基于DNA条形码和HRM技术对金银花及山银花药材的快速鉴别

目的探讨Bar-HRM联用技术在金银花及山银花药材鉴别中的应用。方法根据psb A-trn H和rbc L1-724序列设计引物,对8种不同产地的金银花和山银花共24份药材总DNA进行条形码片段扩增和高分辨率溶解曲线分析。结果利用psb A-trn H序列设计引物,HRM曲线能够区分不同的金银花和山银花药材品种,Bar-HRM能在金银花类药材混合物中检测出低至5%的山银花样品。结论 Bar-HRM在金银花及山银花药材品种的分类、鉴别上具有可靠的分辨能力,适用于金银花及山银药材掺混的快速鉴定,能够实现一管式闭合分析。     

基于psbA-trnH基因序列对中药材茜草的分子鉴定

目的通过对中药材茜草及其近缘种(易混品)的psb A-trn H基因序列进行分析,为中药材茜草的分子鉴定提供依据。方法提取中药材茜草及其近缘种的DNA,对叶绿体基因psb A-trn H序列扩增和测序,计算物种种内、种间Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离。采用最近距离、相似性搜索、构建Neighbor-joining(NJ)系统聚类树3种方法进行鉴定分析。结果 psb A-trn H分子系统树支持中药材茜草不同居群样本聚为一单系分支,支持率为65%;中药材茜草与其近缘种psb A-trn H序列的种间遗传距离为0.00751~0.19338,远大于中药材茜草种内遗传距离0~0.00372。结论叶绿体基因psb A-trn H序列可以快速准确鉴别中药材茜草。     

药用贝母属系统发育关系分析及多重实时荧光PCR检测方法的建立

目的探讨多重实时荧光PCR检测方法对川贝母及伪品鉴别的可行性。方法通过对常见贝母属植物的ITS、psb Atrn H、rbc L和matK基因序列种间变异、遗传距离及系统发育关系分析,选择进化速率快、种间变异大、种内变异小的基因作为靶基因,设计川贝母及伪品贝母的特异性引物和Taqman探针,建立一种多重实时荧光PCR检测方法。通过特异性、灵敏度及混合样本检测与测序方法比较进行方法评估。结果贝母属ITS和psb A-trn H变异位点高于rbc L和mat K,通过遗传距离分析rbc L和mat K基因显著低于ITS和psb A-trn H基因,以ITS作为靶基因,建立多重实时荧光PCR检测方法特异性强,灵敏度达0.01ng,对18份样本抽查检出4份伪品贝母,检测结果与构建的NJ树聚类分析结果完全一致。结论基于ITS区域序列为靶基因建立多重实时荧光PCR检测方法能够成功鉴定川贝母及其混伪品,为川贝母真伪鉴别提供依据。     

木瓜属药用植物DNA条形码鉴定研究

目的对木瓜属药用植物进行ITS2、psb A-trn H序列分析,为其分子鉴定提供依据。方法对5种木瓜属药用植物的19个样本ITS2序列进行PCR扩增和测序,用MEGA6.0计算其种间、种内的Kimura 2-parameter(K2P)距离,及各序列变异位点并构建系统发育树,并预测ITS2二级结构。结果 ITS2序列间存在明显差异,psb A-trn H序列间也存在稳定差异;构建的系统发育树显示木瓜属的不同基原样本各聚为一支,能很好将5种植物区分,显示出单系性;比较木瓜属5种植物的ITS2二级结构存在明显差异。结论 ITS和psb A-trn H序列可以有效准确鉴别5种木瓜属植物。     

