灰树花多糖治疗卵巢癌体外实验观察

目的体外实验探讨灰树花多糖治疗卵巢癌的作用。方法以不同浓度灰树花多糖(终浓度为100、250和500μg/ml)处理人SKOV3细胞,台盼蓝染色和MTT检测对细胞增殖的抑制作用,Annexin V/PI双标记流式细胞术检测与荧光显微镜观察检测细胞凋亡。另设阴性对照组,仅用培养液;10μg/ml顺铂(DDP)作为阳性对照。结果台盼蓝排染和MTT检测证实,灰树花多糖明显抑制SKOV3细胞增殖;Annexin V/PI双染流式细胞术检测显示,灰树花多糖100、250、500μg/ml作用细胞24、48、72 h均能诱导细胞凋亡,凋亡率与时间、剂量存在依赖关系;Annexin V/PI双染荧光显微镜观察检查细胞凋亡率显示了与流式细胞术检测类似结果。结论灰树花多糖显著抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖并诱导细胞凋亡。     

自噬基因Beclin1对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 观察自噬基因Beclin 1在人卵巢癌细胞株SKOV3中过表达对肿瘤细胞在体内、体外生长活性的影响.方法 脂质体法将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染人卵巢癌细胞株SKOV3,MTT法分析外源性Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,流式细胞仪检测转染后肿瘤细胞的凋亡及自噬情况.将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后,接种到裸鼠皮下,观察体内致瘤活性及生长情况;免疫组化检测瘤组织Beclin1蛋白的表达.结果 Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%;pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3的凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.重组质粒pcDNA3.1/Beclin1使SKOV3细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积及质量明显小于空质粒组和空白对照组,抑瘤率为50.27%.结论 自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可抑制SKOV3在体内、体外的增殖,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性.     

Smac小分子compound3调节顺铂诱导卵巢癌细胞SKOV3凋亡的研究

目的探讨Smac小分子compound 3调节顺铂对卵巢癌细胞SKOV3凋亡及生长抑制作用。方法噻唑蓝法检测Smac小分子compound 3单独应用组、顺铂单独应用组及二者联合应用组对卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制率、存活率的影响;并绘制生长曲线。Annexin V/PI双标流式细胞术检测Smac小分子compound 3单独应用组、顺铂单独应用组及二者联合应用组对SKOV3凋亡率的影响。Western印迹检测Smac小分子compound 3单独应用组、顺铂单独应用组及二者联合应用组对SKOV3的X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosisprotein,XIAP)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达影响。结果 Smac小分子compound 3单独应用组、顺铂单独应用组及二者联合应用组12、24、48 h SKOV3生长受到抑制,且呈时间依赖性。二者联合应用组与顺铂单独应用组比较生长抑制率明显升高。二者联合应用组的凋亡率高于顺铂单独应用组及Smac小分子compound 3单独应用组。Smac小分子compound 3单独应用组及二者联合应用组SKOV3的XIAP表达降低,二者联合应用组的caspase-3的激活片段表达明显高于其他两组。结论 Smac小分子compound 3能够调节顺铂对SKOV3生长抑制作用,促进顺铂对卵巢癌细胞SKOV3凋亡作用。Smac小分子compound 3通过影响XIAP的表达来实现其促凋亡及生长抑制作用。     

脐带间充质干细胞对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)抑制人卵巢癌SKOV3细胞增 殖及促进其凋亡的作用。方法：采用Transwell共培养观察UC-MSCs向卵巢癌细胞靶向归巢的作用;MTT 实验检测UCMSCs 条件培养基抑制SKOV3细胞增殖情况;Annexin V-FITC/PI双染法检测其凋亡率;实时PCR检测与SKOV3细胞增殖 和凋亡相关基因Ki-67,Bax,Bcl-2的表达。结果：UC-MSCs体外向SKOV3细胞靶向归巢。MTT 结果显示UC-MSCs条件 培养基明显抑制SKOV3细胞的增殖(P<0.01)。Annexin V-FITC/PI双染法提示75%条件培养基组的凋亡率明显高于对照 组(P<0.05)。实时PCR发现增殖相关基因Ki-67的表达明显下降(P<0.01),凋亡相关基因Bcl-2的表达明显降低(P<0.01), Bax的表达明显增加(P<0.01)。结论：UC-MSCs体外能向卵巢癌细胞靶向归巢,通过调节增殖相关基因Ki-67的表达, 抑制SKOV3细胞增殖;通过调节凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达,促进SKOV3细胞凋亡。     

姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制作用及机制研究

目的:探讨姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制、诱导凋亡作用及其分子作用机制。方法:MTT法检测姜黄素对MCF-7细胞的增殖抑制作用;流式细胞术PI单染法检测细胞周期;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡;RT-PCR法检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax的mRNA表达水平。结果:姜黄素对MCF-7细胞生长有明显抑制作用,并呈剂量、时间依赖性;FCM结果显示姜黄素能使MCF-7细胞阻滞在G1/S期;Annexin V/PI双染法验证姜黄素可以诱导细胞凋亡;RT-PCR结果显示Bax mRNA水平明显上调,而Bcl-2的mRNA表达水平降低。结论:姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖具有显著的抑制作用并可诱导细胞凋亡,其作用机制可能与其上调Bax基因表达水平的同时,下调Bcl-2基因表达水平,从而诱导细胞凋亡有关。     

龙葵碱调控还原型谷胱甘肽和活性氧氧化还原体系损伤线粒体

目的 探讨龙葵碱诱导 HepG2 细胞凋亡与线粒体损伤的关系。 方法 倒置显微镜观察细胞形态,Annexin V/PI 双染激光共聚焦扫描显微术检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞凋亡率。透射电镜观察细胞线粒体超微结构,CDFH-DA 染色激光共聚焦扫描显微术检测活性氧 (ROS) 相对量,比色法检测还原型谷胱甘肽 (GSH) 量。 结果 龙葵碱组 HepG2 细胞贴壁细胞数量减少,部分出现死亡。Annexin V/PI 双染激光共聚焦扫描显微镜下观察发现龙葵碱组细胞 Annexin V-FITC 高染,细胞膜呈绿色荧光;PI 低染,细胞核呈红色荧光,呈现明显的早期凋亡特征。流式细胞术分析 0.4、2、10 μmol/L 龙葵碱作用 HepG2 细胞 24 h 后,早期凋亡率分别为 4.0%、8.5%、20.1%。透射电镜观察发现龙葵碱作用 HepG2 细胞 24 h,细胞线粒体超微结构出现肿胀,嵴排列紊乱、嵴消失,重度空泡样变性等变化;细胞内 ROS 水平升高,GSH 的水平降低。 结论 龙葵碱通过降低 HepG2 细胞内 GSH 量,使 ROS 不能被及时清除而损伤线粒体结构,导致 HepG2 细胞凋亡。     

自噬基因Beclin 1在SKOV3细胞中的表达及其调控相关信号传导途径的研究

目的探讨自噬基因Beclin 1在人卵巢癌SKOV3细胞中过表达后自噬相关信号调控通路PI3K/PKB途径中ClassⅠPI3K（p110α）、p-PKB和ClassⅢPI3K（hvps34）的表达变化以及对肿瘤细胞的自噬活性的影响.方法将自噬基因Beclin 1的真核表达载体pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞;分别用荧光定量RT-PCR和Western blot在mRNA和蛋白水平检测用流式细胞仪检测Beclin1、p110α、hvps34和p-PKB的表达;在电镜和荧光显微镜下观察自噬现象,用流式细胞仪检肿瘤细胞自噬情况.结果 pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞Beclin1表达在mRNA和蛋白质水平明显高于转染空质粒pcDNA3.1和未转染细胞;PcDNA3.1/Beclin1转染后hvps34表达上调,而p110α、p-PKB的表达下调.PcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后在在电镜下可见大量自噬囊泡形成.在荧光显微镜下见pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞中MDC阳性细胞明显增加.流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%.结论自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可使ClassⅢPI3K（hvps34）表达上调,ClassⅠPI3K（p110α）及其下游的p-PKB表达下调,诱导肿瘤细胞自噬活性增加,抑制SKOV3在体外的增殖.     

