人胎盘源与人骨髓源间充质干细胞的生物学性状比较

人骨髓源间充质干细胞具有很好的临床应用价值,但数量和取材都有限,而人胎盘源间充质干细胞则相反,目前已成为再生医学的重要细胞来源和最具临床应用前景的功能干细胞。 目的：比较人胎盘源间充质干细胞和人骨髓源间充质干细胞体外分离培养、扩增及生物学性状的差异。 方法：采用胶原酶消化法分离人胎盘组织,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,分别加入体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM 培养液,待细胞汇合至90%后消化传代。分别取第3代的人胎盘和骨髓间充质干细胞,按1×106 浓度接种,当细胞达70%~80%融合时,换成成脂细胞诱导分化培养液,诱导16 d。 结果与结论：胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞均成贴壁生长、形态均一的成纤维样细胞梭形外观,但后者体积略小。两种细胞均高表达CD29、CD44,不表达CD34、CD106。二者均可分化为脂肪细胞。可见,从胎盘和骨髓中培养出的间充质干细胞在细胞形态、生长特性等方面基本相似,在体外均可有效扩增并成脂肪分化,均可作为组织工程的另一成体干细胞来源,而胎盘源间充质干细胞具有更好的应用前景。     

成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性研究

目的研究体外培养的成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性。方法对骨髓源性神经干细胞分别进行细胞形态学观察、刀豆球蛋白A凝集试验和双层软琼脂培养以探明其是否具有恶性转化细胞的形态特征、表面结构及生长特性的变化：利用免疫细胞化学的方法检测骨髓源性神经干细胞的端粒酶和肿瘤相关基因的表达：将骨髓源性神经干细胞接种到裸鼠体内观察其成瘤性。结果骨髓源性神经干细胞不具有恶性转化细胞的形态特征，在不同刀豆球蛋白A浓度下均未见明显的凝集反应，在双层软琼脂不能形成细胞克隆；骨髓源性神经干细胞的c-myc、c-fos和p53基因均呈阴性表达，而端粒酶逆转录酶呈弱阳性表达：将骨髓源性神经干细胞接种于裸鼠皮下6个月未见肿瘤形成，亦未见其它组织形成。结论骨髓源性神经干细胞保持了正常细胞的生物学特征．体内和体外的各项指标均未提示其具有致瘤性．体外的培养条件没有使其发生恶性转化．从致瘤性方面证实了骨髓源性神经干细胞临床移植的安全性。     

胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的免疫调节*☆◆

背景：众多研究表明间充质干细胞能发挥免疫调节功能,抑制T细胞增殖。 目的：观察胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的调节作用。 方法：将人胚胎骨髓间充质干细胞与正常人外周血单个核细胞或CD4+ T细胞以1∶10比例共培养4 d,以单个核细胞或CD4+T细胞单独培养为对照。应用实时定量PCR检测细胞白细胞介素17 mRNA表达,酶联免疫吸附试验检测细胞上清中白细胞介素17蛋白水平,流式细胞术检测Th17细胞数量。 结果与结论：胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞共培养组白细胞介素17 mRNA表达水平明显高于单个核细胞组(P < 0.01)。与此一致的是,胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞或CD4+T细胞共培养组细胞上清中白细胞介素17蛋白水平明显高于单个核细胞组、CD4+ T细胞组(P < 0.05,P < 0.01)。胚胎骨髓来源间充质干细胞与CD4+ T细胞共培养组Th17细胞数量明显高于CD4+ T细胞组(P < 0.01),但胚胎骨髓来源间充质干细胞本身并不表达白细胞介素17。表明胚胎骨髓来源间充质干细胞可促进人Th17细胞增殖。     

成年大鼠骨髓间质干细胞的生物学特性研究

目的 建立大鼠骨髓间质于细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）分离及培养的方法,探讨体外培养MSCs的生物学特性。方法 通过全骨髓贴壁法分离培养大鼠MSCs,镜下连续观察细胞的形态变化。应用流式细胞仪测定细胞周期,并研究其增殖及生长特征。结果 原代及传代培养显示,10代以前的MSCs具有活跃的增殖能力,细胞周期分析显示有168％的MS＆处于S＋G2／M期。MS＆细胞形态可呈梭形、圆形或椭圆形,经传代融合时呈漩涡状、菊花状排列。结论 体外培养10代以前的MSCs生长稳定,增殖较快,为进一步开展中枢神经系统疾病的移植治疗提供了细胞来源。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经类细胞分化