千斤拔属药用植物DNA条形码鉴定研究

目的筛选一种可准确、高效鉴别千斤拔属Flemingia Roxb.ex Ait.et Ait.f.药用植物的DNA条形码序列。方法对4种14份千斤拔属药用植物的ITS2、rbc L、psb A-trn H序列进行扩增和测序,同时查找NCBI数据库中千斤拔属植物的相应序列,共计7种20份,比较不同序列的扩增效率及测序成功率,并对其进行种内、种间变异分析,barcoding gap检验及NJ聚类图分析,以评估不同序列对千斤拔属植物的物种鉴别能力。结果测序成功率方面,ITS2与rbc L序列对所分析样品的测序成功率为100%,psb A-trn H的测序成功率为85.71%;3条序列中,只有ITS2在barcoding gap检验中具有显著gap;从NJ聚类图来看,ITS2可明显区分千斤拔属植物的不同物种(除F.philippinensis与F.stricta外)。结论 ITS2序列能准确鉴别千斤拔属药用植物,可作为千斤拔药材基原植物鉴定的条形码序列。     

虾脊兰属植物DNA条形码的确立

目的:结合ITS2、psb A-trn H和matk序列对兰科虾脊兰属植物进行物种区分鉴定研究,并确立能准确鉴别虾脊兰属植物的序列或者序列组合。方法:采用试剂盒法对已收集的6种虾脊兰属植物进行总DNA的提取,通过扩增及测序,运用codencode V4.2软件对所得序列进行拼接与剪切,使用MEGA5.0对ITS2、psb A-trn H和matk序列3种序列分别进行比对分析,计算种内及种间Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离,构建Neighbor-joining(NJ)系统聚类树。结果:实验共得到序列56条(包含Gen Bank序列17条),ITS2序列和mat K序列其种内最大遗传距离小于种间最小遗传距离,而该属psb Atrn H序列种内遗传距离范围和种间遗传距离范围有重合。结论:ITS2序列和mat K序列可以作为虾脊兰属部分植物的鉴定序列,而psb A-trn H序列不能用于虾脊兰属植物的鉴定。     

薄荷及其近缘物种叶的形态特征及DNA条形码鉴定研究

目的探讨植物的形态特征及ITS2、psb A-trn H序列在薄荷及其近缘物种鉴定中的应用,为薄荷及近缘物种的鉴定提供参考。方法观察薄荷及其近缘物种叶片形状、叶缘形状、绒毛密度、腺鳞密度等形态特征并对供试材料ITS2序列、psb A-trn H序列进行PCR并测序,通过对比植物形态特征、分析DNA序列、计算遗传距离、构建邻接树等方法对数据进行整理分析,并对植物进行鉴定。结果植物的形态特征结合ITS2序列、psb A-trn H序列构建的邻接树显示香水薄荷与夏香薄荷、丹参与紫苏、胡椒薄荷与美国薄荷、大叶薄荷与猫薄荷亲缘关系近,该方法能将薄荷及其近缘物种区分。结论 ITS2序列、psb A-trn H序列可作为薄荷及其近缘物种的DNA条形码,与叶的形态特征相结合鉴定效果更佳。     

蒙成药中“地格达”类原料药材的位点特异性PCR鉴别研究

该文选择8种含有地格达类蒙药原料药材的蒙成药为对象,首先对基原植物肋柱花和苦地丁样品采用改良CTAB法提取其总DNA,使用psbA-trnH片段进行扩增、测序,与GenBank下载的8种蒙成药中其他原料药材psbA-trnH序列进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。同时对8种蒙成药进行总DNA的提取,并使用DNA纯化试剂盒进行纯化,通过PCR反应对叶绿体rbcL序列进行扩增,再分别选择肋柱花和苦地丁鉴别引物进行扩增,并将扩增后的产物进行测序。所得序列校正、比对后,进行比对分析。结果表明,地格达-4汤、地格达-8散、地格达-4散中均含有原料药材肋柱花,苦地丁特异鉴别引物扩增分析可以鉴定出利胆八味散、伊赫哈日-12和阿嘎日-35中含有苦地丁。该研究结果说明,位点特异PCR方法用于鉴定蒙成药中原料药材具有一定的可行性。     

