碱裂解法快速提取虫草属真菌DNA研究

目的探索一种适用于虫草属基因组DNA快速提取的方法。方法在无液氮条件下使用碱裂解法提取虫草DNA,使用ITS通用引物进行PCR扩增。考察了提取液配方、煮沸时间对DNA提取的影响以及中和剂Tris-HCl用量对PCR扩增的影响。利用优化的提取方法提取了虫草属5种虫草并用ITS通用引物进行PCR扩增。结果 80μl 0.5 mol/L Na OH进行提取,加入160μl 0.1 mol/L Tris-HCl中和,离心即可在10min内提取出虫草属真菌的DNA,PCR扩增能获得清晰目的条带。结论优化的碱裂解法可用于虫草属DNA的快速提取。     

不同槐花炮制品中总黄酮含量的比较研究

目的优化槐花总黄酮提取工艺,比较不同槐花炮制品(生品槐花、炒制槐花、槐花炭)中总黄酮的含量差异。方法采用闪式提取辅助乙醇浸提法提取生品槐花总黄酮,观察乙醇浓度、料液比、提取电压对提取率的影响。通过正交试验确定最佳提取条件,并在该条件下比较不同槐花炮制品中总黄酮提取率的差异。结果闪式提取法提取槐花中总黄酮的最优工艺条件为:乙醇浓度65%,料液比70ml·g-1,提取电压90V。不同槐花炮制品中总黄酮提取率有明显的不同,炒制槐花最高(14.23%),其次为生品槐花(13.17%),最后是槐花炭(9.31%)。结论研究优化了闪式提取法提取槐花总黄酮的最佳工艺,并为深入理解不同槐花炮制品不同功效主治与总黄酮含量变化的关系提供了理论依据。     

快速PCR方法在哈蟆油真伪鉴别中的应用研究

该研究依据哈蟆油Cyt b基因155位SNP位点设计位点特异性PCR引物,采用碱裂解法提取基因组DNA,2步循环PCR程序进行PCR反应,并对PCR反应条件进行优化,从而建立起一种哈蟆油及其4种常见混伪品的快速PCR鉴别方法。该方法在90℃变性3 s,62℃退火延伸20 s进行32个循环时,加入2μL 100×SYBR GreenⅠ染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光。该方法准确、简便,40 min内即可完成鉴别,为哈蟆油药材现场快速鉴定提供技术支持。     

半夏药材炮制品DNA提取方法的优化及分子鉴定

目的:优化炮制半夏基因组DNA提取方法并进行市售炮制药材的分子鉴定。方法:以半夏药材炮制品为试验材料,对CTAB水浴后沉淀试剂进行筛选,并优化样品用量、沉淀试剂和裂解时间3个参数,建立半夏炮制品DNA提取方法;采用该法提取市售13份姜半夏和法半夏基因组DNA,用基于ITS2序列的PCR扩增法进行分子鉴定。结果:以CTAB水浴后加入甲醇处理可有效促进DNA沉淀,起始半夏药材0.5 g、水浴裂解时间1 h即可快速高效获得基因组DNA。对所提取DNA样品进行PCR扩增,所有样品全部成功测序。相似性搜索法分析表明,13份样品中10份为掌叶半夏,3份为半夏。结论:该研究建立了简易快速的半夏药材炮制品DNA提取技术,所提DNA满足半夏药材的分子鉴定要求。该结果也提示市售半夏药材混伪情况较多,值得重视。     

沉香DNA提取方法及种质资源聚类分析研究

目的：分别建立适用于提取不同类型沉香样品（叶片、干燥枝条、药材）DNA的方法,通过ITS2序列对沉香药材进行种质资源聚类分析。方法：根据沉香叶片、干燥枝条、药材的组织差异,分别采用试剂盒法和优化的CTAB法提取DNA;利用紫外分光光度仪、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增及ITS2序列测定来检测DNA的纯度、浓度及可用性,以比较不同DNA提取方法的效率;将样品测序结果与从GenBank下载的沉香属（Aquilaria spp.）、拟沉香属（Gyrinops spp.）,及沉香药材常见混伪品的ITS2序列,进行聚类分析。结果：优化的CTAB法提取得到的DNA纯度比试剂盒法稍低,但浓度更高。两种方法所提沉香总DNA进行ITS2序列的PCR扩增成功率和测序成功率均为100%。ITS2序列能准确鉴别出4个沉香混伪品和2个拟沉香物种,且15个沉香样品ITS2序列与Aquilaria subintegra（泰国）、Aquilaria sinensis（中国）、Aquilaria crassna（柬埔寨、泰国）三个沉香物种均100%相似。结论：本研究中的两种DNA提取方法均可用于沉香DNA条形码研究;优化CTAB法比试剂盒法更适用于药材DNA的提取,该方法为有关中药材DNA的提取提供了参考;ITS2序列可为沉香种质资源的鉴定和系统发育分析提供必要的实验依据。     

