乙型肝炎病毒增强子Ⅰ区核苷酸序列变异分析

目的 研究慢性乙型肝炎患者血液中乙型肝炎病毒增强子Ⅰ区基因突变状况.方法 收集慢性乙型肝炎患者7例血清标本,抽提血清中HBV DNA,扩增HBV EnhⅠ基因,PCR产物测序后利用Gengbank中Genotyping对HBV进行分型,并分析核苷酸序列中的突变位点.结果 1例标本因PCR产物太弱,无法满足测序要求,其他6例测序标本经Genotyping比对,均属于B型,与参考序列AF100309同源性最高;发现HBV EnhⅠ共有17个突变点,分别为A970T、G973A、T991C、A994G、C1013T、A1042T、G1099A、C1127T、G1180C、A1182C、T1201A、G1204A、C1206A、C1211G、A1249C、A1309G、A1330C.结论 慢性乙型肝炎患者中HBV EnhⅠ基因选择性突变,可能下调HBV基因表达,是导致乙型肝炎慢性化的原因之一.     

儿童感染的乙型肝炎病毒X基因的分子特征分析

目的 初步调查儿童感染的乙型肝炎病毒(HBV)X基因的分子特征.方法 收集20例儿童慢性乙型肝炎(乙肝)患者的血清标本,抽提血清中的HBV DNA,采用PCR扩增HBV X基因并测序,利用Clustal X、Bioedit软件对PCR产物序列进行X基因的突变分析.结果 20例HBV X基因突变区主要集中在羧基端aa120-150,氨基酸序列突变点分别为I127T、K130M、V131I、P145R、A146G/C、C148R/H和N149G/D;核苷酸序列突变点分别为T1753C、A1762T、G1764A、T1800C、C1807G、C1810G、A1811T、A1814C、T1815C、C1817T、A1819G和C1820A.结论 儿童感染的HBV X存在突变,集中在羧基端aa120-150,对儿童乙肝的演变会产生重要影响.     

江西地区儿童感染的乙型肝炎病毒基因型分析

初步调查江西地区儿童感染的乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)基因型特征,为诊疗和预防儿童HBV感染提供重要参考。方法收集118例HBV感染的儿童血清标本,抽提血清中的HBV DNA,采用PCR扩增HBV S基因并测序,利用Genotyping软件对PCR产物序列进行分型,并采用Editseq软件、Clustalx(1.83)软件和Mega 4软件绘制S基因HBsAg遗传进化树以鉴定基因亚型。结果 118份HBsAg阳性血清标本中,成功扩增出HBV S基因并测序。所测序列标本经Genotyping比对和HBsAg遗传进化树后,112例为HBV B基因型,占94.92%,都是B2亚型;6例为HBV C基因型,占5.08%,其中4例为C2亚型,2例为C3亚型。结论江西地区儿童感染的HBV以B基因型中B2基因亚型为主,有少量的C基因型(C2基因亚型和C3基因亚型);该地区儿童感染的HBV遗传距离近。更多还原     

江西地区儿童感染的乙型肝炎病毒全基因组序列分析

目的 初步调查江西地区乙肝疫苗免疫儿童感染的乙型肝炎病毒全基因组的分子特征。方法 收集江西省儿童医院11 445份乙肝疫苗免疫儿童血清标本,采用酶联免疫吸附试验检测HBV-M,抽提乙肝表面抗原(HBsAg)阳性血清中的HBV DNA,分3个相互重叠片段PCR扩增HBV基因并测序,采用ContigExpress软件对所测序列拼接成全基因组序列,分析各读码框核苷酸和氨基酸变化。对HBV不同基因型以及所获得的HBV全基因组的S基因序列进行系统进化树的构建以确定基因型。结果 11 445份血清样品中,检测出117份HBsAg阳性标本,进行分段重叠扩增并测序,最终拼接出58份完整的HBV基因组,均为B基因型和adw血清型。对各开放读码框进行序列比对发现PreS区存在散在分布的突变:如A2990C→H48P、A2999C→N51T、C3041T→P65L、C3097A→L84I和A3136G→T97A;S区突变集中在120~200aa,主要突变位点为C533A→P127T、A541C→Q129H、G588C→G145A、T753A→F200Y;前C区突变位点有A1814C/T1815C→M1P、G1896A→W28*,C区出现1例C1913A→P5T变异;P区出现散在分布的突变位点,未发现与耐药性有关的突变位点,其RT区YMDD核序也未发生变异;X区氨基端主要突变点为:G1437T/A→G22C/S、G1476A→G35R和G1503A/T/C/T1504G→V44I/F/L/C,羧基端突变集中在120~150aa,出现5例A1762T/G1764A→K130M/V131I突变。结论 了解分析儿童HBV全基因组的分子特征和突变情况,为疫苗免疫儿童感染乙肝的预防和治疗提供病毒学分子信息。     

