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1.
目的:建立能表达抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因的转基因植株,为汉坦病毒基因工程抗体的研究提供实验基础.方法:将构建的含抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因的植物抗体表达质粒3G1MH-pCAMBIA2301,用TSS冻融法导入农杆菌GV3101,利用农杆菌介导的抽真空转基因技术转化野生型拟南芥,获得转基因植株.用PCR、Northern blot检测转基因植株.结果:经PCR分析表明,拟南芥的基因组中有抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因整合,并成功获得7株T0代转基因拟南芥.植株提取RNA,经Northern blot分析可见约1 500 bp及800 bp处的目的条带,为编码重、轻链的目的基因.结论:成功地构建了含抗汉滩病毒中和性鼠/人嵌合抗体基因的拟南芥植株,为进一步利用植物表达治疗性抗体奠定了基础. 相似文献
2.
目的:构建人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体pSeetag2/seFv并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中获得表达.方法:利用噬菌体细胞内重组技术筛选得到了肝癌特异性scFv,用PCR技术及核酸内切酶技术将其克隆入真核表达载体psectag2,构建重组载体pSectag2/scFv,测序鉴定后,电转染CHO细胞,利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达情况.结果:将750 bp人源肝癌scFv插入真核表达载体pSectag2,经DNA测序鉴定正确,成功构建了pSectag2/scFv.将pSectag2/scFv转染CHO细胞后获得目的蛋白表达.SDS-PAGE和Western blot检测表明目的蛋白Mr约为34 000.结论:成功地构建抗scFv真核表达载体pSectag2/scFv,并在CHO细胞中获得表达,为人源肝癌scFv的进一步的应用研究提供依据. 相似文献
3.
抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3单链抗体的制备及免疫组织化学研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 研制抗丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3的人源噬菌体单链抗体,并探讨其在临床诊断中的应用价值。方法 以重组的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3为固相抗原,利用亲和筛选的原理,从噬菌体抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点免疫杂交试验和DNA序列分析,获得HCV NS3的人源单链抗体;用该抗体与不同来源的HCV NS3抗原进行反应;对10例石蜡包埋的丙型肝炎患者肝组织进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明,所制备的HCV NS3人源单链抗体能与不同来源的HCV NS3抗原特异性结合(吸光度A值为1.38);免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别丙型肝炎患者肝组织HCV NS3抗原,与正常肝组织及乙型肝炎病毒(HBV)的表面抗原均无交叉反应。结论 此法制备的单链抗体亲和性好,特异性强,且制备方法简便,周期短,可用于HCV NS3病原的检测。 相似文献
4.
目的尝试将CEA单链抗体在大肠杆菌中进行高效表达。方法以CEA单链抗体基因为模板,设计4对引物,PCR扩增,将4条DNA扩增片段分别插入原核表达载体pBV220中;重组质粒转染大肠杆菌TG1,42℃热诱导外源蛋白的表达;包涵体经8mol/L脲溶解及谷胱甘肽系统复性;过离子交换柱进行纯化;ELISA夹心法测活性。结果得到了SD序列与起始密码ATG分别相隔着5,6,7,8个核苷酸的重组质粒;SDS-PAGE显示转染入重组质粒的TG1菌经热诱导后有分子量约为3×104的外源蛋白,表达量最高达930mg/L培养液,约占菌体总蛋白的50%;ELISA活性测定结果表明复性后的ScFv有较高的抗原结合活性。结论CEA单链抗体在大肠杆菌中获得了较高水平的表达,且经复性后有较高的抗原结合活性。 相似文献
5.
抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体单链抗体ScFv的构建和表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:克隆抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体ScFv。方法:从分泌抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中提取总RNA,利用RT-PCR技术,克隆该抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过基因重组构建VH-VL的表达载体pTAT-ALI,转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达。结果:VH基因序列全长369碱基对,编码123个氨基酸,VL基因序列全长339碱基对,编码113个氨基酸,二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FRs)、3个抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的两个半胱氨酸残基。ELISA测定显示基因工程抗体ScFv与原代抗体一样,具有较高的抗原亲和力。结论:成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体ScFv基因并表达于细菌壁膜间隙和包涵体中,为溶藻弧菌独特型抗体单链抗体ScFv成为新一代基因工程疫苗奠定了初步基础。 相似文献
6.
汉滩病毒Z10株G1糖蛋白编码区克隆及序列分析 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 汉滩病毒浙10(Z10)株G1糖蛋白编码区的克隆、核苷酸序列分析,提供我国应用最为广泛的肾综合征出血热(HFRS)疫苗株序列资料。方法 反转录PCR法扩增G1基因片段,克隆入pGEM-T载体,双脱氧链终止法测定核苷酸序列。结果 测定1449个核苷酸,可编码483个氨基酸。与I型76/118、Lee、Hojo株比较核苷酸同源性分别为87%、86%、86%,与Ⅱ型R22株同源性为67%。比较氨基 相似文献
7.
