四种核酸提取试剂盒在新型冠状病毒核酸检测中的比较研究

目的 比较四种核酸提取试剂盒在新型冠状病毒核酸检测中的性能差异,为实验室开展新型冠状病毒核酸检测选择核酸提取试剂盒提供参考依据.方法 从发热门诊收集24例需要检测新型冠状病毒的咽拭子,用四种核酸提取试剂盒平行提取核酸后,比较浓度、纯度、提取效率、重复性和RP基因扩增CT值等参数.结果 四种试剂盒中A试剂盒提取浓度效果最...     

不同提取及扩增方法检测新型冠状病毒核酸的性能比较分析

目的 对磁珠法和释放剂法2种核酸提取方法及扩增时长不同的2种荧光PCR试剂盒检测新型冠状病毒的性能进行比较,为医疗机构对新冠核酸检测试剂盒以及核酸提取方法的选择提供参考依据.方法 将定值质控品稀释成1 000、500、250、125、62.5和31.25 copies/mL 6个不同梯度浓度,根据不同的提取方法与扩增试...     

新冠病毒核酸检测试剂盒的性能分析与评价

目的：对4种新型冠状病毒核酸检测试剂盒的性能包括敏感性与特异性、最低检出限、精密度和分析特异性进行评价,为实验室选择新冠病毒核酸检测试剂盒提供参考,促进新冠肺炎病毒核酸检测技术的创新改进。方法：以20例新冠病毒确诊阳性和10例确诊阴性的咽拭子作为研究样本,经提取得到RNA后根据4种新冠病毒核酸检测试剂盒说明书对其进行检测,分析扩增结果,评估各试剂盒的差异。结果：检测结果显示4种试剂盒对30例研究样本的阴阳性判定情况不尽相同,其中a试剂盒的敏感性和特异性最高,均达到100%;3例阳性样本稀释到100倍时,c试剂盒只能检出其中的1例,而其他三种试剂盒能检出其中的2例,表明c试剂盒的检测敏感性低于其他三种;4种试剂盒在精密度实验中检测样本得到的Ct值的CV值都较接近,且都<10%;加入了8种常见的高浓度干扰物质的临界阳性样本经4种试剂盒检测,结果依然为弱阳性,说明无干扰;4种试剂盒检测5例含非目标病毒的临床样本,检测结果为阴性,即未发生交叉反应。结论：新冠病毒核酸检测试剂盒对低浓度核酸样本的检测能力有所差异,各试剂盒不同的检出限也造成了总体上的敏感性和特异性的差异,实验室在选择新冠病毒...     

新冠病毒核酸检测关键影响因素分析

目的 分析影响新冠病毒核酸检测结果的各种关键因素，提出改善核酸检测质量的具体措施。方法 选择4个品牌的八联管耗材、4种核酸提取试剂、4种核酸扩增试剂和2个品牌荧光定量PCR仪，用新冠病毒核酸阳性质控品，比较耗材、试剂和仪器对新冠病毒核酸检测结果的影响。结果 4种不同厂家的八联管检测结果 Ct值差异有统计学意义（P<0.05），扩增八联管j的阳性质控品ORF1ab基因、N基因和IC基因的检测Ct值最小，荧光强度值最大。4种不同品牌试剂提取的核酸A260/A280比值差异有统计学意义（P<0.05），其中试剂a提取的核酸纯度最高，ORF1ab基因、N基因和IC基因的检测Ct值最小。4种扩增试剂和2种荧光定量PCR仪搭建的8个检测系统对应的ORF1ab、N和IC基因检测Ct值变异系数（CV）均小于5%，具有较好的批内重复性，其中aft检测系统的变异系数最小，批内重复性最好。结论 实验耗材、提取试剂和扩增试剂均可影响新冠病毒的核酸检测结果，建议尽量选择原厂或大品牌的耗材、提取和扩增试剂；在投入使用前做好技术性验收和性能验证，保证检测结果准确性。     