隐匿性HBV感染者血清中HBVS基因变异分析

目的分析隐匿性HBV感染者的HBV DNA基因序列,查找基因变异位点,探讨隐匿性HBV感染的分子生物学机制。方法选择不明原因肝病患者76例,分离患者血清,采用巢式PCR检测患者血清HBV DNA,阳性者随机抽取8例扩增nt56-nt767 HBV S区DNA片段并采用直接测序法检测S区基因的变异情况。结果本组76例不明原因肝病患者中16例血清HBV DNA阳性,随机选择8例测序比对发现,a决定簇内nt587出现G→A的突变,推导氨基酸由甘氨酸变异为精氨酸,即较为常见的G145R突变。a决定簇外nt355、nt484碱基均由A→C,推导氨基酸无变化,nt512碱基由C→A,推导氨基酸由脯氨酸变异为苏氨酸。结论 HBV S区的变异影响了体内HBV清除,导致病毒的低水平复制,其中G145R突变是隐匿性HBV感染发生的原因之一。     

福州地区HBsAg-/HBVDNA+献血者乙肝病毒S区MHR变异特征分析

目的 分析福州地区HBsAg-/HBV DNA+献血者HBV的基因型及主要亲水区(MHR),尤其是其中"a"决定簇区氨基酸的变异情况,为进一步研究隐匿性乙肝病毒感染的发生机制提供参考.方法 对收集的2013年7月—2014年10月福州地区献血者的90874名献血者血液标本进行HBsAg ELISA与单人份核酸检测,对筛查出的HBsAg-/HBV DNA+标本,进行HBV DNA的提取和S区基因的扩增和测序.测序结果进行进化分型,分析MHR中氨基酸序列的变异情况.选取15例前期研究所得的HBsAg+/HBV DNA+标本的测序结果作为对照,比较两类标本在"a"决定簇区蛋白序列变异上的差异.结果 16份测序结果中B基因型15份,C基因型1份.15例标本中13例在MHR内共发生了33次氨基酸的变异,其中25次集中在"a"决定簇区,HBsAg-/HBV DNA+标该组"a"决定簇区的变异率要高于HBsAg+/HBV DNA+标该组.变异的形式主要为单个的氨基酸的点替换,另有7例标本在124位与125位氨基酸间发生了9个碱基的非移码插入,造成该位点间"TNR"3个氨基酸的插入.结论 福州地区献血者HBsAg-/HBV DNA+血液标本中HBV的基因型以B型为主,MHR的氨基酸变异主要集中在"a"决定簇区,有本地区的地域特点.研究中新发现的3个氨基酸"TNR"的插入变异,可能影响HBsAg的检出.     