不同栽培品种橘皮中主要活性成分的动态积累

目的：利用不同方法对白及基因组DNA进行提取,比较提取质量的差异,找到一种最适于白及基因组的DNA提取方法,以满足白及DNA条形码研究的需要。方法：采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、十二烷基硫酸钠（SDS）法、碱裂解法和经本文改良的CTAB法提取白及叶片基因组DNA,利用琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法及PCR扩增效果检测所提DNA的质量。结果：CTAB法、SDS法和改良CTAB法均能从白及中提取到基因组DNA,而碱裂解法几乎提取不到。其中改良CTAB法提取的DNA纯度和完整度均高于其他方法,PCR扩增效率达到100 %,且扩增条带明亮清晰。结论：经本文改良的CTAB法是提取白及基因组DNA的最佳方法,该方法提取的基因组DNA适用于DNA条形码研究。     

应用DNA提取改良和二次聚合酶链反应技术检测乌头及其炮制品

【目的】筛选适用于9种乌头属植物根茎炮制前后DNA提取的方法。【方法】采用基于十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、十二烷基硫酸钠（SDS）法的12种改良方法提取9种乌头属植物根茎炮制前后DNA,考察提取缓冲液种类、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）添加、水浴时间、DNA沉降方式对乌头属植物根茎炮制前后DNA提取的影响,以及二次聚合酶链反应（PCR）技术对乌头炮制品ITS2片段浓度提高的影响。【结果】不同缓冲液与水浴时间互作提取DNA效应不同,2×CTAB（含2.5mol/LNaCl）水浴3h提取的9种乌头生品DNA的ITS2扩增效果最佳,2×CTAB（含1.4mol/LNaCl）水浴3h提取的9种乌头炮制品DNA的ITS2扩增效果最佳。添加PVP或添加PVP+改变DNA沉降方式对生品DNA提取影响不大,但对炮制品有明显的抑制作用。经过二次PCR可显著提高炮制品ITS2的扩增效率。【结论】提取缓冲液和水浴时间的有效互作提取DNA以及二次PCR技术的应用可提高乌头属植物根茎ITS2片段制备效率,为DNA条形码技术广泛应用于乌头属药材提供必要的技术支持。     

车前子不同炮制品的止泻作用及星点设计-效应面优化法优选车前子炒制工艺的研究

目的 研究车前子Plantaginis Semen不同炮制品的止泻作用;优化车前子炒制工艺。方法 采用醇水双提法提取车前子不同炮制品的有效成分,以腹泻指数为指标,观察不同炮制品对蓖麻油所致小鼠腹泻模型的影响;以京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、水浸出物、醇浸出物的量为评价指标,采用星点设计-效应面优化法（CCD-RSM）优选车前子最佳炒制工艺参数。结果 车前子炒品、酒品和盐品对小鼠腹泻具有一定抑制作用,抑制作用强弱顺序为炒品＞酒品≥盐品,而生品有进一步加重小鼠腹泻的趋势;车前子最佳炒制工艺条件为取车前子饮片,210 ℃炒制5 min。结论 车前子不同炮制品的止泻作用存在差异;CCD-RSM科学性强、预测性好,所得的车前子最佳炒制工艺合理可行。     

快速PCR方法在蛇类药材真伪鉴别中的应用

为优化获得一种准确、快速、高效鉴别药典所载蛇类药材(乌梢蛇,金钱白花蛇,蕲蛇)真伪品的方法。该研究以蛇类药材经典PCR鉴定方法为基础,采用碱裂解法提取基因组总DNA,加入特异性PCR引物,采用两步法进行PCR扩增,从而对蛇类药材及其混淆品进行鉴别。通过对影响PCR反应时间的退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行优化,并对不同型号PCR仪和Taq酶进行考察,分别获得乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇快速PCR反应程序。在PCR产物中加入SYBR Green I染料,正品显示出明亮绿色荧光,而混淆品不显示荧光。所建立的蛇类药材快速PCR真伪检测方法可在30~45 min完成,为蛇类药材现场快速鉴定提供技术支持。     