不同核酸提取程序及扩增仪组合检测呼吸道病毒的差异

目的 比较不同核酸提取程序及扩增系统组合在呼吸道病毒检测中的差异。方法 把呼吸道假病毒弱阳性室内质控品稀释成一系列浓度。将不同的核酸提取程序和不同的扩增系统进行混搭组合构建4种检测系统（A、B、C和D）,A为常规核酸提取程序+普通实时荧光定量PCR仪,B为快速核酸提取程序+普通实时荧光定量PCR仪,C为常规核酸提取程序+快速实时荧光定量PCR仪,D为快速核酸提取程序+快速实时荧光定量PCR仪。各检测系统分别提取并扩增上述不同浓度的假病毒弱阳性室内质控品,比较靶基因检出率、循环阈值（Ct值）和批内重复性。结果 在假病毒弱阳性室内质控品原浓度和1∶2稀释度时,4种检测系统均100%检出靶基因;其他稀释度时,靶基因检出率由高到低为A> B> C> D;靶基因Ct值由低到高为A 相似文献   

采样液与核酸提取试剂的匹配性对新型冠状病毒核酸检测结果的影响

目的 分析采样液对新型冠状病毒核酸提取效率的影响，为完善实验室质控措施提供依据。方法 对两批不同品牌采样管（A/B）采集的新型冠状病毒待测标本，分别用两种不同厂家生产的提取试剂（甲/乙）进行核酸提取，用同一品牌的扩增试剂和扩增仪器进行实时荧光RT-PCR检测，分析其检测结果。结果 两种提取试剂对于A采样管的提取效率差异有统计学意义（P<0.05），乙提取试剂阳性检出率高于甲试剂（66.67%vs 20.83%）,ORF1ab平均Ct值低于甲试剂（31.1 vs 38.2）,N基因平均Ct值低于甲试剂（29.9 vs 35.2）。两种提取试剂对于B采样管的提取效率差异不明显（P>0.05）。结论 不同采样管与不同提取试剂匹配效果不同，实验室质量控制中性能验证应加强采样管（液）与提取试剂的匹配性验证。     

可视化核酸等温扩增方法快速检测羊肉源性成分

目的 建立羊肉源性成分核酸等温扩增可视化快速检测方法.方法 用加热煮沸方法直接提取羊肉标本中的DNA;根据羊属特异性的Cytb基因序列的片段设计扩增引物,优化反应体系和反应条件,确立最佳等温扩增温度和扩增时间,对羊肉制品进行可视化等温扩增.并将建立的核酸等温扩增方法与荧光定量PCR法进行实际样品的检测.结果 建立的可视...     

恒温扩增核酸法检测沙门菌属效果分析

目的 观察核酸恒温扩增商品试剂盒对沙门菌属的检测效果.方法 对商品销售的两种恒温扩增检测试剂与普通PCR试剂盒进行检测灵敏度、特异性及操作简便性的比较.结果 常规PCR法A、恒温扩增试剂B及C检测沙门菌属的灵敏度分别为约4×103 CFU/ml、4×103 CFU/ml和约4×104 CFU/ml;对21株临床分离的沙门菌属的检测阳性率分别为76.2％、28.6％和100.0％;用11株非沙门肠道菌株直接检测的特异性均为100.0％;检测过程除常规的核酸提取外,核酸扩增常规法、试剂B、C的核酸检测和结果观察的时间约为2、2、2.5h,以常规法及试剂C的结果观察方式比较方便.结论 试剂C操作时间短、使用方便、检测敏感度及特异性比较好,是一种适用于对沙门菌属快速检测的恒温扩增试剂;对待商品试剂应做好试用工作,以选择好真正适用的产品.     