p53基因与PTEN基因共转染对膀胱癌T24细胞凋亡的影响

目的探讨抑癌基因p53和PTEN基因共转染膀胱肿瘤T24细胞后对其凋亡的影响。方法将p53、PTEN基因以及p53联合PTEN基因分别转染到T24细胞;目的基因的表达采用RT-PCR法检测;细胞的生长抑制作用通过细胞集落形成实验进行测定;Western blotting法检测蛋白表达;AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测p53基因和PTEN基因对T24凋亡的影响。结果荧光显微镜下观察到p53、PTEN及两个基因同时在T24细胞系中成功表达;T24细胞的集落数量及大小均有不同程度的降低,以共转染组降低最为明显（P〈0.05）,Western blotting法检测共转染组蛋白表达水平明显高于PTEN组或p53组（P〈0.05）;共转染组凋亡率明显高于p53基因单转染组、PTEN基因单转染组以及空载体转染组（P〈0.05）。结论 p53和PTEN基因均能诱导膀胱癌T24细胞的凋亡,且这两个基因具有协同作用。     

三氧化二砷诱导卵巢癌细胞株SKOV3凋亡对端粒酶活性的影响

目的探讨三氧化二砷诱导卵巢癌细胞株SKOV3凋亡时对端粒酶活性的影响。方法不同浓度的As2O3溶液作用卵巢癌细胞SKOV3,在不同时间点收集细胞,MTT法检测细胞生长抑制率;FCM检测细胞凋亡率;TRAP-银染法观察端粒酶活性的变化。结果 As2O3溶液对SKOV3细胞有生长抑制和诱导凋亡的作用。As2O3作用SKOV3细胞24 h,端粒酶活性无明显下降,但有凋亡现象,凋亡率为6.15%。随着作用时间的延长,凋亡率逐渐上升,端粒酶活性逐渐下降。随着药物浓度的升高端粒酶活性也呈不断下降趋势,以至消失。结论 As2O3诱导SKOV3凋亡与端粒酶活性有一定相关性,但端粒酶活性的下降可能不是As2O3诱导细胞凋亡的早期事件。     

抗BCR-ABL mRNA核酶诱导K562细胞凋亡效应的研究

目的探索利用抗慢性髓细胞性白血病BCR-ABL mRNA的核酶表达载体转染K562细胞诱导细胞凋亡的效应.方法应用X-tremeGENEQ2介导pAVGS4转染K562细胞,设置空载体作为对照,在转染后的24、48、72和96 h分别用Annexin V PI双染色、TUNEL等法通过流式细胞仪检测K562细胞凋亡率的变化,在转染后72 h利用电子显微镜观察细胞形态学变化.结果pAVGS4转染K562细胞72 h,电镜显示实验组可见大量典型的凋亡细胞,而对照组凋亡细胞少见;Annexin V PI和TUNEL法通过流式细胞仪检测均发现在转染后24 h,实验组和对照组K562细胞的凋亡率无明显差别(P＞0.05),随着转染后时间的推移实验组细胞凋亡率进行性增加,而空载体对照组的凋亡率变化不大.结论pAVGS4可有效诱导K562细胞发生凋亡,核酶M1RNA有望成为分子靶向治疗有用的工具之一.     

miR-98前体转染卵巢癌细胞的效率检测及增殖抑制检测

目的 pre-hsa-miR-98转染卵巢癌SKOV3、HO8910和A2780细胞,观察转染率并研究转染后对卵巢癌细胞的增殖抑制作用,为卵巢癌新治疗方法研究提供实验依据。方法利用构建的pre-hsa-miR-98质粒HmiR和连接随机序列的质粒CmiR转染人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910和A2780细胞,荧光显微镜观察和流式细胞仪计数计算转染率,MTT法检测转染对卵巢癌细胞的增殖抑制作用。结果 HmiR转染后24 h,荧光显微镜下观察,SKOV3、HO8910、A2780细胞的转染率分别为61.50%、68.59%、63.40%;流式细胞术计数,转染HmiR后SKOV3、HO8910、A2780细胞的转染率分别为57.93%、66.73%、58.59%。转染HmiR后,MTT法检测SKOV3、HO8910、A2780细胞的增殖抑制率随转染时间延长而增加,72 h达到49.54%、53.25%、46.09%。结论三种卵巢癌细胞的转染率均接近或超过60%,HmiR转染后可抑制卵巢癌细胞增殖,其抑制作用随转染时间延长而增强。     