不同产地忽地笑的叶绿体基因psb A-trn H序列分析

目的通过叶绿体基因psb A-trn H序列分析,探讨我国忽地笑种质资源的系统进化关系及分子鉴定方法。方法分别提取15省(市)52个忽地笑居群的DNA,经PCR扩增叶绿体基因psb A-trn H序列及测序,并用Mega5.0等软件对测序结果进行分析。结果 52条psb A-trn H序列长度为544～656 bp,GC含量为35.8%～37.0%,遗传距离为0.000 00～0.009 47;核苷酸变异(多态性)位点数共33个,其中简约信息位点9个,单一突变位点18个,插入/缺失片段6个;单倍型数量(H)10个,单倍型多态性水平(Hd)0.749,核苷酸多态性(π)0.002 63,收集的忽地笑资源具有较高的遗传多样性。最大简约法(maximum parsimony,MP)系统树中52个居群聚为4类,并且该聚类结果与其地理分布基本一致。结论不同产地忽地笑居群的遗传变异较大,psb A-trn H序列可作为忽地笑种源分子鉴定的依据;我国忽地笑种质资源在进化上具有明显的地域性特征。     

白花蛇舌草的DNA条形码研究

目的白花蛇舌草具有较好的抗肿瘤的功效,伪品众多,旨在筛选出一条最佳的DNA条形码序列用于白花蛇舌草的真伪鉴别。方法采用4个常用的DNA条形码序列ITS2、rbc L、psb A-trn H和mat K的通用引物对白花蛇舌草及其伪品进行PCR扩增并测序,通过比较各序列扩增和测序成功率、鉴定效率、barcoding gap检验及NJ树评价不同序列的的鉴别能力。结果 rbc L测序成功率最高为100%,ITS2利用最近距离法和BLAST两种方法在物种水平和属水平鉴定成功率均能达到100%,barcoding gap分析显示ITS2可作为白花蛇舌草真伪鉴别的理想候选序列,ITS2二级结构的构建表明不同物种的茎环结构有显著差异。结论 ITS2序列可作为白花蛇舌草真伪鉴别的候选序列,为白花蛇舌草的真伪鉴别提供分子基础。     

头花蓼不同地理居群的叶绿体psbA-trnH和 trnL-trnF基因序列与聚类分析

目的:探讨民族药头花蓼居群间的DNA序列变异与地理分布的关系,为头花蓼优良种质资源的筛选评价提供分子依据.方法:采用PCR产物直接测序,对头花蓼11个居群11个个体样品的叶绿体psbA-trnH,trnL-trnF基因进行测序分析研究.结果:头花蓼11个居群的叶绿体psbA-trnH长402 bp,存在6个变异位点.trnL-trnF长875 bp,存在5个变异位点.用UPGMA法构建的聚类图表明,头花蓼在贵州至云南的类群存在较大程度变异.结论:贵州西部与云南东部地区的头花蓼有利于优良种质资源的筛选.     

PCR增强剂对药材DNA分子鉴定的影响

评价PCR增强剂对中药材DNA分子鉴定的影响,筛选获得适用于中药材DNA分子鉴定的PCR增强剂。文章分别利用CTAB法和碱裂解法提取180个中药材DNA样品,分析在PCR反应体系中使用PCR增强剂对通用引物ITS2,psbA-trnH,rbcL,matK,trnL-trnF片段PCR成功率的影响及实时荧光定量PCR反应体系中使用增强剂对PCR扩增效率的影响。结果表明BSA与PVP组合可以明显增加ITS2,psbA-trnH,rbcL片段的PCR成功率,且PCR增强剂也能消除位点特异性鉴别假阴性结果,提高分子鉴定的准确性,但降低了实时荧光定量PCR的扩增效率。本研究说明BSA和PVP作为PCR增强剂能增加中药材DNA的PCR扩增成功率和分子鉴别的准确性。     