乙型肝炎病毒基因组基本核心启动子变异分析

目的研究慢性乙型肝炎患者感染的HBV基因组中基本核心启动子基因变异状况。方法收集16例慢性乙型肝炎患者的血清标本,抽提血清中HBV DNA,PCR法扩增HBV BCP区基因,PCR产物测序并分析核苷酸序列中的变异位点。结果 12例成功提取DNA,其中2例标本因PCR产物太弱,无法满足测序要求,其他10例测序标本均属于B型,与参考序列AF100309同源性最高;发现HBV BCP共有5个变异点,分别为T1753C、A1762T、G1764A、G1752A和A1775C。结论 HBV BCP变异可能影响HBV前C基因组mRNA转录,是HBV持续感染和肝病变进展的原因之一。     

慢性乙型肝炎感染者HBV Pre-S/S基因变异特征分析

目的探讨慢性乙型肝炎感染者HBV Pre-S/S基因序列特征及不同抗原表位氨基酸的变异情况。方法采用巢式PCR法分片段扩增HBV-DNA阳性的慢性乙型肝炎感染者HBV的Pre-S/S基因,并对扩增产物进行测序,将测序结果与Gen Bank中的标准序列比对分析。结果 120例HBV感染者中B基因型78例,C基因型42例。序列分析发现,B基因型中有2例出现Pre-S1基因序列缺失;C基因型中有1例出现Pre-S2基因序列缺失。Pre-S/S蛋白区抗原表位变异分析可知,除CTL的3个抗原表位(CTL-7、8、9)外,其它检测的抗原表位均出现变异。相关性分析发现,除B细胞4、5表位,CTL 4、5表位及Th细胞1表位的变异与样品的基因型具有一定的相关性(P0.05),其它表位的变异与样品基因型无统计学意义。抗原表位具体氨基酸变异分析发现,Pre-S1/S2基因位点如27、45、46、48等氨基酸变异可导致多个抗原表位同时发生变异;在"a"决定簇中还发现126、129、131、133、144、145等热门位点的变异,B基因型中有2例发生G145R经典逃逸株的变异;C基因型中发现7例与严重肝病有一定相关性的I126T位点变异。结论慢性乙型肝炎感染者HBV Pre-S/S基因上也普遍存在基因变异,其中包括G145R、I126T等热门突变位点,这些位点的氨基酸突变可导致Pre-S/S蛋白区一个或多个抗原表位的改变,进而影响其免疫原性,并导致HBV逃避宿主的免疫监视而引起持续感染。     

高通量测序分析5例母婴传播中HBV准种变化趋势

目的：探讨5例乙肝疫苗接种失败儿童及其母亲在母婴传播过程中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）“a”决定簇准种变化趋势。方法：选择5例重庆地区乙肝疫苗接种失败的儿童及其母亲,应用PCR法扩增其HBV基因组全长,构建HBV全基因组测序文库后进行solexa高通量测序,并对测序数据进行生物信息学分析。结果：母子HBV序列同源性为99%～100%;5对母子HBV基因型均为B+C混合型,其中4对优势基因型为B型,1对为C型,母子优势基因型相同;所有儿童均在“a”决定簇存在复杂度明显增高位点;5对母子“a”决定簇复杂度明显增高的氨基酸（Amino acid,aa）位点共有10个,仅存在于儿童的有2个,为aa126和aa143,儿童中有1例发生优势氨基酸突变,突变形式为G145R。结论：乙肝疫苗接种失败儿童在“a”决定簇存在准种现象,儿童体内的突变株可能来源于其母亲。     

实时荧光聚合酶链反应检测HBV基因型B～D方法的建立

目的 建立实时荧光聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型B~D方法并验证其准确性。方法 比较GenBank中已发表的明确分型的143株HBV全序列,设计特异的组合引物探针,应用实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法对兰州地区128例慢性乙型肝炎患者血清标本进行基因型B、C、D检测,并随机对检测的基因型各3株标本进行S基因测序验证。结果 128例标本中B型检出率为20.3%(26/128),C型71.9%(92/128),D型7.8%(10/128);18株HBV克隆标本S基因测序结果与本分型法完全一致。结论 实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法能够简便、灵敏、快速、准确地鉴定HBV基因型,适宜用于HBV基因型的大规模临床和流行病学调查。     