Pre-let-7d转染卵巢癌细胞转染率的研究

目的研究Pre-let-7 d质粒在不同时间,以不同浓度转染人卵巢癌细胞的转染率。方法将构建的Pre-let-7 d质粒HmiR和连接随机序列的质粒CmiR转染人卵巢癌SKOV3、HO8910细胞,用荧光显微镜与流式细胞仪计数两种方法计算转染率。结果转染HmiR、CmiR后,荧光显微镜观察和流式细胞术计数结果显示SKOV3、HO8910细胞的转染率,以3μg质粒/孔转染SKOV3、HO8910人卵巢癌细胞比2μg、4μg质粒/孔的转染率高,24 h、48 h、72 h三个不同时间点用相同质量的质粒转染,转染率无显著差异。结论转染HmiR、CmiR后,荧光显微镜观察和流式细胞术计数结果显示以3μg质粒/孔转染SK-OV3 HO8910人卵巢癌细胞的转染率均在60%左右,符合实验要求。     

5-ALA治疗和hTERT mRNA的反义寡核苷酸联合应用对人卵巢癌细胞的杀伤作用及其机制

目的：观察5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）光动力治疗（PDT）和人端粒酶催化亚单位 (hTERT) mRNA的反义寡核苷酸（ASODN)联合应用对人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制及促凋亡作用,探讨两种方法联合应用协同促进对人卵巢癌3AO细胞的杀伤作用机制。方法：采用MTT法筛选不同浓度5-ALA 和激光能量照射对人卵巢癌3AO细胞增殖抑制作用的最佳组合参数; RT-PCR法检测hTERT ASODN和SODN转染后hTERT mRNA表达水平的变化。将人卵巢癌3AO细胞分为空白
对照组、hTERT ASODN转染组、hTERT SODN转染组、5-ALA PDT组、hTERT ASODN转染+5-ALA PDT组和hTERT SODN转染+5-ALA PDT组,应用MTT法检测各组人卵巢癌3AO细胞增殖抑制率;应用膜联蛋白V-硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)/碘化丙啶(PI)双染色结合流式细胞术检测
各组人卵巢癌3AO细胞凋亡率。结果：5-ALA PDT对人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制作用随着光敏剂浓度的增加和激光能量的增大而增加(P<0.05);不同浓度hTERT ASODN转染人卵巢癌3AO细胞24 h后,hTERT mRNA表达水平呈浓度依赖性下调(P<0.05),而hTERT-SODN对人卵巢癌3AO细胞hTERT mRNA表达无显著影响(P>0.05)。hTERT ASODN转染+5-ALA PDT (5-ALA浓度为0.5 mmol•L-1,激光能量密度为2.50 J•cm-2)组人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制率高于5-ALA PDT组和hTERT ASODN组(P<0.05)。hTERT ASODN转染+5-ALA PDT组人卵巢癌3AO细胞的凋亡率为29.28％,显著高于hTERT ASODN 转染组（12.79％）和5-ALA PDT组（21.19％)(P<0.05）。结论：hTERT ASODN转染与5-ALA PDT联合治疗可协同增强对人卵巢癌3AO细胞的增殖抑制作用,其机制可能与联合作用促进细胞凋亡有关联。     

转染pre-hsa-miR-98对BV-2细胞活化和凋亡的影响

目的 用pre-hsa-miR-98转染鼠小胶质细胞系BV-2细胞, 观察转染率、转染后细胞活化或凋亡的影响。方法 构建pre-hsa-miR-98质粒HmiR和对照质粒CmiR转染BV-2细胞,荧光显微镜与流式细胞仪计数计算转染率,MTT法检测细胞增殖抑制率,TUNEL法流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 转染后, 荧光显微镜观察和流式细胞术计数显示两组细胞转染率均达60%左右。转染HmiR后,MTT法检测细胞增殖率随转染时间延长有所降低。转染后各组细胞凋亡率比较,差异无统计学意义。结论 构建的pre-hsa-miR-98质粒HmiR和对照质粒CmiR能成功转染BV-2细胞,细胞增殖率比较差异不明显,转染后未明显诱导细胞凋亡,可用于后续研究。     