中药雀舌草中总黄酮提取纯化工艺优化

目的建立中药雀舌草总黄酮含量测定方法,并对其提取纯化工艺进行优化。方法以芹菜素作为对照品,以三乙胺(TEA)为显色剂,在波长400 nm处对样品中的总黄酮含量进行测定,并以总黄酮含量为指标对其提取纯化工艺优化。结果样品总黄酮在浓度30.56~83.14μg/m L范围内线性关系良好,其回归方程为:Y=0.009 1X-0.016 1,R2=0.999 7;平均回收率为100.1%,RSD为1.95%(n=6)。雀舌草总黄酮纯化工艺为采用AB-8型大孔吸附树脂,上样浓度为0.25 g/m L生药材,上样流速为3 m L/min,径高比为1∶9,90%乙醇洗脱7倍量。结论该方法简便、快速、准确、灵敏度高,可用于雀舌草中总黄酮含量控制;提取纯化工艺可用于雀舌草总黄酮的富集。     

珊瑚菜Gl4CL 基因克隆与生物信息学分析

目的：对动物药材DNA提取方法进行优化,利用优化方法提取市售动物药材DNA并进行DNA条形码鉴定。方法：基于SDS法DNA提取原理,比较裂解液中不同EDTA浓度（0.025、0.25、0.5 mol·L-1）、是否含NaCl和Triton X-100等因素对不同用药部位动物药材DNA提取质量的影响,筛选得到最佳裂解液配方;使用优化的裂解液配方提取121份市售动物药材DNA并进行基原物种鉴定。结果：裂解液配方为1 % SDS、0.03 mol·L-1 Tris-HCl、0.25 mol·L-1 EDTA、0.2 mol·L-1NaCl对不同用药部位动物药材DNA提取效果最佳,并可实现对蝉蜕等提取困难样本DNA的提取;利用优化裂解液提取的121份市售动物药材DNA满足中药材分子鉴定后续实验要求,所有市售动物药材均可准确鉴定到基原物种。结论：本研究优化的裂解液配方可用于除壳类、分泌物类、加工品外不同用药部位动物药材的DNA提取,为动物药材分子鉴定提供了技术支持。     

不同炮制方法对僵蚕体外抗氧化活性及其对酪氨酸酶抑制能力的影响

目的： 探讨不同炮制方式对僵蚕提取物体外抗氧化活性及其对酪氨酸酶抑制能力的影响。 方法： 以生品僵蚕为对照,以二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）、羟自由基（·OH）、三价铁离子还原能力及小鼠肝微粒体脂质过氧化为指标,考察不同僵蚕炮制品甲醇提取部位体外抗氧化能力的差异;以L-多巴为底物,考察不同僵蚕炮制品提取物对酪氨酸酶抑制能力的差异;采用HPLC比对和确定甘蒸僵蚕新增成分的归属。 结果： 当提取液生药质量浓度为2~30 g·L^-1时,生品、微波品、甘蒸品和麸炒品对DPPH·的清除率基本一致,清蒸僵蚕的清除率最低;生药质量浓度为20 g·L^-1时,各炮制品对·OH的清除率均达到最大,清除能力顺序为生品 > 甘蒸品 > 微波品 > 麸炒品 > 清蒸品;生药质量浓度为8~80 g·L^-1时,各炮制品的总还原能力大小为甘蒸品 > 微波品 > 生品 > 清蒸品 > 麸炒品;生药质量浓度为80 g·L^-1时,各炮制品对小鼠肝脏微粒体脂质过氧化的抑制率均达到最大,抑制能力顺序为生品 > 甘蒸品 > 微波品 > 麸炒品 > 清蒸品;生药质量浓度为20 g·L^-1时,各炮制品对酪氨酸酶的抑制率达到最大,抑制能力排序为甘蒸品 > 生品 > 清蒸品 > 麸炒品 > 微波品。HPLC图谱比对结果显示,与生品及其他炮制品相比,甘蒸僵蚕甲醇提取部位增加了芹糖甘草苷、甘草苷和甘草酸铵等抗氧化活性成分。 结论： 僵蚕经加热炮制后,体外抗氧化活性与对酪氨酸酶的抑制能力有所降低。甘蒸僵蚕的整体抗氧化活性不低于生品是因为辅料甘草汁中活性物质起到了相应的贡献作用。     

