丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子序列的确定及转录活性的鉴定

目的：研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(core)反式激活基因HCTP4基因序列表达的调控机制。方法：选取翻译起始密码子ATG上游44l bp的DNA序列为启动子序列，应用聚合酶链反应技术(PCR)，以肝母细胞瘤细胞系HepG2基因组DNA为模板，扩增该启动子DNA片段，将其克隆至pCAT3中，构建pCAT3-HCTP4-promoter报告基因表达载体，以该质粒转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：发现质粒pCAT3-HCTP4-promoter能够指导CAT的表达，吸光度(A值)是pCAT3对照质粒的5倍。结论：本研究克隆的启动子DNA序列具有转录活性，这一结果为研究HCTP4的调节机制，进一步阐明丙型肝炎病毒核心蛋白的作用机制奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子序列的确定及转录活性的鉴定

目的：阐明丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A(NS5A)反式激活基因NS5A-TP9表达的调控机制。方法：选取NS5A-TP9基因翻译起始密码子ATG上游661bp的基因组DNA序列作为启动子序列，应用聚合酶链反应(PCR)技术，以肝母细胞瘤细胞系HepG2基因组DNA为模板，扩增该启动子DNA片段，将其克隆至pCAT3中，构建pCAT3-NS5A-TP9-promoter报告基因表达载体，以该质粒转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：发现质粒pCAT3-NS5A-TP9-promoter具有指导报告基因CAT转录表达的启动子活性，CAT的吸光度(A值)是缺乏启动子序列对照质粒pCAT3的13．9倍。结论：本研究克隆的启动子DNA序列具有指导下游基因转录的启动子活性，这一结果为研究新基因NS5A-TP9转录表达的调节机制，进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的作用机制奠定了基础。     

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA的结合蛋白

目的：筛选丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合蛋白，探索HCTP4基因的表达调控机制。方法：应用噬菌体表面展示技术，以多聚酶链反应(PCR)技术扩增的HCTP4启动子DNA片段作为固相筛选分子．对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程，噬斑裂解液PCR扩增后，回收产物并进行克隆化，对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果：噬菌体经富集后，筛选出12个阳性克隆。成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索，确定了与HCV核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合的蛋白有：核糖体蛋白L15、视网膜母细胞瘤结合蛋白8。结论：用噬茵体人肝cDNA文库筛选得到HCV核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合蛋白，分析了这些蛋白的功能，为研究HCTP4的生物学调节机制，进一步阐明HCV核心蛋白的致病机制奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6猴同源基因N的克隆化与序列分析

目的：利用酵母双杂交技术，业已成功克隆了人类丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)的编码基因。为了阐明不同生物类型中HCBP6基因序列的同源性，阐明HCBP6的生物学功能，我们应用生物信息学技术，克隆猴HCBP6同源基因序列，并对其结构进行分析。方法：应用我们克隆的人HCBP6基因序列作为参照，对美国国立卫生研究院(NIH)国立医学图书馆(NLM)国立生物工程信息中心(NCBI)建立的核苷酸数据库以及在线分析软件进行分析。对已经克隆的不同生物来源的HCBP6的同源基因序列进行比较。结果：猴HCBP6的同源基因开放读码框架长度为570bp，编码产物HCBP6蛋白由189aa组成。猴HCBP6的同源基因编码产物与人、猪、牛的HCBP6同源基因编码产物的同源性分别是96．27％、89．95％、85．7l％。结论：生物信息学技术是克隆不同生物类型的同源基因序列的可靠、快捷途径。猴HCBP6同源基因的克隆化为研究不同种属来源的HCBP6基因的结构域功能、表达与调控等研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A调节新生多肽复合物启动子转录活性的研究

