过氧化氢对金属硫蛋白Ⅰ／Ⅱ敲除小鼠脾细胞的氧化应激

背景：脑缺血再灌注早期,由于脾脏中有大量炎症因子浸润引发氧化应激损伤,导致脑缺血再灌注后脾细胞出现大量凋亡。目的：观察外源性过氧化氢对金属硫蛋白Ⅰ/Ⅱ敲除小鼠脾细胞活力的影响及N-乙酰-L-半胱氨酸对过氧化氢诱导的脾细胞氧化应激损伤的保护作用。方法：制备金属硫蛋白敲除小鼠脾细胞悬液,分别用不同浓度（0．1,0．2,0．5,1,2mmol／L）过氧化氢处理2h后,MTT比色法检测细胞活力。根据MTT结果选择不同浓度过氧化氢（0．5,1mmol／L）诱导脾细胞凋亡,实验分为6组：对照组、N-乙酰-L-半胱氨酸组、0．5mmol／L过氧化氢组、1mmol／L过氧化氢组、N-乙酰-L-半胱氨酸＋O.5mmoI／L过氧化氢组、N-乙酰-L-半胱氨酸＋1mmol／L过氧化氢组,2h后MTT比色法检测细胞活力,酶标仪法检测乳酸脱氢酶活力及紫外分光光度仪检测线粒体通透性转换孔的开放情况。结果与结论：随过氧化氢浓度增加脾细胞活力呈明显下降趋势（P〈0．01）,且0．2,0．5,1,2mmol／L过氧化氢组脾细胞活力下降幅度最大。与对照组相比,N-乙酰-L-半胱氨酸组脾细胞活力明显提高（P〈O．01）,且乳酸脱氢酶活力降低（P〈0．01）,线粒体通透性转换孔开放减少（P〈0．01）;分别于0．5,1mmol／L过氧化氢组相比,N-乙酰-L-半胱氨酸＋O．5mmol／L过氧化氢组、N-乙酰-L-半胱氨酸＋1mmol／L过氧化氢组脾细胞活力也明显提高（P〈0．01）,乳酸脱氢酶活力降低（P〈0．01）,线粒体通透性转换孔开放减少（P〈0．01）。结果表明,金属硫蛋白Ⅰ/Ⅱ敲除小鼠随着过氧化氢浓度的升高,脾细胞活力逐渐下降,呈浓度依赖性,尤其对0．2,0．5,1,2mmol／L过氧化氢刺激最为敏感。N-乙酰-L-半胱氨酸使乳酸脱氢酶释放和线粒体通透性转换孔的开放减少,脾细胞活力增强,以此减轻过氧化氢诱导的金属硫蛋白Ⅰ/Ⅱ敲除鼠脾细胞的氧化应激损伤。     

小鼠2型金属硫蛋白基因的克隆

目的 构建含有小鼠Ⅱ型金属硫蛋白（MT）基因的真核表达载体,为进行MT抗氧化作用的体内功能实验奠定基础。方法 采用重叠延伸PCR技术设计两对引物,利用引物间的互补序列作为模板合成小鼠Ⅱ型MT基因。结果 将PCR产物经连接反应,连接产物转化JM109,摇菌后提取质粒,质粒的酶切鉴定及最后的测序结果均表明本实验所获得的小鼠Ⅱ型MT基因与GENEBANK中的目标基因序列完全一致。结论 本实验通过重叠PCR技术成功构建了小鼠Ⅱ型MT编码基因,重叠PCR技术是合成目的基因片段的有效的手段。     

金属硫蛋白检测方法的研究进展

金属硫蛋白(metallothioneins，MTs)是一类普遍存在的低分子量(约6500Da)热稳定性蛋白．富含半胱氩酸，与某些金属阳离子有高度亲和力(如Ag^ ，Cd^2 ．Hg^2 ，Cu^2 等)。MT结构分析表明其含有两个结构域：α结构域和β结构域，分别结合4个和3个共价金属离子。MT生物学作用广泛，主要参与机体的重金属解毒和微量金属代谢。     

