fgl2凝血酶原酶多肽抗体的制备和应用

目的　利用人工合成多肽制备针对人源、鼠源fgl2凝血酶原酶 (hfgl2、mfgl2 )的特异性多克隆抗体 ,以期用于与fgl2表达异常密切相关的疾病的研究和诊治。方法　根据mfgl2、hfgl2基因编码的氨基酸序列合成多肽 3(Pep3)和多肽 4 (Pep4 ) ,并用化学方法与匙孔血蓝蛋白 (KLH)连接 ,纯品Pep3 KLH和Pep4 KLH免疫动物 ,所制备的抗血清用ELISA、Westernblot和前凝血质活性 (PCA)实验鉴定 ,并采用免疫组化法应用于乙型肝炎患者肝组织中hfgl2的检测。结果　ELISA检测表明 ,所制备的抗血清可分别与Pep3和Pep4发生特异性免疫反应 ;Westernblot结果显示 ,抗血清可识别MHV 3感染BALB cJ小鼠腹腔巨噬细胞特异性条带 ,相对分子质量 (Mr)为 6 5× 10 3;PCA实验提示 ,抗血清具有中和mfgl2分子酶活性的作用。对病毒性乙型肝炎患者肝组织免疫组织化学染色发现hfgl2仅在重型乙型肝炎患者高表达 ,而在慢性乙型肝炎和肝硬化患者的肝组织中无表达。结论　所制备的fgl2的多肽抗体 (多克隆抗体 )可识别mfgl2和hfgl2分子 ,具有与抗原特异性结合、中和其酶活性的特征 ,为深入研究这一新发现的分子提供了有力的科学手段。     

大鼠透明质酸合成酶-2抗血清的制备及鉴定

目的: 制备大鼠透明质酸合成酶-2(HAS-2)抗血清并鉴定抗血清灵敏度及其特异性.方法: 通过生物信息学分析选取HAS-2非保守的亲水区域作为抗原, 通过原核表达纯化后免疫家兔, 制备出抗血清.Western blot检测所制备抗血清的灵敏度.真核瞬时表达大鼠HAS-2和HAS-3, 分别用抗His抗体和抗血清检测, 鉴定制备抗血清的特异性.结果: 通过原核表达并纯化得到抗原多肽, 免疫家兔后获得ELISA效价大于1∶ 10 000的抗血清.所制备的抗血清至少可以检测出10 ng以上的抗原多肽, 并且能够特异地检测HAS-2而与HAS-3无反应.结论: 成功通过大鼠HAS-2非保守区域多肽的原核表达产物制备出高灵敏度和特异性的大鼠HAS-2抗血清, 为研究透明质酸(HA)的病理生理意义提供了有利支持.     

抗人ASGPR大亚基异构体蛋白H1b多克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备小鼠抗人ASGPR大亚基异构体蛋白H1b的多克隆抗体,并鉴定其特异性.方法:合成H1b特异性多肽,以匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏小鼠,制备小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体;ELISA法检测抗体效价,通过Western blot和免疫组织化学检测,鉴定抗体的特异性与适用范围.结果:得到小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体,效价达1:105.纯化后的抗体用于Western blot可高特异性识别真核表达的H1b蛋白,并可用于免疫组织化学实验.结论:成功制备小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体,该抗体具有较高的效价以及特异性,能区分ASG-PR大亚基的两种剪接异构体,从而为进一步研究H1b蛋白的生理功能及其在人类疾病中的意义提供了有利工具.     

耻垢分枝杆菌glmU基因克隆、表达及多克隆抗体的制备

目的:制备抗耻垢分枝杆菌(Smeg)GlmU的多克隆抗体,并对其特异性进行鉴定.方法:用PCR技术扩增SmegglmU,构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒pET29b-SmegglmU,用IPTG诱导表达,经Ni-NTA-Agarose柱层析纯化后,以其为免疫原制备抗Smeg GlmU的多克隆抗体,并以间接ELISA方法测定抗体效价,以Western blot方法鉴定抗体的特异性.结果:在大肠杆菌中得到了可溶性表达的Smeg GlmU;以其免疫小鼠获得抗血清,Western blot鉴定显示获得了能特异性地作用于耻垢分枝杆菌GlmU的多克隆抗体,ELISA测定表明其效价高于1:6 400.结论:获得了能特异性地作用于耻垢分枝杆菌GlmU的高效价多克隆抗体,为应用反义RNA技术研究glmU基因的功能奠定了基础.     