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白5A（NS5A）对新生多肽相关复合物（NACA）启动子转录活性的影响。方法以我室构建的能够表达NS5A蛋白的pcDNA3．1（-）-NS5A质粒和含有NACA基因启动子的PCAT3-NACA报告基因质粒共转染HepG2细胞系设为实验组，同时PCAT3-NACA单独转染HepG2细胞系作为对照组。用酶联免疫吸附法检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果pCAT3-NACA单独转染HepG2细胞的CAT酶表达活性与pCAT3-NACA和pcDNA3．1（-）-NS5A共转染组HepG2细胞的CAT酶表达活性比较，共转染组A值下降了79．3％。结论HCV NS5A能够抑制NACA启动子的活性，对NACA的表达具有下调作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白上调诱导型一氧化氮合酶基因启动子的转录活性

目的 探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心（core）蛋白对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因启动子转录的激活作用。方法 利用生物信息学技术确定iNOS基因的启动子区域（iNOSp），聚合酶链反应（PCR）扩增iNOSp的DNA，克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中，构建pCAT3-iNOSp报告载体；以该质粒转染正常人肝细胞LO2，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性；并与HCV核心蛋白的真核表达载体pcDNA3．1（-）-core共转染LO2细胞，用ELISA法检测CAT的表达活性。结果 成功获得iNOS基因启动子的正确克隆，pCAT3-iNOSp和pcDNA3．1（-）core瞬时共转染LO2细胞时，报告基因表达载体中的SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性明显提高，CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的11倍，是pCAT3-iNOSp的6倍，重复试验得到了相似的结果。结论 成功克隆的iNOS启动子有转录活性；HCV核心蛋白具有对iNOS基因启动子的反式激活作用。HCV核心蛋白在细胞内的表达对于iNOS基因反式激活在HCV感染相关的慢性肝脏疾病的发病过程中具有重要意义。     

丙型肝炎病毒核心蛋白DNA结合区的测定

目的 阐明丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的DNA结合特性及其意义。方法 在大肠杆菌中表达谷胱甘肽转移酶（GST）融合HCV核心蛋白不同长度片段,并进行纯化。经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,通过更换缓冲液的方法将这些蛋白片段相对固定在凝胶中,用γ－^32P[4667-0091]ATP标记人工合成的DNA进行2次电泳,通过放射自影检测核心蛋白的DNA结合区。结果 HCV核心蛋白N端第10－16位氨基酸残基和第46－70位氨基酸残基可独立地结合DNA,核心蛋白既能和单链DNA结合又能和双链DNA结合,对单双链DNA的结合域相同。对所结合的DNA序列无选择性。结论 HCV核心蛋白的N端含有两个DNA结合区,结合区序列与核内转移信号的部分重迭以及对结合靶DNA序列的非选择性可能是HCV核心蛋白具有多功能的基础。     

牛丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6同源基因的克隆化研究

目的　利用不同种属动物之间重要基因序列高度同源的理论 ,应用生物信息学技术和方法 ,克隆牛丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白结合蛋白 6 (HCBP6 )的同源基因。方法　首先应用酵母双杂交技术 ,以表达HCV核心蛋白的表达载体为诱饵 ,对于百万级的肝细胞cDNA文库酵母进行配合、筛选 ,首先获得人HCBP6的全长编码基因 ,然后应用美国国立生物信息学中心 (NCBI)建立的核苷酸序列数据库 (GenBank)的同源基因的检索 ,搜索与之同源的来源于牛的表达序列标签 (EST)。然后根据基因同源性的原则 ,确定牛HCBP6的同源基因。结果　获得了与HCV核心蛋白结合蛋白的 36个基因片段 ,其中之一命名为HCBP6。根据基因同源性搜索 ,获得了来源于牛的EST基因序列片段 ,最终确立了牛HCBP6的同源基因。结论　利用不同物种之间基因同源性的原理 ,NCBI数据库GenBank同源基因的搜索 ,获得了牛HCBP6同源基因。生物信息学技术在后基因组时代具有重要地位和作用。     