钥孔戚血蓝蛋白诱导Balb/C小鼠脾细胞Th1/Th2失衡

背景:建立具有一定特征的、稳定的、可重复性强的Th1/Th2失衡动物模型是研究Th1/Th2失衡机制的重要基础.目的:分析钥孔戚血蓝蛋白诱导Balb/C小鼠脾细胞Th1/Th2失衡的特点.设计:随机对照探索性实验.单位:河北医科大学基础医学院河北省法医学实验室.材料:实验于2005-09/2007-02在河北医科大学基础医学院河北省法医学实验室完成.实验选用Balb/c小鼠,对动物处置方法符合动物伦理学要求.方法:①以钥孔戚血蓝蛋白 完全弗氏佐剂免疫Balb/C小鼠,分离脾细胞,细胞因子分泌高峰点测定实验分为3组,分别为钥孔戚血蓝蛋白6.25,12.5,25 mg/kg组:不同免疫剂量和免疫次数实验分为7组.分别为钥孔戚血蓝蛋白6.25,12.5,25 me/kg组,6.25,12.5,25 mg/kg二次免疫组及对照组.主要观察指标:以酶联免疫吸附法检测小鼠脾细胞培养上清中Th1型细胞因子γ-干扰素、白细胞介素2、白细胞介素12 p40及Th2型细胞因子白细胞介素4、白细胞介素5的分泌量及血清中Th1型抗体IgG2a和Th2型抗体IgG1水平.结果:①钥孔戚血蓝蛋白免疫使小鼠出现脾肿大,脾细胞计数增高.②体外同种抗原再刺激使免疫小鼠脾细胞培养上清中4种细胞因子浓度增高,其中白细胞介素2分泌量于24h即明显增高,48 h达高峰:白细胞介素4、γ-干扰素和白细胞介素5在24 h轻度增高,以后逐渐上升,96 h达高峰.各时间点培养上清中白细胞介素12p40含量均较低,与对照组无明显差异.③不同剂量单次或二次免疫均可致4种细胞因子不同程度增高,白细胞介素4/γ-干扰素比值增高,其中12.5 mg/kg钥孔戚血蓝蛋白二次免疫组细胞因子分泌量明显高于其他各组(P＜0.01).④钥孔戚血蓝蛋白免疫小鼠血清IgG1,IgG2a水平发生不同程度增高,其中IgG1增高更为明显.结论:钥孔戚血蓝蛋白加完全弗氏佐剂可诱导Balb/C小鼠脾细胞发生Th2型优势反应.     

胎盘组织中3种细胞金属硫蛋白表达的免疫组化研究

目的探讨胎盘组织中蜕膜细胞、合体滋养层细胞及Hofbauer细胞金属硫蛋白（metallothionein,MT）表达的意义及其相关性。方法采用免疫组织化学法检测178例足月胎盘组织中MT的表达情况。结果胎盘组织蜕膜细胞、合体滋养层细胞及Hofbauer细胞MT表达的阳性率分别为49．69％（80／161）、53．37％（95／178）、33．15％（59／178）;胎盘组织3种类型细腿MT的表达强度有等级相关性（P〈0．0001）;胎盘组织3种类型细胞之间MT的表达差异有统计学意义（P〈0．0001）。结论胎盘组织蜕膜细胞、合体滋养层细胞及Hofbauer细胞可有MT的表达,提示MT在胎盘的屏障作用及物质转运中可能起着很重要的作用。     