超临界流体萃取六味地黄丸中的丹皮酚

目的:研究中药复方制剂中有效成分提取分离方法。方法:用超临界流体萃取六味地黄丸中的丹皮酚,HPLC用于分析提取物。结果:夹带甲醇(流速0.4 mL.min^-1)的超临界CO₂能有效地提取六味地黄丸中的丹皮酚。结论:该分析方法具简便、快速、准确的优点。     

Cardiocrinum seeds as a replacement for Aristolochia fruits in treating cough

Aim of the study

The antitussive Chinese herb Madouling derived from Aristolochia species is banned due to aristolochic acid-induced nephropathy. A substitute is found dispensed as Madouling in Taiwan. This study aims to determine the source plant and verify the antitussive properties of the Madouling substitute used in Taiwan.

Materials and methods

Forensically informative nucleotide sequencing (FINS) approach based on the trnL-trnF and psbA-trnH regions was applied to facilitate identification of the genuine species and substitute. The antitussive effect of both genuine Madouling and the substitute were evaluated in guinea pigs.

Results

FINS approach based on the trnL-trnF and psbA-trnH regions readily identified the sample of Madouling in Taiwan to the seeds of Cardiocrinum giganteum var. yunnanense. Ethanol extracts of the substitute showed significant antitussive properties in guinea pigs.

Conclusion

Cardiocrinum seeds may have potential as a replacement of Aristolochia fruits.     

基于居群DNA条形码的药用植物黄芩的产地鉴别研究

目的:利用居群DNA条形码阐明不同产地(居群)黄芩的遗传分化程度,对其进行产地鉴别。方法:应用进化速率快和母系遗传的叶绿体DNA基因间序列,基于分子谱系地理学理论筛选出居群间遗传分化明显的片段,构建单倍型网状进化树,根据单倍型在网状进化树中的位置、出现的频率和地理分布范围的大小,划分出不同层次的居群DNA条形码,以用于地理分布范围宽窄不同的产地鉴别。结果:本实验筛选出3个叶绿体DNA基因间序列atpB-rbcL,trnL-trnF和psbA-trnH对17个黄芩野生居群进行分子谱系地理学分析,得到13个多态位点,共20个单倍型,其中3个分布最广、频率最高的单倍型可用于较广地域的产地鉴别,称为区域居群DNA条形码;3个分布次之、只存在于2～3个邻近居群的单倍型可用于较窄地域的产地鉴别,称为地区居群DNA条形码;另有8个仅局限在某一个居群的单倍型可用于特定居群的鉴别,称为居群特有DNA条形码。结论:叶绿体基因间序列在居群间存在明显遗传分化,可用于地理分布范围宽窄不同的黄芩产地鉴别。     

断肠草与金银花类药材水提液特异性PCR鉴定方法研究

目的: 研究断肠草与金银花类药材水提液的DNA分子鉴别方法。方法: 采集不同产地的断肠草药材13份、金银花32份、山银花21份和水银花5份,所有样品提取总DNA,并对断肠草、金银花、山银花的水提液进行DNA提取。通过对断肠草psbA-trnH片段进行扩增、测序,并搜索GenBank数据库中收录的中金银花类药材基原植物psbA-trnH序列,进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物。结果: 通过使用特异性引物对所有样品进行PCR扩增,发现断肠草可扩增出97 bp片段,而金银花类药材则不能扩增出条带。结论: 通过特异性PCR的方法实现了断肠草与金银花类药材水提液的快速、准确鉴别。     