丙型肝炎病毒核心基因免疫研究

目的研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫用于预防和治疗ＨＣＶ感染的可行性和有效性．方法将ＨＣＶＣ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游，在证实其可以在小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０（Ｈ２ｄ）中表达之后，将重组质粒注射ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）小鼠股四头肌，ＥＬＩＳＡ检测血清中抗体产生水平；３ＨＴｄＲ掺入法测定免疫小鼠淋巴细胞ＨＣＶＣ抗原特异性增殖能力，４ｈ５１Ｃｒ释放法检测免疫小鼠细胞毒Ｔ细胞（ＣＴＬｓ）体外杀伤功能．结果免疫小鼠２０只，初次免疫２ｗｋ后，血清中均出现了ＨＣＶＣ抗体，且增加免疫剂量可提高抗体滴度；淋巴细胞增殖指数为６１０，明显高于对照组（Ｐ＜００１），ＣＴＬｓ体外特异性杀伤率为６３１％，也高于对照组（Ｐ＜００１）．结论ＨＣＶＣ基因免疫不仅可以诱导机体产生特异性的体液免疫，而且产生特异性的细胞免疫，它可能是防治ＨＣＶ的有效方法．     

丙型肝炎病毒基因片段体外转录和真核表达载体的构建与鉴定

目的 探讨基因免疫和基因治疗用于丙型肝炎病毒（HCV）疫苗及抗HCV感染的可行性，构建含HCV基因片段的体外转录和真核表达载体。方法 从HCV慢性感染患者血清中提取总RNA后，采用逆转录PCR扩增出含有5'NCR和编码核心蛋白C区上游基因片段的HCV－cDNA，经HindⅢ和EcoR I双酶切后，定向克隆入体外转录载体pGEM3ZF(-)和真核表达载体pBBS212中，构建成pGEM3ZF-HCV和pBBS212-HCV重组表达质粒，并经双酶切鉴定。结果 用HindⅢ和Eco R I双酶切鉴定证实，克隆的HCV基因片段正确插入载体pGEM3ZF(-)和pBBS212中。结论 成功构建含5'NCR和部分核心C区基因的体外转录及真核表达载体，可为进一步研究HCV基因疫苗以及核酶基因治疗HCV奠定基础。     

合并乙型肝炎病毒感染对丙型肝炎病毒核心抗原检测的影响

目的 探讨合并HBV感染对慢性HCV感染者血清丙型肝炎病毒核心抗原(HCVcAg)检出情况的影响. 方法 收集2005年12月-2009年10月慢性丙型肝炎患者和HBV/HCV合并感染者资料,检测血清HCVcAg和HCV RNA,对后者血清进行HBV DNA、HBeAg检测,分析HCVcAg检出率与HBeAg、HBV DNA定量检测的关系.用独立两组多分类的X2检验方法进行统计学分析. 结果 共收集88例慢性丙型肝炎患者和62例HBV/HCV合并感染者资料,血清HCVcAg的检出率分别为72.7％(64/88)和38.7％ (24/62),两者比较,x2= 17.358,P＜0.01,差异有统计学意义.HCV RNA检出率分别为81.8％ (72/88)和53.2％ (33/62),两者比较,x2=20.110,P＜0.01,差异有统计学意义.62例HBV/HCV合并感染者血清中,HBeAg阳性和HBeAg阴性感染者HCVcAg检出率分别为28.6％ (12/42)和60.0％ (12/20),两者比较,x2=5.641,P=0.011,差异有统计学意义.HCV RNA阳性率分别为42.9％ (18/42)和80.0％ (16/20),两者比较,X2=7.547,P＜ 0.01,差异有统计学意义.HBV DNA阳性和阴性时HCVcAg检出率分别为39.1％ (18/46)和37.5％ (6/16),两者比较,P＞0.05,差异无统计学意义.与单纯HCV感染者血清HCVcAg检出率72.7％ (64/88)比较,HBeAg阴性合并感染者为60.0％ (12/20),x2=1.266,P=0.261,差异无统计学意义;HBV DNA阴性合并感染者为37.5％ (6/16),x2=7.635,P＜0.01,差异有统计学意义.结论 HBV/HCV合并感染时HCVcAg检出率较低,可能是由于HBeAg抑制HCV的复制,从而减少HCVcAg的表达所致.     