应用2种TaqMan-荧光定量PCR法快速检测甲型H1N1流感病毒

[目的]应用达安基因H1和N1两对引物检测试剂盒及美国CDC四对引物探针法对流感样病例进行核酸检测,以快速排除甲型H1N1流感病毒的感染.[方法]采用达安基因H1和N1两对引物检测试剂盒对流感样病例进行核酸检测,这些样本同时以美国CDC公布的针对甲型H1N1流感病毒的探针和引物序列以及国家CDC提供的针对季节性流感病毒的探针和引物序列进行检测,与达安基因的甲型H1N1试剂盒进行特异性、准确性的比较.[结果]达安基因甲型H1N1试剂盒和美国CDC的甲型H1N1四对引物法对季节性流感甲1、甲3、乙型的扩增都为阴性,对甲型H1N1确诊病例的病毒核酸扩增都是阳性,应用国家CDC的探针和引物检测为流感病毒核酸阴性的样本用达安基因的甲型H1N1试剂盒及美国CDC的甲型H1N1四对引物法的检测结果也都为阴性.[结论]达安基因的甲型H1N1试剂金及美国CDC的甲型H1N1四对引物法对甲型H1N1流感病毒的检测有高度的特异性,可从疑似甲型H1N1流感患者鼻咽拭子中直接检测流感病毒核酸.     

B族链球菌核酸检测试剂盒临床应用对比评价

目的 通过对比评价不同厂家B族链球菌（group B streptococcus,GBS）核酸检测试剂盒的临床和实验室应用情况,为B族链球菌的临床检测提供参考。方法 利用A和B两个厂家的B族链球菌核酸检测试剂盒平行检测964例临床收集样本中的GBS DNA,同时检测一例临床高值样本梯度稀释后的系列样本;另外利用A、B、C三个厂家对GBS培养菌株进行梯度稀释检测,统计并对比检测结果。结果 A、B两个厂家核酸检测试剂盒阳性符合率100.0%,阴性符合率99.3%,总符合率99.7%,Kappa值为0.994,结果一致性高;两个厂家试剂盒同时检测来源于同一例、不同倍数稀释后的临床样本,结果显示A厂家试剂盒检测灵敏度要高于B厂家试剂盒约两个数量级。对GBS培养菌株进行检测对比,结果显示A厂家试剂盒的检测灵敏度高于或相同于B厂家试剂盒,C厂家试剂盒灵敏度次之。结论 A厂家的B族链球菌核酸检测试剂盒应用于临床GBS的检测,具有方便快捷、灵敏度高的特点。     

人乳头瘤病毒的核酸检测

高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌发生密切相关,低危型感染可引起外生殖器湿疣和宫颈上皮内低度病变。对HPV感染的诊断主要依赖于病毒核酸的检测,方法有探针直接检测、信号放大系统和核酸扩增技术等。其中核酸扩增结合杂交技术对人乳头瘤病毒进行分型,具有较好敏感性和特异性。基因芯片技术具有高通量,自动化等优点,适合人群筛查和流行病学研究。理想的HPV检测方法是具有可调整的临界阳性判定标准以适应不同的需要,同时能进行基因分型。     

单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒在食品检测中的应用

目的研究单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒的准确性和特异性。方法从市场采集自然样品70份,经过2步增菌后,用核酸层析检测试剂盒进行检测,同时用传统方法进行验证。结果 70份样品试剂盒检测阳性3份,阴性67份,而传统方法检测阳性4份,其中1份阳性样品试剂盒检测为阴性。试剂盒检测的准确率达到98.60%。特异性试验表明该剂盒检测标准菌株特异性好,与常见的食源性致病菌均无交叉反应。结论单增李斯特氏菌核酸层析检测层析试剂盒特异性好,检测准确率高,能够满足食品中单增李斯特氏菌检测的需要。     