芒果苷改善过氧化氢诱导帕金森细胞模型的 氧化应激损伤

目的:观察芒果苷对过氧化氢(H_2O_2)诱导SH-SY5Y细胞建立帕金森病细胞模型的细胞损伤的保护作用,并探讨其作用的分子机制。方法:培养SH-SY5Y细胞,分为空白对照组(PBS平行处理)、模型组(含100μmol/L的H_2O_2培养基处理细胞4 h)、芒果苷高、中、低剂量组(先用含芒果苷100 nmol/L、50 nmol/L、25 nmol/L的培养基处理4 h后,加入200μmol/L的H_2O_2培养基处理细胞4 h)。采用MTT法检测芒果苷对损伤的SH-SY5Y细胞活力的影响;western-blot检测SH-SY5Y细胞中DUSP6、ERK1/2、Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表达水平;试剂盒检测培养基中乳酸脱氢酶(LDH)水平、细胞内丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。结果:与空白对照组相比,模型组细胞存活率显著降低,LDH和MDA水平升高,SOD水平降低。与模型组比较,芒果苷高、中、低剂量组细胞存活率显著升高,LDH和MDA水平降低,SOD水平升高。与空白对照组相比,模型组中的DUSP6蛋白表达增加,p-ERK1/2蛋白表达减少;与模型组比较,芒果苷高、中、低剂量组DUSP6蛋白表达减少,p-ERK1/2蛋白表达增加。与空白对照组相比,模型组中的Nrf2和HO-1蛋白表达减少,Keap1蛋白表达增多;与模型组比较,芒果苷高、中、低剂量组Nrf2和HO-1蛋白表达增多,Keap1蛋白表达减少。结论:芒果苷对H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有显著的保护作用,其机制可能与芒果苷调控DUSP6/ERK1/2与Keap1/Nrf2通路,改善氧化应激相关。     

锌7-金属硫蛋白对深Ⅱ度烧伤创面脂质过氧化反应的影响

背景:研究表明锌-金属硫蛋白具有明显的清除氧自由基和保护生物大分子的功能.目的:观察锌7-金属硫蛋白对大鼠深Ⅱ度烧伤创面脂质过氧化反应的影响及在创面愈合中的作用.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-10/2009-01在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所第二研究室完成.材料:健康雄性Wistar大鼠78只,随机分为2组,锌7-金属硫蛋白保护组、生理盐水组各36只,各组观察时相点为伤后12,24,48 h及7,14,21 d,每时相点6只.方法:将大鼠背部置于98℃水中8 s,造成大鼠背部15%的深Ⅱ度烫伤创面.2组均于伤后即刻给药,锌广金属硫蛋白保护组与生理盐水组分别外敷单层纱布浸润的浓度为1×105mol/L的锌7-金属硫蛋白以及等渗盐水,第1天每4 h换药1次,第2,3天每8 h换药1次,此后每日换药1次,直至创面愈合.主要观察指标:伤后7 d开始采用硬纸片质量间接法测创面愈合率.伤后各时相点取创面组织标本(创面已愈合则取瘢痕组织),分别测羟脯氨酸、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性.结果:伤后7,14,18,21 d锌7-金属硫蛋白组创面愈合率高于生理盐水组(P<0.05);且锌7-金属硫蛋白组伤后48 h,7 d,14 d,超氧化物歧化酶活性降低程度和丙二醛含量升高程度与生理盐水组比较差异有显著性意义(P<0.05);锌7-金属硫蛋白组在伤后48 h,7 d羟脯氨酸含量减少程度显著低于生理盐水组(P<0.05),且在14 d时含量已接近正常水平.结论:锌7-金属硫蛋白对大鼠深Ⅱ度烧伤创面有促愈合作用,其促愈机制与使用锌7-金属硫蛋白后创面脂质过氧化反应程度减轻有关.     