长春地区乙型肝炎病毒基因分型

目的：探讨长春地区慢性乙型肝病患者中乙型肝炎病毒（HBV）基因型特点。方法：慢性乙型肝病患者血清中提取HBV DNA,经巢式聚合酶链法(nested-PCR )扩增HBV S基因区片断,利用双脱氧链末端终止法检测HBV S区核苷酸序列并进行基因型分析。结果：39株HBV中C基因型23株,其中16株为C基因型adr亚型,7株为C基因型adw亚型;16株为B基因型adw亚型; 未发现ayr及ayw型;有2株存在“a”决定簇变异;与参照序列比较,S基因存在多处点突变,部分 点突变导致所编码的氨基酸变异;同以往研究的结果类似,未发现癌特异性的HBV S基因变异。结论：研究对象中HBV存在C基因型和B基因型, C基因型为主要基因型;HBV相关性慢性肝病患者中HBV S基因存在序列多态性。     

实时荧光聚合酶链反应检测HBV基因型B～D方法的建立

目的建立实时荧光聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型B～D方法并验证其准确性。方法比较GenBank中已发表的明确分型的143株HBV全序列，设计特异的组合引物探针，应用实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法对兰州地区128例慢性乙型肝炎患血清标本进行基因型B、C、D检测，并随机对检测的基因型各3株标本进行S基因测序验证。结果128例标本中B型检出率为20.3％(26／128)，C型71．9％(92／128)，D型7．8％(10／128)：18株HBV克隆标本S基因测序结果与本分型法完全一致。结论实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法能够简便、灵敏、快速、准确地鉴定HBV基因型，适宜用于HBV基因型的大规模临床和流行病学调查。     

慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒C基因启动子变导异的初步研究

为建立快速特异检测乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒（HBV）DNA的聚合酶链式反应（PCR）方法,产初步分析患者体内乙型肝炎病毒C基因启动子（HBV.CP）变异的情况,对PCR法扩增的HBV DNA直接测序,并应用计算机进行DNA同源性分析。结果显示：应用PCR法扩增20份慢性乙肝患者血清阳性率为95%（19/20）;选择中度、重度乙肝患者血清和pGEM.7Z-HBV质粒扩增的HBV.CP各1份分别测序,与报告基因的同源性分别为72.0%、66.5%、90.0%。研究表明,PCR法可用于HBV.CP区变异的检测,慢性乙型肝炎患者存在该区变异。     

RFLP基因分型在动态监测乙型肝炎病毒基因变异中的应用

目的探讨基因分型结合克隆后测序方法在动态监测ＨＢＶ基因变异中的价值。方法分析１例重型肝炎患者发 病后血清,用 ＰＣＲ扩增血清中 ＨＢＶ ｐｒｅＳ／Ｓ基因片段并克隆,２份标本各随机挑取 ３个阳性克隆进行测序;同时用 ＲＦＬＰ方法分析２份血清中ＨＢＶ毒株的基因型。结果ＰＦＬＰ分析２份血清为Ｂ基因型为主的Ｂ／Ｃ基因型混合毒株感 染;６个克隆中仅１株为Ｃ基因型。比较２份血清ＨＢＶ ｐｒｅＳ／Ｓ克隆核酸序列,有１７０个点位的差异,剔除Ｃ基因型株 后,仅５４个位点差异。结论克隆后测序结合ＲＦＬＰ对ＨＢＶ基因型测定有助于更准确地对ＨＢＶ基因变异进行动态分 析。     

桂林地区乙肝患者HBV B基因亚型分布研究

目的:研究桂林地区乙肝患者HBV B基因亚型分布特点,为本地区乙型肝炎的防治提供依据.方法:采用巢式PCR技术扩增乙肝患者HBV的S基因,经测序后与标准序列比对,采用Mega 5.0构建系统树进行基因亚型分型.结果:从120例乙肝病毒患者中鉴定出3个以前报告的乙肝病毒亚型,序列分型B2 104例,占86.7％;B4 1例,占0.8％;B5 1例,占0.8％,其中14例未分出亚型,占11.7％.结论:桂林地区HBV B基因亚型主要以B2为主,其次为B4、B5,未发现B1、B3、B6亚型.     

