9—顺式维甲酸诱导HL—60细胞凋亡

目的：检测９－顺式维甲酸（９－ｃｉｓＲＡ）诱导ＨＬ－６０细胞凋亡的能力，并探讨其分子机制。方法：应用形态学观察、ＤＮＡ电泳、流式细胞仪分析检测细胞凋亡，应用流式细胞仪检测ＨＬ－６０细胞ｂｃｌ－２含量。结果：９－ｃｉｓＲＡ可以诱导ＨＬ－６０细胞在分化后发生典型的凋亡。在ＨＬ－６０细胞分化和凋亡的过程中ｂｃｌ－２含量逐渐下降。９－ｃｉｓＲＡ诱导ＨＬ－６０细胞凋亡能力和降低ｂｃｌ－２表达的能力均显著强于全反式维甲酸（Ａ－ＴＲＡ）。结论：９－ｃｉｓＲＡ具有诱导ＨＬ－６０细胞凋亡的作用。ｂｃｌ－２表达水平的降低可能是经诱导分化成熟的白血病细胞走向凋亡的重要条件。     

阿糖胞苷诱导HL—60细胞凋亡中bcl—2,c—myc基因表达水平的变化

阿糖胞苷诱导ＨＬ－６０细胞凋亡中ｂｃｌ－２、ｃ－ｍｙｃ基因表达水平的变化仇志根马伴吟杨毅吴王月现已证明，阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。我们采用Ａｒａ－Ｃ诱导ＨＬ－６０细胞凋亡，并观察了凋亡调控基因ｂｃｌ－２、ｃ－ｍｙｃ表达...     

粒—巨噬细胞集落刺激因子对Vp16诱导白血病细胞凋亡的调控作用

目的：探讨粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）对Ｖｐ１６诱导白血病细胞凋亡的调控作用，指导白血病临床治疗中正确使用ＧＭ－ＣＳＦ。方法：在构建高效表达ＧＭ－ＣＳＦ的逆转录载体Ｎ２Ａ／ＣＭＶ／ＧＭ－ＣＳＦ表达系统的基础上，对转ＧＭ－ＣＳＦ基因和未转ＧＭ－ＣＳＦ基因的白血病ＨＬ－６０细胞进行研究。结果：未转ＧＭ－ＣＳＦ基因及转空载体Ｎ２Ａ的ＨＬ－６０细胞经Ｖｐ１６处理后均出现凋亡的特征性表现：ＤＮＡ电泳呈梯状；流式细胞仪ＤＮＡ直方图上呈现特征性的亚二倍体（亚Ｇ１）峰；透射电镜观察细胞形态可见凋亡的特征性改变。结论：Ｖｐ１６具有诱导白血病细胞发生凋亡的作用，而ＧＭ－ＣＳＦ能够抑制Ｖｐ１６诱导的细胞凋亡。以上结果表明，白血病临床治疗中为预防和改善化疗所致骨髓抑制而应用ＧＭ－ＣＳＦ时，应谨慎地选择时机，在化疗前和化疗期间不宜使用，以避免白血病细胞对抗癌药物诱导的凋亡产生抵抗而导致耐药。     

钙离子在VP—16诱导HL—76细胞凋亡的作用

为了研究Ｃａ＾２＋在ＶＰ－１６（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）诱导ＨＬ－６０细胞凋亡中的作用,采用流式细胞术,激光共聚焦显微镜和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹方法进行观察,结果显示,ＶＰ－１６可诱导ＨＬ－６０细胞凋亡,并可引起细胞内Ｃａ＾２＋浓度的增加,细胞外钙离子螯合剂ＥＧＴＡ不抑制其诱导的细胞凋亡,而细胞内钙离子螯合剂ＢＡＰＴＡ－ＡＭ可抑制此过程,并且可抑制细胞色素Ｃ的释放,实验结果提示,Ｃａ＾２＋在细胞凋亡和细胞色素Ｃ的释放过程中起重要的作用。     