心肌氧化应激损伤中硫氧还蛋白的作用

目的:探讨硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)在心肌氧化应激损伤中的作用并分析其机制。方法:本研究选用Wistar大鼠16只,体质量180～200g,随机分为2组:冰泳负荷组和对照组,每组8只。让冰泳负荷组大鼠在冰水浴中泳动5min,用透射电镜观察心肌损伤情况,采用northernblot和westernblot杂交方法检测心肌组织中硫氧还蛋白的蛋白和基因表达变化。结果:我们透射电镜下观察到,冰泳负荷组大鼠心肌细胞及线粒体受到损伤,对照组心肌细胞未发生异常改变。northernblot和westernblot杂交结果显示,冰泳负荷组大鼠心肌TRX基因水平较对照组升高,同时冰泳负荷组大鼠心肌TRX蛋白含量也比对照组增加。结论:TRX蛋白在心肌的氧化应激防御反应中起重要作用。     

心肌氧化应激损伤中硫氧还蛋白的作用

目的：探讨硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)在心肌氧化应激损伤中的作用并分析其机制。方法：本研究选用Wistar大鼠16只，体质量180～200g，随机分为2组：冰泳负荷组和对照组，每组8只。让冰泳负荷组大鼠在冰水浴中泳动5min，用透射电镜观察心肌损伤情况，采用northern blot和western blot杂交方法检测心肌组织中硫氧还蛋白的蛋白和基因表达变化。结果：我们透射电镜下观察到，冰泳负荷组大鼠心肌细胞及线粒体受到损伤，对照组心肌细胞未发生异常改变。northern blot和western blot杂交结果显示，冰泳负荷组大鼠心肌TRX基因水平较对照组升高，同时冰泳负荷组大鼠心肌TRX蛋白含量也比对照组增加。结论：TRX蛋白在心肌的氧化应激防御反应中起重要作用。     

跑台运动训练对apoE基因敲除小鼠高同型半胱氨酸血症及氧化应激的影响

目的:研究跑台有氧运动训练对血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平及氧化应激的影响,探讨其可能机制,为进一步探寻延缓高同型半胱氨酸血症(HHcy)致动脉粥样硬化的有效方法提供依据。方法:6周龄雌性apoE-/-小鼠随机分为三组:对照组、HHcy组和HHcy+有氧运动组。饮用水中加入Hcy(1.8g/L)制作HHcy模型。HHcy+有氧运动组在1周适应性训练后进行8周跑台训练(0°,15m/min,60min/d,每周训练5天,间隔2天)。采用酶法检测血浆Hcy及血脂水平。羟胺法试剂盒检测血浆超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果:与对照组相比,HHcy组血浆Hcy水平明显增高(P=0.001),HHcy+有氧运动组血浆Hcy水平较HHcy组明显下降(P=0.016)。三组之间体重增长,饮水量及血浆总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、甘油三酯水平差异无显著性意义。HHcy组小鼠血浆SOD活性较对照组显著降低(P=0.014),而有氧运动使HHcy小鼠血浆SOD活性明显增高(P=0.035)。结论:有氧运动可以降低HHcyapoE-/-小鼠血浆同型半胱氨酸水平,延缓同型半胱氨酸血症,上调氧化应激因子表达水平,改善氧化应激水平,而且该作用独立于血脂水平的改变。     

小胶质细胞介导帕金森病小鼠的氧化应激损伤

背景：研究证实,小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶可增加多巴胺能神经元对百草枯的摄取。造成百草枯对多巴胺能神经元的特异性杀伤作用。帕金森病的黑质纹状体存在小胶质细胞的激活,但其产生氧化应激作用机制尚不明确。目的：建立帕金森病小鼠模型,观察小胶质细胞介导的氧化应激损伤在帕金森病中的作用。方法：36只C57BL／6小鼠随机分为帕金森病模型组和对照组,每组18只。以腹腔注射百草枯10mg／kg为模型组,等体积生理盐水为对照组,分别观察小鼠行为活动改变。采用高效液相法测定两组小鼠黑质纹状体多巴胺的含量及免疫组织化学方法检测两组小鼠黑质部位酪氨酸羟化酶、mac-1蛋白表达,同时应用化学比色法测定两组小鼠黑质部位超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶活性和丙二醛水平的变化。结果与结论：模型组小鼠自发行为活动较对照组减少（P〈0．05）。高效液相法检测模型组小鼠黑质纹状体多巴胺含量及酪氨酸羟化酶蛋白的表达均显著低于对照组（P〈0．05）,mac-1蛋白表达高于对照组（P〈0．05）。模型组超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶活性较对照组均显著下降（P〈0．05）,丙二醛水平较对照组显著升高（P〈0．05）。提示中脑黑质部位小胶质细胞的激活致使氧化应激反应增强及抗氧化保护作用减弱可能是引起帕金森病发病的重要机制。     