三种核酸提取方法在甲型流感病毒临床样本检测中的效果对比

目的比较三种核酸提取方法在甲型流感临床样本检测中的效果,为优化甲流病毒临床样本检测效果提供依据。方法在三例口岸送检的甲流临床样本的检测中,分别以硅胶膜法、磁珠法和快速法三种方法提取病毒核酸,以商品化荧光RT-PCR试剂盒或实验室自建荧光RT-PCR体系进行甲型流感病毒和流感病毒H3亚型检测。结果商品化试剂盒检测中,用硅胶膜法提取的三份样本均能检出阳性,而快速法提取的核酸仅能在03号样本中检出,在另外两份样本中未能检出。在自建体系检测中,三种方法提取的核酸均能检出甲流病毒阳性,但快速法检测的Ct值明显高于硅胶膜法和磁珠法。结论对于低病毒浓度样本,硅胶膜法和磁珠法提取核酸的效率更高,快速法有漏筛的风险。     

满洲里口岸蜱类携带斑点热群立克次体的核酸检测及核酸序列分析

目的了解中俄边境地区蜱类自然感染斑点热群立克次体(Rickettsia japonica)的状况,为蜱传斑点热的监测和检测提供技术支持。方法采集鼠类寄生蜱,研磨后提取蜱DNA,利用PCR扩增斑点热群立克次体Omp A基因,对阳性产物进行序列分析。结果在满洲里地区,鼠类体表采集到的蜱类样本,均为全沟硬蜱(Ixodes persulcatus),从8只蜱中检测到斑点热群立克次核酸。序列分析结果表明,其中12号标本中检出的斑点热立克次体与Gen Bank数据库中已注册的斑点热群立克次核酸序列有高度的相似性(98%~99%)。结论应加强对内蒙古满洲里地区蜱传斑点热的监测和检测,防止蜱传疾病的发生。     

乙型流感病毒分子检测中质量控制的研究

目的 优化乙型流感暴发监测中分子鉴定的实验条件。方法 分别以病毒RNA提取试剂盒手工提取和全自动核酸提取工作站提取江苏省暴发标本RNA,采用实时荧光定量RT—PCR检测看家基因核糖核酸酶P（RNaseP）和乙型流感核蛋白（B—NP）基因;分别以本实验室建立的RT—PCR扩增体系和进口商品化RT—PCR扩增体系,对乙型流感基质蛋白（B—M）基因进行检测。结果 看家基因RNaseP能有效监测采样和RNA纯化的有效性;手工提取RNA的效率高于自动提取;进口商品化RT—PCR体系的扩增M基因效果较好。结论 以手工法提取RNA,以real—timeRT—PCR检测B—NP基因和以进口商品化RT—PCR扩增体系检测B—M基因,能相对客观地反映病毒流行现状。     

三门县2010年手足口病核酸检测结果分析

目的:分析三门县2010年手足口病疑似患者的核酸检测结果,为手足口病的防控工作提供科学依据。方法:选取2010年4月-2010年9月手足口病患者34个病例45份咽拭子、疱疹液样品,提取病毒RNA,RT-PCR一步法检测EV71的Vp3-Vp1区基因及Cox-A16的Vp3～Vp1区基因,比较二者阳性率。结果:45份标本总肠道病毒核酸检测阳性43份,其中肠道病毒CoxA16核酸阳性的有26份,肠道病毒EV71核酸阳性的有11份,CoxA16核酸和EV71核酸均为阳性的有6份。结论:手足口病核酸检测总肠道病毒核酸检测阳性率较高,且以Cox-A16及EV71为主,RT-PCR检测核酸阳性情况,对手足口病的早期诊断及传染性判断有着重要指导价值。     