重型乙型肝炎病毒C基因启动子变异

目的了解我国重型肝炎Ｃ基因调节序列变异特点。方法克隆及聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物直接测序方法对,检测７例重型乙型肝炎患者乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｃ基因调节序列变异。结果４例存在Ｔ１７６２Ａ１７６４变异;但在Ｔ１７６２Ａ１７６４以外位点也存有诸多变异,其中１例在ｎｔ１７７６－１７７７之间有１１ｂｐ的插入变异。结论重型肝炎ＨＢＶＣ基因启动子区存在较多的变异位点,推测这些变异对Ｃ启动子的调节活性影响可能是综合性的。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A上调硫氧还蛋白还原酶1基因表达的研究

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用.方法以我室构建的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)筛选结果及基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-NS5A共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果pCAT3-TXNRD1p和pcDNA3.1(-)-NS5A瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的9.6倍,pCAT3-TXNRD1p的2.1倍.本实验进一步验证了我室利用SSH技术及基因表达谱技术发现的HCV NS5A蛋白反式激活TXNRD1基因转录作用的结果.结论我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HCV的NS5A蛋白具有对TXNRD1基因启动子的反式激活作用.     

丙型肝炎病毒核心蛋白通过自诱导方式可溶性表达及其生物学功能鉴定

目的 构建包含HCV核心蛋白全长基因的重组原核表达质粒,经转化表达型大肠杆菌后自诱导培养以获取可溶性重组核心蛋白,并检测其生物学功能. 方法 以H/FL质粒为模板,通过PCR扩增全长HCV核心蛋白DNA.PCR产物经双酶切后定向克隆到pET28a原核表达载体中.将重组的原核表达载体转化表达型大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS,并通过自诱导培养的方式使其在高浓度状态下表达重组核心蛋白.重组核心蛋白经Western blot检测鉴定生物学功能,并与HCV NS3蛋白进行相互结合后共同纯化实验. 结果 重组核心蛋白大量存在于表达菌破菌上清液中.Western blot检测结果显示其具有核心蛋白抗原性.重组核心蛋白不能单独通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,但可以与HCV NS3蛋白结合后共同纯化. 结论 成功表达可溶性的重组核心蛋白,证明了其生物学活性.重组核心蛋白与HCV NS3蛋白存在相互作用.     

Understanding the interaction of hepatitis C virus with host DEAD-box RNA helicases

The current therapeutic regimen to combat chronic hepatitis C is not optimal due to substantial side effects and the failure of a significant proportion of patients to achieve a sustained virological response.Recently developed direct-acting antivirals targeting hepatitis C virus(HCV)enzymes reportedly increase the virologic response to therapy but may lead to a selection of drug-resistant variants.Besides directacting antivirals,another promising class of HCV drugs in development include host targeting agents that are responsible for interfering with the host factors crucia for the viral life cycle.A family of host proteins known as DEAD-box RNA helicases,characterized by nine conserved motifs,is known to play an important role in RNA metabolism.Several members of this family such as DDX3,DDX5 and DDX6 have been shown to play a role in HCV replication and this review will summarize our current knowledge on their interaction with HCV.As chronic hepatitis C is one of the leading causes of hepatocellular carcinoma,the involvement of DEADbox RNA helicases in the development of HCC will also be highlighted.Continuing research on the interaction of host DEAD-box proteins with HCV and the contribution to viral replication and pathogenesis could be the panacea for the development of novel therapeutics against HCV.     