敲除SIRT1对急性髓细胞白血病小鼠白血病细胞凋亡及细胞周期的影响

目的探讨急性髓细胞白血病小鼠SIRT1表达及对白血病细胞凋亡及细胞周期的影响。方法 C57BL/6J小鼠10只,随机分为观察组和对照组各5只。2组小鼠应用半致死剂量X射线(4.75 Gy)照射7 min后,经尾静脉移植2.5×10~5个病毒感染的白血病细胞制备急性髓细胞白血病模型。移植第14天,观察组腹腔注射pIpC溶液5 mg/kg,隔天注射1次,共3次,诱导SIRT1敲除;对照组注射等量生理盐水。移植第24天处死2组小鼠,取股骨骨髓提取白血病细胞,采用实时荧光定量PCR法检测SIRT1 mRNA、细胞周期蛋白依赖性激酶1 mRNA、p19 mRNA、p21 mRNA、p27 mRNA相对表达量,采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果观察组SIRT1 mRNA相对表达量(0.11±0.01)低于对照组(1.01±0.01)(P0.05),p19 mRNA、p21 mRNA、p27 mRNA相对表达量(3.76±0.22、1.53±0.06、2.23±0.02)高于对照组(1.01±0.01、1.02±0.01、1.01±0.01)(P0.05),细胞周期蛋白依赖性激酶1 mRNA相对表达量(1.05±0.02)与对照组(1.01±0.02)比较差异无统计学意义(P0.05)。观察组细胞凋亡率[(30.3±0.3)%]与对照组[(27.3±0.4)%]比较差异无统计学意义(P0.05)。观察组G_0期细胞比率[(55.22±0.60)%]高于对照组[(19.20±0.30)%](P0.05),G_1期、S/G_2/M期细胞比率[(24.20±0.50)%、(20.10±0.30)%]与对照组[(56.11±0.60)%、(24.38±0.40)%]比较差异无统计学意义(P0.05)。结论敲除SIRT1不影响急性髓细胞白血病小鼠白血病细胞凋亡,可使白血病细胞停滞于G_0期,其机制可能与上调细胞周期抑制基因p19、p21、p27表达有关。     

静脉注射过氧化氢对小鼠血红蛋白的氧化作用

给小鼠静脉注射过氧化氢后,测得其高铁血红蛋白含量明显较对照组增高,红细胞内的过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性与对照组差异无显著性。结果提示红细胞内的抗氧化酶系统的保护能力有限,不能及时清除外源性的过氧化氢,从而造成过氧化氢对红细胞中的血红蛋白进行氧化破坏,继而引起红细胞的破溶。     

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肾脏缺血/再灌注金属硫蛋白含量的影响

目的在大鼠离体肾脏缺血／再灌注（I／R）损伤模型上，观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对肾脏金属硫蛋白（MT）的影响，探讨bFGF肾脏保护作用的可能机制。方法复制离体肾脏I／R损伤模型。预先24h应用bFGF，以[Cd^109]-血红素饱和法测定肾脏MT含量，同时测定血清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量。结果肾缺血组、缺血／再灌注组及bFGF治疗组血浆SOD均非常显著低于对照组，而MT、MDA非常显著高于对照组（P〈0．01）；bFGF＋缺血组血浆SOD较缺血组略高，MT、MDA较缺血组略低，两者差异无显著性（P〉0．05）；bFGF＋缺血／再灌注组SOD较缺血／再灌注组非常显著升高，MT、MDA较缺血／再灌注组非常显著降低（P〈0．01）。结论MT参与了bFGF对大鼠离体肾脏缺血／再灌注损伤肾脏保护作用。     