厚朴与凹叶厚朴群体遗传学研究

目的:对厚朴与凹叶厚朴的群体遗传学进行研究,为中药厚朴的质量控制提供分子生药学方面的依据。方法:对厚朴与凹叶厚朴15个居群应用2个叶绿体基因间序列psbA-trnH和trnL-trnF进行PCR扩增并测序,计算厚朴与凹叶厚朴单倍型频率,用程序HaploNst分析遗传多样性和遗传结构,应用TCS version 1.13软件构建单倍型网状进化树。结果:厚朴与凹叶厚朴均无特有单倍型存在,但单倍型频率存在显著差异,已开始出现遗传分化的趋势,NST略大于GST。结论:厚朴与凹叶厚朴在遗传上已出现遗传分化的趋势,但尚未完全分化成彼此独立的单系。     

六味地黄丸产品优质性评价和分析

六味地黄丸是典型的"一品多家"品种,不同厂家的该产品质量良莠不齐,价格高低不一。该研究采用课题组前期建立的"以质量为核心的优质中成药评价标准",从原料选材、生产过程、质控体系、上市后再研究等多维度的全生产周期出发,开展六味地黄丸的优质评价。评价结果表明:不同厂家的产品评分差异悬殊,说明其质量差异较大;市场占有率高的产品评分整体较高,说明产品质量和市场占有率正相关,市场占有率高的企业相对更加注重产品质量,产品销售额决定了企业对其质量的关注程度;在单项评价中,"原料选材"项得分率相对较低,说明企业普遍对原料的重视度不足;"生产过程"项得分率较高,说明实施"生产质量管理规范"(GMP)对保障生产过程质量作用明显,智能制造能够提高中药产品质量;"质量评价"项得分率基本合格,说明六味地黄丸质量控制水平整体尚可,但是还有较大的提升空间;"再评价和品牌建设"项得分率最低,反映企业普遍对"一品多家"品种的深入研究和再评价重视程度不够。此次评价结果符合预期,为优质中成药评价提供了参考实例,为中成药优质优价提供了依据,为改善医保招标提供科学数据,推动中药行业健康发展。     

六味地黄丸干预绝经后骨质疏松症患者基因表达谱分析

目的探讨中药六味地黄丸干预绝经后骨质疏松患者的分子机制并分析预测其靶标和药物作用通路。方法检索并下载GEO中与采用六味地黄丸干预绝经后骨质疏松症的微阵列基因表达数据集。通过获取的基因表达数据集,分析六味地黄丸干预前后绝经后骨质疏松症患者血液中差异表达基因变化,并将这部分差异表达基因与在绝经后骨质疏松症患者和正常绝经女性血液中差异表达的基因取交集,获得两对比组中共同差异表达的基因。通过基因本体论数据库(GO)对获得的共同差异表达基因分别从生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组分(CC)三方面进行功能富集分析;利用京都基因和基因组百科全书数据库(KEGG)进行通路富集分析。利用生物通用交互数据集库(BioGRID)分析获得与共同差异表达基因产物互作的蛋白质,并构建蛋白质-蛋白质互作关系(PPI)网络,采用Cytoscape软件实现蛋白质-蛋白质互作关系网络的可视化。应用中医药数据库(BATMAN-TCM)对六味地黄丸主要中药成分的靶标基因进行预测。结果六味地黄丸干预后,得到1 350个差异表达基因,其中上调表达基因322个,下调表达基因1 027个。58个共同差异表达基因与六味地黄丸干预绝经后骨质疏松的分子机制相关,六味地黄丸干预后43个基因下调,15个基因上调。六味地黄丸主要中药成分的10个共同差异表达基因靶标为ESR1, FGFR2, MED1, PGR, PRKCB, PTGS1, PTGS2, TRIM24, VDR, WNT4。与六味地黄丸干预组差异表达基因对比分析,ATF2, FBXW7以及RDX基因在干预后呈现显著差异表达。结论 ATF2, FBXW7和RDX基因为参与六味地黄丸干预绝经后骨质疏松分子调控机制的关键基因。六味地黄丸主要中药成分的10个共同靶标基因中,ESR1, FGFR2, MED1, WNT4为六味地黄丸干预治疗绝经后骨质疏松等相关内分泌疾病的潜在调控基因。