Fas基因在rhG-CSF诱导白血病细胞凋亡过程中的作用

目的探讨了Ｆａｓ基因是否参与重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧＣＳＦ）对白血病细胞的诱导凋亡过程。方法利用脂质体（ＤＯＴＡＰ）介导的基因转染技术将Ｆａｓ基因转入ＨＬ６０细胞中,并经原位杂交、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ及流式细胞术（ＦＣＭ）证实已成功建立了Ｆａｓ高表达的ＨＬ６０细胞株,用ＦＣＭ对Ｆａｓ基因在ｒｈＧＣＳＦ诱导白血病细胞凋亡过程中的作用进行了探讨。结果相同浓度的ｒｈＧＣＳＦ作用相同时间后转染的ＨＬ６０细胞凋亡率较未转染的ＨＬ６０细胞凋亡率明显增加,且随ｒｈＧＣＳＦ作用时间延长,Ｆａｓ在ＨＬ６０细胞中的表达逐渐增加。结论Ｆａｓ基因是凋亡诱导基因,ｒｈＧＣＳＦ诱导白血病细胞凋亡依赖Ｆａｓ径路传递凋亡信号。     

逆转录病毒介导的反义bcl-2序列促进足叶乙甙诱导的白血病细胞凋亡

目的：探讨逆转录病毒介导的反义ｂｃｌ２序列对细胞凋亡的诱导作用。方法：ＰＡ３１７细胞包装逆转录病毒，病毒转导Ｊｕｒｋａｔ细胞后用ＲＴＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法检测ｂｃｌ２ｍＲＮＡ及蛋白表达水平；用流式细胞仪计数及ＤＮＡ电泳检测细胞凋亡。结果：转染反义ｂｃｌ２序列可使内源性ＢＣＬ２蛋白表达下降，提高白血病细胞株对足叶乙甙（Ｖｐ１６）的敏感性，促进细胞凋亡。结论：反义ｂｃｌ２序列能促进Ｖｐ１６诱导的白血病细胞凋亡，为ｂｃｌ２反义技术治疗白血病的临床应用提供了实验依据。     

抗bcl－2核酶在HL－60细胞中的表达及促进其凋亡的研究

为消除白血病细胞中ｂｃｌ－２基因对细胞凋亡的抑制作用，开辟白血病基因治疗的途径。将合成的针对ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ的“锤头型”核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ，ＲＺ）基因定向克隆于真核表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ，构成ｐＤＯＲ－ＲＺ重组体。通过脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的ＤＮＡ转染法，把ｐＤＯＲ－ＲＺ导入ＨＬ－６０细胞。用Ｓｏｕｔｈ－ｅｒｎ印迹，ＲＮＡ斑点杂交法观察ＲＺ基因在ＨＬ－６０细胞内表达，并通过电镜、流式细胞仪（ＦＣＭ），光镜和ＤＮＡ电泳观察ＲＺ对ＨＬ－６０细胞的影响。结果：①ＲＺ在转染ＨＬ－６０后７２小时得以表达，细胞内ｂｃｌ－２蛋白合成受到抑制。②在ＦＣＭ图谱上可见到明显的凋亡峰，形态观察ＲＺ处理的ＨＬ－６０细胞呈典型的凋亡形态。③足叶乙甙（促凋亡）敏感性试验表明，与未转染的细胞和转染空载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的细胞相比，转染ｐＤＯＲ－ＲＺ的细胞ＤＮＡ电泳易出现梯状条带。结果说明ＲＺ基因通过逆转录病毒表达载体导入ＨＬ－６０细胞后可成功地表达并抑制ＨＬ－６０细胞ｂｃｌ－２蛋白的合成，并促进ＨＬ－６０细胞凋亡     

bcl—XL在急性髓系白血病细胞的表达及化疗敏感性的关系

目的：探讨急性髓系白血病（ＡＭＬ）细胞凋亡径路的特征及调控模式。方法：运用流式细胞仪（ＦＡＣＳ）、ＤＮＡ电泳、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｏｌｔ分析技术，观察了化疗药物足叶乙甙（Ｖｐ１６）作用于原代ＡＭＬ细胞前后，ｂｃｌ－Ｘ１表达与凋亡的敏感性、临床特征、预后的关系。结果：绝大部分ＡＭＬ高表达ｂｃｌ－Ｘ１ｍＲＮＡ病例经Ｖｐ１６处理后，其ｂｃｌ－Ｘ１虽然下调，但仍维持较高水平，并对凋亡诱导不敏感，与高白细胞     

