经再生的作用。方法 选用20只SD大鼠，将大鼠右侧正中神经及尺神经在腋部切断进行激活(实验组)，左侧的正常神经为(对照组)。采用双酶消化法获取雪旺细胞并进行激活后提取-mRNA，应用RT-PCR的方法比较BDNFmRNA的变化。结果 激活态雪旺细胞BDNFmRNA表达比对照组明显增多。结论 激活态雪旺细胞分泌神经营养因子BDNF增多，具有促进神经再生的作用。     

青藤碱抑制人外周血CD4+T淋巴细胞内NF-AT和IFN-γ表达的体外研究

目的 通过研究青藤碱(SIN)对人外周血CD4+T淋巴细胞内核因子-AT(NF-AT)和γ干扰素(IFN-γ)表达的影响来探讨其免疫作用机制.方法 免疫磁珠法分选人外周血CD4+T淋巴细胞,并分为5组进行培养.(1)阴性对照组:细胞培养液中不加入任何药物;(2)阳性对照组:细胞培养液中加入终浓度为50ng/ml的环孢素A(CsA)溶液;(3)低浓度青藤碱(L-SIN)组:细胞培养液中加入终浓度为10μmol/L的青藤碱溶液;(4)中浓度SIN(M-SIN)组:细胞培养液中加入终浓度为200 μmol/L的青藤碱溶液;(5)高浓度SIN(H-SIN)组:细胞培养液中加入终浓度为1000 μmol/L的青藤碱溶液.观察各组CD4+T淋巴细胞的增殖情况,蛋白印迹法检测各组细胞内NF-AT的蛋白表达,流式细胞术检测各组细胞内IFN-γ的表达水平.结果 与阴性对照组比较,M-SIN和H-SIN组明显抑制了CD4+T淋巴细胞的增殖(P＜0.01).青藤碱呈浓度依赖性抑制CD4+T细胞内NF-AT和IFN-γ的表达(P＜0.01),而加入CsA培养的阳性对照组NF-AT和IFN-γ表达最低.CD4+T淋巴细胞内NF-AT的表达与细胞增殖抑制率之间存在负相关关系(rs=-0.969,P=0.000).结论 青藤碱抑制人外周血CD4+T淋巴细胞内NF-AT和IFN-γ表达;其免疫作用机制可能是通过降低NF-AT的表达以抑制T淋巴细胞的活化和增殖.