THY1基因对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 构建THY1真核表达质粒,并探讨THY1基因对上皮性卵巢癌细胞系SKOV3生长的影响.方法 通过RT-PCR方法,从人正常卵巢组织中获得THY1基因,将其插入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建成重组质粒pcDNA3.1( )-THY1,并转入大肠杆菌JM109,筛选出含有正确插入片段的克隆,经PCR、酶切及DNA测序鉴定;脂质体介导法转染SKOV3细胞并筛选稳定表达(SKOV3-THY1组),同时设空质粒转染组(SKOV3-Null组)和空白对照组(SKOV3组),RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达情况;MTT法和流式细胞术检测THy1对SKOV3细胞生长和凋亡等生物学行为的影响.结果 经过PCR、酶切及DNA测序证实,外源性THY1基因正确插入到真核表达质粒pcD-NA3.1( )中,RT-PCR和western blotting证实此重组质粒已整合于SKOV3细胞并获稳定表达;MTT法结果提示SKOV3-THYl组的细胞抑制率(第5天的细胞抑制率为56.6%)明显高于SKOV3-Null组(12.5%)(P＜0.05);流式细胞术检测结果显示,SKOV3-THY1组凋亡率(31.8%)明显高于SKOV3-Null组(10.5%)和SKOv3组(9.8%),差异有统计学意义(P＜0.05),SKOV3-Null组和SKOV3组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了THY1真核表达质粒pcDNA3.1( )-THY1,该质粒转染SKOv3细胞可抑制其生长,THY1基因可能在上皮性卵巢癌发生、发展的过程中起重要作用.     

抑癌基因PTEN对人结肠癌LoVo细胞生长的影响

目的:探讨PTEN基因转染对结肠癌LoVo细胞的抑制作用。方法:将人野生型及突变型PTENcDNA通过脂质体导入结肠癌细胞LoVo中,并用RT-PCR、流式细胞术检测细胞的PTENmRNA和蛋白质表达。用流式细胞仪和MTT法分析5-Fu对转染前后LoVo细胞抑制周期和诱导凋亡的能力。结果:转染野生型PTEN基因可明显增强结肠癌LoVo细胞的PTEN表达,5-Fu对转染后的LoVo细胞抑制细胞周期和诱导凋亡的作用明显增强。突变型在结肠癌细胞LoVo中有表达但无明显抑制作用。结论:转染的PTEN基因可显著上调结肠癌LoVo细胞的PTEN表达,促进细胞凋亡;联合应用PTEN基因转染和5-Fu可获得协同的细胞毒作用。     

MicroRNA-20b在卵巢癌细胞中的表达及对增殖和凋亡的影响

探讨microRNA-20b（miR-20b）在卵巢癌细胞系中的表达及对增殖和凋亡的影响。方法实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）测定miR-20b 在卵巢癌细胞系A431、SKOV3 及正常卵巢上皮细胞系Hose 中的相对表达量,将SKOV3 细胞系分成未转染对照、阴性对照及miR-20b 模拟物组,用Lipofectamine2000 分别不转染、转染miR-20b scramble 和miR-20b mimics,CCK8 实验测定3 组细胞增殖能力,流式细胞术测定3 组细胞凋亡,Western blot测定张力蛋白同源在10 号染色体有缺失的磷酸酶（PTEN）、裂解型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的相对表达量。结果qRT-PCR示A431、SKOV3细胞系miR-20b 相对表达量较Hose 细胞系低;miR-20b 模拟物组在0、24、48、72 及96 h的OD45 nm 值低于未转染对照组和阴性对照组;miR-20b 模拟物组凋亡率高于阴性对照组和未转染对照组;miR-20b 模拟物组PTEN 相对表达量低于阴性对照组,裂解型PARP蛋白相对表达量高于阴性对照组。结论miR-20b 抑制卵巢癌细胞增殖并促进凋亡,其机制可能与下调PTEN 和上调PARP 蛋白表达有关。     

抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及对人卵巢癌细胞系SW626增殖的影响

目的 构建抑癌基因PTEN的真核表达载体,研究外源性PTEN基因稳定表达对人卵巢癌细胞系SW626体外增殖的影响.方法 构建PTEN基因的真核表达载体pcDNA3.1/PTEN,转染重组质粒pcDNA3.1/PTEN于体外培养的人卵巢癌细胞系SW626,筛选并获得稳定表达PTEN基因的细胞克隆,应用RT-PCR和western blot分析PTEN基因的mRNA及蛋白质表达,MTT实验分析细胞增殖能力.结果 稳定转染PTEN基因的细胞系有外源目的 基因的mRNA及其蛋白表达.MTT实验表明,pcDNA3.1/PTEN 转染组细胞增殖能力低于pcDNA3.1(-)转染组和对照组 (P＜0.05).结论 外源性抑癌基因PTEN的稳定表达可抑制人卵巢癌细胞系SW626的增殖.