目的在本室前期工作的基础上构建汉滩病毒M基因G1片段与S基因0.7kb片段嵌合基因的重组腺病毒。方法构建含有汉滩病毒G1S0.7嵌合基因的转移载体pShuttle-G1S0.7,然后通过特异性的酶切将嵌合基因与腺病毒DNA相连,电转化E.coli JM109,获得重组腺病毒Adeno-G1S0.7 DNA,转染HFX293细胞得到重组腺病毒。进一步对重组腺病毒的滴度和表达产物进行鉴定。结果构建的含G1S0.7嵌合基因的重组腺病毒,滴度可达10^13~10^15 PFU/L;该重组腺病毒感染Vero-E6细胞后,表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1的特异性单抗(mAb)所识别的融合蛋白。结论利用腺病毒表达系统,成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G1生物学活性的融合蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。 相似文献
8.
从重组人GCSF免疫小鼠全套单链抗体噬菌体表面展示文库中, 筛选到3 个具有GCSF抗原结合活性的重组噬菌体单链抗体基因。将其感染不含Sup E的E. coli 菌株, 获得以ScFvEtag 形式的目的抗体片段的可溶性表达。经ELISA和Dotblot 检测, 表达产物具有与GCSF抗原结合的活性。NFS60 细胞株抑制实验初步表明, 表达产物具有抑制GCSF的作用。 相似文献
9.
抗人纤维蛋白噬菌体单链抗体库的构建和鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
目的应用噬菌体展示技术构建抗人纤维蛋白单链抗体(scFv)文库,筛选高亲和力抗人纤维蛋白scFv并进行鉴定。方法利用人纤维蛋白免疫小鼠,分别扩增小鼠VH和VL基因,经重叠延伸聚合酶链反应(PCR)将VH和VL基因拼接成scFv基因,SfiⅠ/NotⅠ双酶切克隆入pCANTAB 5E噬菌粒载体,转化E.coli TG1构建成库,采用人纤维蛋白原对抗体库进行负筛选,人纤维蛋白进行正筛选,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测阳性克隆的抗原特异性并进行测序分析。结果构建了库容为8.7×106的抗人纤维蛋白scFv库,ELISA测定显示scFv具有较高的抗原特异性;抗人纤维蛋白scFv基因序列长732 bp,编码244个氨基酸,VH和VL基因均有明确的3个互补决定区和4个骨架区。结论成功构建了抗人纤维蛋白scFv文库,并筛选到高亲和力的抗人纤维蛋白scFv,为新型血栓显像剂的开发奠定了实验基础。 相似文献
10.
目的:真核表达抗CD3单链抗体(scFv),并研究其生物学活性。方法:将编码抗CD3 scFv的DNA片段插入真核表达载体pDisplay中。对所构建重组表达载体进行测序确认后,以电穿孔法将重组质粒导入Hela细胞,以原位杂交法检测抗CD3 scFv的表达,以3H TdR掺入法检测其在体外对T细胞的活化作用,以MTT比色法观察转染的。Hela细胞与T细胞混合培养后,诱发的细胞毒性T细胞的杀伤作用。结果:成功地构建了抗CD3 scFv的真核表达载体,并在Hela细胞中获得表达。所分泌的抗CD3 scFv在抗CD28mAb存在的条件下,能够刺激T细胞活化。将转染的Hela细胞与T细胞混合培养能够诱发CTL的杀伤作用。结论:真核表达的抗CD3 scFv具有刺激T细胞活化的活性,可用于构建对肿瘤进行免疫治疗的双功能分子。 相似文献
11.
目的 :在真核细胞中表达抗汉坦病毒NP抗原鼠源性单克隆抗体 (mAb) 1A8的scFv ,并检测表达产物的活性。方法 :将真核表达载体 1A8 scFv Cκ/pCI neo用脂质体转染COS 7细胞 ,用间接免疫荧光和免疫共沉淀法检测瞬时表达产物的免疫学活性。结果 :间接免疫荧光的结果表明 ,约 1%细胞胞质中出现弥散荧光 ,在免疫共沉淀 /免疫印记中 ,表达的抗体片段可与汉坦病毒的NP抗原特异性结合。结论 :细胞内表达的1A8 scFv Cκ可与NP抗原特异性结合 ,为进一步研究细胞内抗体的抗病毒功能奠定基础 相似文献