bcl-X_L在急性髓系白血病细胞的表达及与化疗敏感性的关系

目的：探讨急性髓系白血病（ＡＭＬ）细胞凋亡径路的特征及调控模式。方法：运用流式细胞仪（ＦＡＣＳ）、ＤＮＡ电泳、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析技术，观察了化疗药物足叶乙甙（Ｖｐ１６）作用于原代ＡＭＬ细胞前后，ｂｃｌ－ＸＬ表达与凋亡的敏感性、临床特征、预后的关系。结果：绝大部分ＡＭＬ高表达ｂｃｌ－ＸＬｍＲＮＡ病例经Ｖｐ１６处理后，其ｂｃｌ－ＸＬ虽然下调，但仍维持较高水平，并对凋亡诱导不敏感，与高白细胞数、髓外浸润等不良预后特征相关，化疗后不易缓解，处于长期缓解中的病例经Ｖｐ１６处理后，ｂｃｌ－ＸＬ亦表达下调，但凋亡率远低于ＡＭＬ细胞。结论：ｂｃｌ－ＸＬ高表达与ＡＭＬ的发生、维持和化疗耐药性相关，ｂｃｌ－ＸＬ高表达下调是凋亡启动的基础，但本身不足以引致凋亡。     

抗凋亡基因bcl—2在急性白血病骨髓与细胞株中的转录水平表达

采用原位杂交方法检测了急性白血病骨髓活检标本及细胞株中ｂｃｌ－２基因表达水平。结果２２例白血病患骨髓中２１例存在ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ高表达；６种白血病细胞株中５种ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ阳性（Ｍｏｌｔ－４例外），它们分别为ＣＥＭ、Ｒａｊｉ、ＨＬ－６０、Ｕ９３７及Ｋ５６２。表明造血系统肿瘤中广泛存在ｂｃｌ－２基因转录水平激活，其基因产物可能通过抑制细胞凋亡过程而影响急性白血病细胞的生物学特性。     

藏红花素对HL-60细胞增殖抑制和诱导凋亡作用及其机制

本研究探讨藏红花素(crocin)对人急性白血病细胞HL-60增殖抑制的影响及其促凋亡机制。测定HL-60细胞在不同浓度crocin作用后的生长曲线,用荧光显微镜观察细胞形态学变化,MTT法检测细胞的增殖情况,流式细胞术检测细胞周期分布,RT-PCR检测bcl-2、bax基因的表达。结果表明,不同浓度crocin作用后HL-60细胞生长明显受抑制,并呈现出剂量时间依赖关系。在0-5mg/ml范围内HL-60细胞凋亡率逐渐升高。当crocin浓度高于5mg/ml时,HL-60细胞凋亡率并没有升高,反而下降,表现为细胞坏死。流式细胞术检测结果显示,细胞周期被阻滞于G0/G1,且在5mg/ml时阻滞作用最明显。RT-PCR结果显示,bcl-2基因表达明显下调,bax基因表达上调。结论:crocin可诱导HL-60细胞凋亡,并对细胞周期起阻滞作用,其作用机制可能与bcl-2基因表达抑制及bax基因表达激活有关。     

bcl-2在HL-60细胞分化和凋亡过程中的表达

细胞凋亡抑制基因bcl-2在髓系造血细胞中的表达与细胞分化程度有关。本研究证实全反式维甲酸(ATRA)可诱导HL-60细胞凋亡。流式细胞仪分析表明,在HL-60细胞分化凋亡过程中bcl-2表达逐渐下降,凋亡细胞bcl-2表达水平较低,而未凋亡细胞bcl-2仍维持在高水平。上述结果提示:经ATRA诱导分化成熟的HL-60细胞与正常粒细胞相似,最终走向凋亡;bcl-2表达降低可能对终末分化细胞凋亡有易化作用;未凋亡细胞bcl-2高表达可能是肿瘤细胞耐药和白血病复发的重要因素。     

内源性TGF—β1、TNF—α在三氧化二砷诱导HL—60细胞凋亡中作用的研究

目的探讨内源性TGF-β     

Camptothecin- and etoposide-induced apoptosis in human leukemia cells is independent of cell death receptor-3 and -4 aggregation but accelerates tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-mediated cell death

During camptothecin- and etoposide (VP-16)-induced apoptosis in HL-60 cells, the expression level of cell death receptor-3 (DR3), cell death receptor-4 (DR4), and FAS remained mostly unchanged, whereas the expression of silencers of death domain (SODD) and FLICE inhibitory proteins, inhibitors of the cell death receptor signaling pathways, decreased substantially. By indirect immunofluorescence and immunoperoxidase imaging and with gel filtration column chromatography, we observed rapid aggregation at the cell surface and the appearance of high molecular weight protein complexes primarily involving DR3, and DR3 and DR4 after camptothecin and VP-16 treatment, respectively. Both drugs failed to rapidly promote FAS aggregation in these cells. The high expression level of SODD or of dominant negative forms of FADD (FADD-DN) and DAP3 (DAP3-DN), or of NH2-terminal deletion mutant of TRADD (TRADD-ND) achieved by transient transfection experiments, did not impair the kinetics of apoptosis after camptothecin and VP-16 treatment in HL-60 and U937 cells. Taken together, these observations suggested that camptothecin and VP-16 induced rapid aggregation of DR4 and DR3, but paradoxically, the importance of these events in signaling apoptosis is uncertain, because the kinetics of apoptosis were unaffected, even in the presence of a high expression level of SODD, FADD-DN, TRADD-ND, and DAP3-DN. However, camptothecin or VP-16 treatment in combination with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) substantially accelerated kinetics of apoptosis than treatment with camptothecin, VP-16, or TRAIL alone. In contrast, cotreatment of camptothecin or VP-16 with TWEAK or TL1A did not facilitate apoptosis in HL60 cells. These findings suggest that DR4 aggregation mediated by camptothecin or VP-16 could represent a mean that accelerates TRAIL-induced apoptosis.     

尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡机制影响的研究

为了研究尼莫地平对阿糖胞苷诱导HL-60细胞凋亡机制的影响，采用琼脂糖凝胶电泳检测其DNA凋亡带，用细胞免疫组织化学方法检测细胞凋亡相关基因bcl-2、bax的蛋白表达。结果表明，实验组自培养8小时起琼脂糖凝胶电泳显示典型的DNA梯形凋亡带。Bcl-2蛋白表达在各实验组随培养时间延长逐渐下降，而Bax蛋白的表达则逐渐增加，Bcl-2／Bax比值逐渐下降，8小时就与对照组出现差异（P〈0.05）。结论：尼莫地平及阿糖胞苷均能促进HL-60细胞凋亡，诱导其凋亡的机制与下调bcl-2及上调bax基因的蛋白表达有关。尼莫地平能加强阿糖胞苷促进HL-60细胞凋亡，其机制与协同下调bcl-2的表达有关。     

右旋柠烯对HL-60、K562白血病细胞体外作用的研究

本研究观察右旋柠烯（d-limonene，D-L）对HL-60和K562白血病细胞增殖凋亡的影响，并进一步探讨其作用机制。首先采用碘化丙锭染色法观察右旋柠烯对HL-60、K562细胞增殖的影响，再通过细胞形态学观察、流式细胞术分析、免疫细胞化学半定量测定突变型p53、bcl-2、bax基因的表达水平，系统观察D-L对HL-60、K562细胞体外诱导凋亡的情况。结果表明：D-L抑制HL-60和K562细胞的增殖，IC50均为0．75mmol／L，呈剂量时间依赖关系；D-L诱导HL-60、K562细胞凋亡；D-L在诱导HL-60细胞凋亡过程中随作用浓度增加，bcl-2的表达下降；D-L在诱导K562细胞凋亡过程中随作用浓度增加，突变型p53及bcl-2的表达下调，而bax的表达上调。结论：D-L抑制HL-60和K562细胞增值并诱导其凋亡；突变型p53，bcl-2，bax参与了D-L诱导凋亡的基因调控，     

细胞色素C对HL-60细胞凋亡作用及其与相关bcl-2、bax基因的关系

为了探讨细胞色素C在体外作用于HL-60细胞时细胞发生的变化及其相关凋亡基因的bcl-2、bax表达变化的机制，用不同浓度的细胞色素C作用于HL-60细胞24小时，然后分别用肌检测细胞色素C对HL-60细胞的抑制率；应用光学显微镜、荧光显微镜观察HL-60细胞形态的变化；用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期的变化；用DNA凝胶电泳检测HL-60细胞的凋亡；用RT—PCR检测bcl-2、bax基因的表达的变化。结果表明：在细胞色素C浓度为0—150mg／L时，细胞抑制率随着浓度的增加而增加；当细胞色素C浓度在0—37．5mg／L时，细胞凋亡率逐渐增加，可见典型的凋亡细胞和明显DNA梯形条带，同时，在该浓度范围内bcl-2表达逐渐减少，而bax表达逐渐增加；当细胞色素C浓度大于37．5mg／L时，细胞凋亡率增加不明显，但细胞出现坏死。结论：细胞色素C能诱导HL-60细胞发生凋亡，细胞色素C对细胞周期的作用是将细胞阻滞于G1期，并且细胞凋亡率、bcl-2、bax基因的表达的变化与细胞色素C浓度呈一定的量效依赖关系，细胞色素C诱导HL-60凋亡可能与bax的激活和bcl-2的抑制有关。     