Genes transactivated by hepatitis C virus core protein, a microarray assay

AIM: To explore the new target genes transactivated by hepatitis C virus (HCV) core protein and to elucidate the pathogenesis of HCV infection. METHODS: Reverse transcribed cDNA was subjected to microarray assay. The coding gene transactivated by HCV core protein was cloned and analyzed with bioinformatics methods. RESULTS: The expressive vector of pcDNA3.1(-)-core was constructed and confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing and approved correct. mRNA was purified from HepGZ and HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-)-core, respectively. The cDNA derived was subjected to microarray assay. A new gene named HCTP4 was cloned with molecular biological method in combination with bioinformatics method. CONCLUSION: HCV core is a potential transactivator. Microarray is an efficient and convenient method for analysis of differentially expressed genes.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因6的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCVNS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的PBRTM-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS3编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定，构建真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS3。以pcDNA3．1(-)-NS3转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术(bioinformatics)，克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS3，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS3反式激活的新型靶基因，命名为NS3TP6，新基因的编码基因序列全长为414个核苷酸(nt)，编码产物由138个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因，并成功克隆其中的NS3TP6，为阐明HcvNs3蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

C-terminal domain of hepatitis C virus core protein is essential for secretion

AIM: We have previously demonstrated that hepatitis C virus (HCV) core protein is efficiently released into the culture medium in insect cells. The objective of this study is to characterize the HCV core secretion in insect cells. METHODS: We constructed recombinant baculoviruses expressing various-length of mutant core proteins, expressed these proteins in insect cells, and examined core protein secretion in insect cells. RESULTS: Only wild type core was efficiently released into the culture medium, although the protein expression level of wild type core was lower than those of other mutant core proteins. We found that the shorter form of the core construct expressed the higher level of protein. However, if more than 18 amino acids of the core were truncated at the C-terminus, core proteins were no longer secreted into the culture medium. Membrane flotation data show that the secreted core proteins are associated with the cellular membrane protein, indicating that HCV core is secreted as a membrane complex. CONCLUSION: The C-terminal 18 amino acids of HCV core were crucial for core secretion into the culture media. Since HCV replication occurs on lipid raft membrane structure, these results suggest that HCV may utilize a unique core release mechanism to escape immune surveillance, thereby potentially representing the feature of HCV morphogenesis.     

Global epidemiology of hepatitis C virus infection: an up-date of the distribution and circulation of hepatitis C virus genotypes

AIM To review Hepatitis C virus(HCV) prevalence and genotypes distribution worldwide.METHODS We conducted a systematic study which represents one of the most comprehensive effort to quantify global HCV epidemiology,using the best available published data between 2000 and 2015 from 138 countries(about 90% of the global population),grouped in 20 geographical areas(with the exclusion of Oceania),as defined by the Global Burden of Diseases project(GBD). Countries for which we were unable to obtain HCV genotype prevalence data were excluded from calculations of regional proportions,although their populations were included in the total population size of each region when generating regional genotype prevalence estimates.RESULTS Total global HCV prevalence is estimated at 2.5%(177.5 million of HCV infected adults),ranging from 2.9% in Africa and 1.3% in Americas,with a global viraemic rate of 67%(118.9 million of HCV RNA positive cases),varying from 64.4% in Asia to 74.8% in Australasia. HCV genotype 1 is the most prevalent worldwide(49.1%),followed by genotype 3(17.9%),4(16.8%) and 2(11.0%). Genotypes 5 and 6 are responsible for the remaining 5%. While genotypes 1 and 3 are common worldwide,the largest proportion of genotypes 4 and 5 is in lower-income countries. Although HCV genotypes 1 and 3 infections are the most prevalent globally(67.0% if considered together),other genotypes are found more commonly in lowerincome countries where still account for a significant proportion of HCV cases.CONCLUSION A more precise knowledge of HCV genotype distribution will be helpful to best inform national healthcare models to improve access to new treatments.