中药材趁鲜加工现状及发展趋势

中药材趁鲜加工具有提高生产效率、降低生产成本、减少有效成分损失和便于仓储运输等优势。《中华人民共和国药典》2020年版中规定可以进行趁鲜加工的品种数较少,而初步调查发现,产地实际趁鲜加工品种数远大于国家法规规定品种数,这给监管部门执法管理及中药产业健康发展都带来了严峻挑战。为了解中药材趁鲜加工的研究基础、掌握目前市场趁鲜加工现状、分析趁鲜加工的发展趋势并对趁鲜加工的发展和监管提供建议,对地方标准、文献、专利中涉及的趁鲜加工品种进行分析,以问卷调查的方式对这些品种在中药材市场中趁鲜加工实际状况进行调查。问卷调查结果表明,通过多种方法筛选出的常见的85种中药材在市场中均有趁鲜加工品。通过分析中药材趁鲜加工可行性、研究现状及生产现状,发现在保证药材质量的前提下,适度、逐步放宽趁鲜加工品种范围是大势所趋。     

白芷的产地盐水腌制干燥技术分析

目的:采用盐水腌制干燥技术,使新鲜的白芷在产地快速干燥,避免腐烂和霉变,获得一种白芷药材。方法:取稍蔫的新鲜白芷,除去泥土,整齐地放置在容器中,用压石压住,加入盐水,浸过白芷,腌制1~2 d,将预处理的盐水倒出,加入与预处理时几乎等量的盐水,密封,腌制一段时间,取出白芷,用水反复浸泡和淋洗,晾干,即可获得白芷药材。结果:采用盐水腌制法加工的白芷中指标成分、醇溶性浸出物含量等指标均达到了2015年版《中国药典》对白芷药材的质量规定,所有样品中亚硝酸盐质量分数均低于3.3 mg·kg-1(检测限),符合盐渍品中亚硝酸盐的限量指标。结论:在产地采用盐水腌制法获得的药材白芷,在简易仓库中贮藏2年未见变质现象,为中药白芷的产地加工提供了一条新技术。     

植物药材总DNA提取

目的 为获得高质量的DNA，研究木质部较发达的根，根茎类以及茎木类药材的DNA提取方法。方法 总DNA的提取过程包括用Tris缓冲液洗净，CTAB抽提和纯化。结果 对升高，Chong木，木香，乌药，芍药和木通等进行了DNA提取，能较好的去除色素，多糖等干扰PCR物质。结论 本法使用常用试剂，成本低，易于推广，为药材DNA分子鉴别的应用奠定了基础。     

新型快速中药材DNA提取方法的探索与应用

目的建立一种无设备快速30 s提取中药材DNA的方法。方法使用常规定性滤纸作为核酸吸附的载体,通过裂解液的裂解,释放核酸并吸附在滤纸上,利用洗脱液进行核酸纯化,即可完成不到30s的整个核酸提取过程,吸附核酸的滤纸可直接放入反应体系进行扩增。结果此方法可以成功提取不同药用部位的中药材核酸,提取得到的核酸经扩增验证,可获得与传统提取方法相一致的检测结果。结论此新型快速中药材DNA提取方法简单易行、速度快、成本低,可使核酸提取变得越来越大众化,不再局限于专业人员和实验室环境,为分子生药学的应用和发展提供了新思路。     

基于荧光测序分型技术的六味地黄丸原料分子鉴别研究

该文选择成药六味地黄丸为研究对象,建立了一种用于中成药原料药材基原鉴定的荧光测序分型技术。首先以原料药材丹皮DNA为模板,筛选最适荧光标记鉴别引物,即通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分别对5个FAM荧光标记引物psb A-trn H,ITS,trn L-trn F,mat K,rbc L序列进行扩增,并对扩增产物进行测序,所得测序结果使用GeneMarker V1.80进行分析。根据分析结果最终选择psb A-trn H荧光标记引物来鉴别六味地黄丸及其原料药材。结果表明,通过psb A-trn H荧光标记引物扩增分析,可以准确鉴定出六味地黄丸中的丹皮,山药,泽泻3种原料药材。研究结果说明,采用分子荧光测序分型技术鉴定中成药原料具有一定的可行性。