细胞色素C诱导HL-60细胞凋亡时bcl-2 fas基因的表达

目的观察细胞色素C对急性髓系白血病M2型(AML-M2)(HL-60细胞)bcl-2、fas表达的影响,探讨细胞色素C诱导HL-60细胞凋亡的机制。方法将体外培养的HL-60细胞分成六组,细胞色素C终浓度分别为0(对照组)、9.375mg/L、18.75mg/L、37.5mg/L、75mg/L、150mg/L,用流式细胞仪检测细胞色素C对HL-60细胞的凋亡效应,用RT-PCR、westernblotting检测以凋亡为主的HL-60细胞中bcl-2、fas的表达水平。结果流式细胞仪检测表明细胞色素C终浓度分别为0、9.375mg/L、18.75mg/L、37.5mg/L时HL-60细胞是以凋亡效应为主的,bcl-2基因的mRNA和蛋白的表达随着细胞色素C浓度的增高而降低,fas基因的mRNA和蛋白的表达随着细胞色素C浓度的增高而增高,当细胞色素C浓度为75mg/L、150mg/L时,HL-60细胞是以坏死效应为主的。结论细胞色素C能够下调bcl-2mRNA及其蛋白的表达,上调fasmRNA及其蛋白的表达,从而可以诱导HL-60细胞的凋亡。     

5-氮杂脱氧胞苷对白血病细胞生长作用及相关基因表达的影响

目的　探讨甲基化抑制剂 5 氮杂脱氧胞苷 (5 aza 2′ deoxycytidine,5 aza CdR)去甲基化治疗白血病的作用机制。方法　采用MTT实验、硝基四氮唑蓝 (NBT)还原实验和DNA凝胶电泳的方法 ,观察 5 aza CdR对白血病细胞株和原代细胞增殖、分化和凋亡的影响 ;通过RT PCR和甲基化特异性PCR方法检测DNA甲基转移酶 (DNMT)、p15、p5 3、bcl 2基因表达变化和p15基因的甲基化状态。结果　 5 aza CdR对HL 6 0、K5 6 2细胞和白血病原代细胞的生长抑制有明显的剂量依赖性和时间依赖性。 0 .5 μmol/L 5 aza CdR对HL 6 0细胞有较明显的促分化作用。不同浓度 5 aza CdR处理细胞后 ,有不同程度的p15、p5 3mRNA表达上调和bcl 2mRNA表达下调 ,DNMTmRNA表达水平在处理前后无明显变化。在原代白血病细胞中 ,p15基因甲基化程度随着 5 aza CdR浓度的增加逐渐减低。结论　 5 aza CdR对白血病细胞株和原代细胞的增殖均有明显的抑制作用 ,其作用机制可能与p15、p5 3基因的上调以及bcl 2基因的下调有关 ,p15 INK4B基因甲基化程度的降低 ,主要与 5 aza CdR的竞争性抑制有关 ,而不是由DNMT基因的下调所致     

p53基因诱导白血病细胞凋亡的机制研究

目的：探讨p53基因诱导白血病细胞凋亡过程中内源性TGF-β1、TNF-α、端粒酶活性、Bcl-2表达的改变及其意义。方法：利用脂质体将温敏型p53基因[pN53cG(Val135)]导入p53基因缺失的白血病细胞系HL-60、K562细胞，经G418筛选，获得稳定表达p53蛋白的抗性克隆细胞HL-60pN53cG，K562-pN53cG细胞。采用缺口末端标记法、片段化DNA分析、RT-PCR、定量PCR、ELISA、PCR-ELISA、流式细胞术等方法检测外源性p53基因诱导白血病细胞凋亡过程中TGF-β1、TNF-α、bcl-2、端粒酶反转录酶(hTERT)mRNA表达变化、细胞上清TGF-β1水平和端粒酶活性及。TGF-β1、TNF-α反义PS-ODNS对白血病细胞凋亡和Bcl-2蛋白表达的影响。结果:①外源性野生型p53基因诱导细胞凋亡过程中内源性。TGF-β1和TNF-α mRNA表达上调，bcl-2及hTERT mRNA表达下调，细胞培养上清TGF-β1蛋白水平明显升高，端粒酶活性水平下降；②TGF-β1、TNF-α反义PS-ODNS能够明显抑制野生型p53基因诱导细胞凋亡的发生，并使细胞bcl-2 mRNA及蛋白表达恢复到处理前的水平。结论：p53基因诱导白血病细胞凋亡可通过上调内源性TGF-β1和TNF-α水平，下调hTERT mRNA表达及端粒酶活性，抑制bcl-2基因表达而发挥作用。