原发性肝癌患者及慢性乙肝病毒携带者肝组织中乙型肝炎病毒X基因的变异

目的:探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)X基因及其变异与原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生、发展的关系。方法:采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,检测22例乙型肝炎表面抗原(hepatitis Bsurface antigen,HBsAg)阳性的HCC患者及15例慢性乙肝病毒携带者(chronic asymptomatic carrier,CAC)患者肝组织中HBVX基因,并对PCR产物进行基因测序,同时检测5例无HBV携带者正常肝脏组织中HBV X基因。结果:22例HCC患者癌组织及15例CAC患者肝组织中HBVX基因检出率分别为68.18%和46.67%,5例正常肝脏组织中均未检测到HBVX基因,差异有统计学意义(P<0.05)。肝癌组织及HBV携带者肝组织中HBV X基因检出率差异无统计学意义(P>0.05)。肝癌组织及携带者肝组织中HBV X基因发生1 762T/1 764A双突变率分别为93.33%和2/7,肝癌组织中双突变率高于携带者肝组织(P=0.004 3),未发现1 762T及1 764A单独发生突变。结论:HCC患者肝组织中HBV X基因检出率高,肝癌组织中发生1762T/1764A双突变的频率高,HBV X基因及1762T/1764A双突变与HCC的发生可能有重要关系。     

HBV变异对乙肝病毒标志物和DNA定量的影响

目的：了解无锡地区HBV前C／C基因变异情况,探讨基因变异对乙肝病毒标志物（HBVM）及HBV DNA定量的影响。方法：HBVM用时间分辨荧光定量试剂检测;HBV DNA定量PCR以德国Roche Lightcycler荧光定量扩增仪检测;HBV DNA前C／C测序使用①德国Roche Mag NA Pure LC全自动核酸提取,加样系统;②美国Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System。结果：92例乙肝患者血清中有41例（44．6％）发生前C／C区nt1896位变异,41例中有34例HbeAg阴性,7例HbeAg仍为阳性;以nt1896位是否变异分组,变异组和未变异组HBV DNA定量无显著性差异。结论：nt1896位变异导致HBeAg转阴,HBV病毒变异对HBVM有决定性的影响,但该变异对HBV复制无影响。     

慢性乙型肝炎免疫清除期患者HBsAg基因多态性研究

目的探讨慢性乙型肝炎免疫清除期患者乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）基因多态性。以寻找与乙型肝炎病毒免疫清除相关的变异位点。方法回顾性分析我院2008年2月~2011年12月感染性疾病科门诊及住院的慢性乙型肝炎免疫清除期患者10例,并设计特异性引物,于10例患者血清中扩增S基因片段,TA克隆法克隆到T载体中,随机选择克隆测序。结果共20个克隆被测序,20个克隆S蛋白发现12个不同位点的32次变异。主要集中在T细胞表位,B细胞表位及a决定簇。结论慢性乙型肝炎免疫清除期患者存在HBsAg变异,可能仍然存在HBsAg免疫耐受。     

深圳市乙肝疫苗免疫失败者S基因分析

目的了解乙肝疫苗免疫失败者的HBVS基因的变异情况。方法采用流行病学、ELISA与分子生物学方法,筛选乙肝疫苗免疫失败者。采用聚合酶链反应（PCR）、基因克隆和测序的方法,对乙肝疫苗免疫失败者的HBVS基因进行分析,并与HBV参考序列s基因进行比较,分析其变异情况。结果从2564份受检者中．筛选出2例（0．78％e）HBsAg（-）／HBeAg（＋）／HBcAb（＋）乙肝疫苗免疫失败者（HBsl、HBs2）,经HBVDNA荧光定量PCR检测和HBVS基因PCR扩增,结果均为阳性,为B基因型。其S基因序列与参考序列（JX429908．1）相比,同源性为98．57％,且乙肝疫苗免疫失败者s基因在第363位和第467位分别由野生型的C变为A、G变为A,HBsAg121位和156位氨基酸C和w缺失。结论乙肝疫苗免疫失败者HBVS基因上第363位和第467位碱基存在错义突变（C→A和G→A）,改变了HBsAg的结构和抗原性。