利用流式监控高质量小鼠脾细胞的制备

目的 流式技术监控小鼠脾细胞裂解过程,在确保脾淋巴细胞高活力的同时,充分裂解其中的红细胞.方法 以流式细胞术监控ACK和Tris-NH4Cl两种红细胞裂解液的裂解效果,通过细胞融合率判断淋巴细胞活力.结果 结合FSC和PI荧光强度分析,在确保淋巴细胞相对存活率大于或等于90%的前提下,ACK处理0.5～1 min即可去除90%以上的红细胞,Tris-NH4Cl处理10 min也可去除82%的红细胞,获得的淋巴细胞的融合效率为85%～90%.结论 流式细胞术能够实时监控ACK和Tris-NH4Cl的裂解过程,获得高质量的脾淋巴细胞以适用于杂交瘤细胞的制备.     

诱导生物合成金属硫蛋白对顺铂引起血液毒性的影响

顺铂对小鼠血液系统具有毒性作用,而组织中金属硫蛋白(metallothionein,MT)的产生能减轻其毒性反应。本实验观察了甘草锌(Gly-Zn),富硒麦芽(Se-malt)和亚硒酸钠(Na_2SeO_3)等含微量元素的药物对诱导组织产生MT的作用及对顺铂引起血液系统毒性的影响。结果表明:富硒麦芽的MT诱导作用最强,其次为亚硒酸钠和甘草锌。甘草锌、富硒麦芽和亚硒酸钠对顺铂引起的小鼠血液系统毒性具有明显的保护作用,由此提示了在应用含锌、硒等微量元素药物降低顺铂引起重金属中毒时,诱导生物合成MT增加,可能是其中重要的机理之一。     

地塞米松诱导金属硫蛋白表达对大鼠缺血/再灌注损伤心肌的保护作用研究

目的 探讨地塞米松诱导金属硫蛋白(MT)表达对大鼠缺血/再灌注(I/R)损伤心肌的延迟保护作用.方法 将32只SD大鼠随机分成地塞米松组和对照组,分别予腹腔注射地塞米松和蒸馏水预处理.预处理24 h后构建Langendorff离体心脏I/R动物模型,缺血30 min后再灌注60 min.用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测MT表达;动态观测缺血前及再灌注期间血流动力学指标[左心室发展压(LVDP)、左室内压上升和下降最大速率(±dp/dt max)、冠状动脉循环流出量(CF)]、心律失常的变化;测定心肌梗死面积、冠状动脉流出液肌酸激酶同工酶(CK-MB)漏出率、心肌丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、铜锌-SOD(CuZn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)水平及心肌细胞膜Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性.结果 与对照组比较,地塞米松组MT的表达水平显著增加(3.085±1.065比1.028±0.016,P＜0.05);再灌注期间LVDP、±dp/dt max及CF均得到明显改善(P均＜0.05);再灌注性室性心律失常评分明显减少[(2.00±1.41)分比(6.63±4.24)分,P＜0.05];心肌梗死面积明显缩小[(28.38±11.22)%比(47.39±8.30)%,P＜0.01];冠状动脉流出液CK-MB的漏出率明显降低[(8.69±4.16)U/g比(18.15±5.59)U/g,P＜0.01];心肌组织MDA含量降低(P＜0.05),T-SOD、CuZn-SOD、CAT、GSH-Px均明显升高(P＜0.05或P＜0.01);心肌细胞膜的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性增加(P＜0.01和P＜0.05).结论 地塞米松可能通过上调MT的表达,对大鼠I/R损伤心肌起到延迟保护作用.