两种新冠病毒核酸检测系统检测结果的比对分析

目的 对不同新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测方法进行比较和分析,探讨核酸提取扩增检测一体化的实时荧光定量PCR系统的应用价值。方法 2020年1月—10月于新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)复核样本库中随机抽取确诊病例和排除病例的灭活咽拭子标本,共计10份。采用盲法随机编号,同时使用全自动医用PCR分析系统GeneXpert DX system和ABI QuantStudio Dx实时定量PCR检测系统进行检测,每组均进行平行检测,利用四格表法对结果进行一致性分析。结果 检测结束后揭盲,所有样本纳入统计分析,无剔除数据。经检测,两种方法对8例新冠病毒确诊病例咽拭子检测结果均为阳性,2例排除病例咽拭子检测结果均为阴性;两种方法检测结果一致性好(Kappa系数=1,P值=0.002);使用方法A检测前处理时间为30秒,结果报告时间为48分钟;在核酸检测过程中检测人员与样本接触时间短,气溶胶危险较低,试剂盒全程密封,实验完成后标本处理安全性高。结论 方法A与方法B在新型冠状病毒核酸检测中结果一致,方法A具备操作环节简单、生物安全风险系数小、检测更为快速等优点。     

应用长臂光敏生物素核酸探针检测医学真菌的研究

[目的]建立PCR结合长臂光敏生物素核酸探针杂交检测医学真菌的方法。[方法]首先合成医学真菌通用引物，用PCR扩增白色念珠菌18S rRNA基因，用长臂光敏生物素标记纯化的扩增产物作为核酸探针，然后用此探针对PCR后的基因扩增产物进行Southern杂交检测医学真菌。通过用白色念珠菌感染人鼠，建立念珠菌病的实验动物模型，验证血培养法、PCR法和PCR扩增及Southern杂交检测医学重要真菌的敏感性。[结果]通用引物可以扩增白色念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌、黄曲霉菌、烟曲霉菌等9种医学常见真菌的18S rRNA基因，扩增片段长度为621-687bp。此引物只扩增真菌DNA，不扩增临床常见的细菌、病毒和哺乳动物组织细胞DNA。利用实验动物模型比较了血培养法、PCR法和PCR扩增及长臂光敏生物素核酸探针Southern杂交法检测真菌血症的灵敏度，实验证明后者的敏感性最高。[结论]本方法快速、敏感、不需放射性同位素，有较好的临床应用前景。     

依赖核酸序列的扩增技术在诺如病毒基因检测中的应用

目的将一种新颖的核酸扩增技术-依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)应用于诺如病毒的快速检测与辅助诊断。方法根据NCBI诺如病毒RdRp基因保守序列设计特异性引物,建立NASBA检测方法,同时验证该方法的特异性、灵敏度和重复性,并利用所建立的NASBA检测方法对临床收集的108例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测。结果本文建立的NASBA检测方法对诺如病毒具有高度特异性,与轮状病毒等腹泻相关病毒均无交叉反应,反应体系具有很高的稳定性;灵敏度高,即诺如病毒最低检测线为20 pg/μl;检测周期短,NASBA反应在42℃90 min即可进行有效扩增,3 h~4 h即可完成样品中目标基因的筛选。结论本研究应用的诺如病毒NASBA检测方法特异性好、灵敏度高、快速易操作,尤其适用于诺如病毒的日常监测和暴发疫情的应急诊断。     

芯片电泳在免核酸提取PCR产物分析中的应用

目的探讨两种免核酸提取试剂联合应用DNA芯片电泳是否能快速、准确地用于新德里金属酰胺酶(NDM-1)阳性细菌的鉴定,了解该联合检测方法在流行病病原体快速鉴定中的应用价值,为流行性病原体的快速鉴定提供便捷手段。方法取1个(或0.1个)麦氏单位NDM-1(+)菌液加入免核酸提取试剂后直接进行PCR扩增,扩增产物用自制的芯片电泳进行产物分析,通过样品迁移时间与标准品比较精确计算出目的基因片段长度并大致推算产物的含量。结果两种免核酸提取试剂联合芯片电泳分析技术能快速、准确、高效地扩增出新德里金属酰胺酶NDM-1(+)细菌的目的基因片段,尤其湖南某厂家的试剂灵敏度更高。结论该联合检测方法在流行病尤其是突发性病原体的快速鉴定、监测中具有潜在的临床应用价值。