特异性过敏原TBt多克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备特异性苦荞主要过敏原TBt的多克隆抗体,为深入研究TBt分子中各结构域的功能奠定基础.方法:通过盐析,离子交换层析,分子筛层析等方法从苦荞种子中纯化出过敏蛋白TBt,免疫新西兰兔子,制备多克隆抗体.用间接ELISA、Western blot检测该抗体的效价和特异性；竞争ELISA研究IgG抗体对TBt过敏患者血清IgE的抑制作用.结果:间接ELISA法检测所制备抗体的效价达1∶256000左右；Western blot显示该抗体能与TBt蛋白特异结合；竞争ELISA表明制备的IgG抗体能够特异性抑制养麦过敏患者血清1gE与过敏蛋白的结合.结论:制备的TBt多抗血清具有较高的效价和良好的特异性,该多克隆抗体可用于TBt的免疫活性鉴定,为下一步研究该蛋白的分子特征及免疫治疗奠定了基础.     

人Argonaute2蛋白多克隆抗体制备及初步应用

目的:制备人Argonaute2(Ago2)的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用该抗体检测Ago2在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。方法:用DNAstar软件寻找抗原性高的Ago2序列区域(命名为k-Ago2),构建k-Ago2的表达质粒,转化大肠杆菌并诱导表达。融合蛋白经切胶回收纯化后免疫大白兔制备抗体。以ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性及检测Ago2在细胞系中的表达差异,免疫荧光染色观察Ago2的细胞定位。结果:成功构建表达质粒,继而k-Ago2得以表达与纯化,免疫大白兔后得到Ago2多克隆抗体。ELISA检测抗体效价为1∶19 000,Western blot确定抗体具有高度特异性,并成功地用该抗体检测到Ago2在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。结论:Ago2多克隆抗体的成功制备,对RNAi机制的深入研究及其进一步的临床应用均具有重要价值。     

兔抗人乳酸脱氢酶C4(LDHC4)多克隆抗体制备与应用

目的 制备兔抗人乳酸脱氢酶C4(LDHC4)的多克隆抗体。方法 采用PCR点突变LDHC基因,并将该基因构建到pET-28a载体上,形成pET-28a-LDHC重组表达载体、将重组载体转化至大肠杆菌表达宿主BL21(DE3),诱导表达获得重组人LDHC4蛋白,将重组蛋白作为抗原免疫新西兰兔,3次加强免疫后得到抗血清,采用ELISA检测抗血清效价,采用Western blot法检测抗血清的特异性,采用免疫组织化学法检测人三阴性乳腺癌组织中LDHC4的表达。结果 获得了特异性的兔抗人LDHC4多克隆抗体,抗体效价达1∶51 200,该抗体可用于Western blot法和免疫组织化学法。结论 成功制备了特异性兔抗人LDHC4多克隆抗体。     

重组荞麦rBTI的多克隆抗体制备及鉴定

目的: 制备重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)的多克隆抗体.方法: 通过大肠杆菌原核表达系统制备高纯度的rBTI蛋白, 免疫大白鼠, 制备多克隆抗体.用Western blot、间接ELISA及免疫细胞组织化学法检测该抗体的效价和特异性.结果: 间接ELISA法检测所制备抗体的效价达1∶ 128 000以上;Western blot显示该抗体能与BTI蛋白特异结合;免疫组织化学法检测结果显示rBTI主要存在于EC9706细胞的胞质和细胞核内.结论: 所制备的大鼠抗rBTI的抗血清具有较高的免疫反应性和特异性, 为rBTI诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究及进一步揭示荞麦胰蛋白酶抑制剂的结构与功能的关系提供重要的基础.     

人Argonaute3蛋白：多克隆抗体制备、鉴定及组织芯片检测其在各种癌组织中的表达

目的:制备兔抗人Argonaute3(AGO3)的多克隆抗体,并鉴定其特异性,应用组织芯片初步探讨其在人类正常及肿瘤组织中的分布.方法:合成特异性AGO3多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏大白兔,制备兔抗人AGO3多克隆抗体,然后用亲和层析法纯化抗体.用ELISA和Western方法进行抗体验证,并应用人组织芯片进行AGO3的免疫组化研究.结果:通过构建AGO3多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,我们制备了兔抗人AGO3蛋白多克隆抗体,末次抗血清效价为l:20 000,经ELISA及Western blot证实兔抗人AGO3抗体可特异性识别AGO3多肽,在人组织芯片中通过免疫组化染色显示该抗体在很多正常组织上皮细胞及肿瘤细胞胞浆中呈阳性染色.结论:本项研究成功制备兔抗人AGO3多克隆抗体,为进一步研究AGO3在微小RNA/RNA干扰通路中的作用及在人类疾病中的意义提供了有利工具.     

翻译控制肿瘤蛋白TPT1的原核表达、纯化、抗体制备和初步应用

目的:原核表达并纯化翻译控制蛋白TPT1,免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法:构建原核表达质粒pRSE-TA2-TPT1,转化大肠杆菌BL21(DE3),TPT1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni-NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清。以间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果:在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的TPT1融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫大白兔,获得了高特异性的抗TPT1抗血清。结论:成功构建原核表达质粒pRSETA2-TPT1,表达并纯化TPT1蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体.为进一步研究TPT1在肿瘤等疾病发生、发展过程及治疗中的作用奠定基础。