BACKGROUND： Chemical induction has been shown to be effective at promoting the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells （MSCs）. However, these inductors have cytotoxicity side effects that may damage cells over time. Traditional Chinese medicines avoid this disadvantage while still producing effective induction.
OBJECTIVE： To investigate the influence of RadixAstragafi （Huangql） on the differentiation of MSCs.
DESIGN, TIME AND SETTING： In vitro study of traditional Chinese medicine in neural stem cell differentiation. The experiment was performed at the Central Laboratory of Hebei North University between April and June 2007.
MATERIALS： Radix Astragafi solution （lot No. 060105; license No. Z53021585） was purchased from Dali Pharmaceutical Co., Ltd., China; rabbit anti-rat nestin, rabbit anti-rat neuron-specific enolase （NSE）, mouse anti-rat microtubule-associated protein 2, and rabbit anti-rat glial fibrillary acidic protein were purchased from Wuhan Boster, China.
METHODS： Whole bone marrow was isolated from the femur and tibia of 6-week-old male Wistar rats and subcultured. The fourth passage of MSCs were harvested and induced by different concentrations （50, 100, 200, 400 g/L） of Radix Astragali.
MAIN OUTCOME MEASURES： Hematoxylin-eosin staining was used to observe MSC morphology after 24 hours of induction. Immunocytochemistry was employed to observe the expression of NSE （specific neuronal marker）, nestin （marker of neural stem cell）, glial fibrillary acidic protein and microtubule-associated protein 2 （markers of astrocytes）.
RESULTS： Following Radix Astragali treatment, changes occurred in cell morphology including： cell body pyknosis; thin and long processes formed in some cells, with growth corresponding to drug concentration and induction time; and the formation of network-like connections between some cells. With increasing drug concentration and induction time, nestin expression was upregulated, and the number of positive cells increased; cells produced NSE, glial fibrillary acidic protein and microtubule-associated protein 2; nestin was expressed earlier than glial fibrillary acidic protein and microtubule-associated protein 2 expression. In addition, the number of NSE-positive cells was increased significantly more than glial fibrillary acidic protein-positive cells.
CONCLUSION： Radix Astragafi promoted process formation in stem cells. It may induce the differentiation of MSCs into neural stem cells, and subsequently into neuronal- and glial-like cells. Radix Astragafi exhibits stronger inductive effect on neuronal differentiation than glial differentiation of MSCs.     

骨髓和脂肪来源间充质干细胞的免疫调节作用☆

背景：脂肪来源的间充质干细胞是否具有和骨髓来源间充质干细胞类似的免疫调节作用?目的：观察骨髓来源和脂肪来源间充质干细胞的免疫学特征。方法：分离骨髓和脂肪来源的间充质干细胞,分别检测它们对T细胞周期、活化、抑制和增殖的作用情况。结果与结论：骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞同样具有抑制T细胞增殖的能力,在有丝分裂原刺激和混合淋巴细胞反应的T细胞增殖中这种作用都是具有剂量依赖性的,在1︰2时有极强的抑制作用,但是在1︰100时这种作用基本消失,在共培养时骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞都可以使更多的T细胞被抑制在G0/G1期,同时也可以抑制T细胞的早期活化,但是上述作用脂肪来源的间充质干细胞均较骨髓来源间充质干细胞弱,且脂肪来源的间充质干细胞并不具有抑制T细胞凋亡的作用。     

无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞

背景：传统的胚胎来源和脑来源的神经干细胞由于取材困难,并受伦理道德的约束,应用受到极大限制。 目的：拟利用无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞。 方法：抽取大鼠股骨和胫骨的骨髓,采用全骨髓培养及贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞周期及细胞免疫表型,油红O染色及茜素红染色鉴定其成骨、成脂能力。取传至4~6代的大鼠骨髓间充质干细胞,加入含表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清神经培养基进行诱导,采用免疫荧光染色及流式细胞仪予以鉴定。 结果与结论：P5骨髓间充质干细胞(91.5±3.1)%处于G1期,高表达CD90及CD29,不表达CD45及CD34,成脂诱导后在胞质中可见桔红色脂滴,成骨诱导后可见黑色矿化结节。骨髓源性神经干细胞巢蛋白免疫荧光染色呈阳性,流式细胞仪检测其阳性率为(97.2±1.1)%,NSE,β-Tubulin,GFAP及MAP-2抗原免疫荧光染色均呈阳性表达。表明在无血清神经培养基中加入特定生长因子,骨髓间充质干细胞可诱导为神经干细胞;在体外适当条件下,骨髓源性神经干细胞具有增殖和分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力。     

骨髓间充质干细胞在周围神经系统的应用

1968年。Friedenstein发现骨髓中存在一类可以单克隆形式增殖．在体外培养过程中细胞形态与集落方式类似成纤维细胞的细胞，这类细胞与造血干细胞完全不同。实验发现在体外培养这类细胞的过程中，严格控制其所处的微环境，这类细胞可向骨、软骨、脂肪．肌肉、神经元及神经胶质细胞等间充质来源的细胞类型分化，在体内移植后同样具有这一特性，因而将其命名为骨髓间充质干细胞。[第一段]     

成人骨髓源性神经干细胞高迁移能力的基因分析

目的 检测成人骨髓源性神经干细胞(Md-NSCs)中与细胞侵袭转移相关基因的表达情况,研究Md-NSCs在中枢神经系统中具有高迁移能力的基因基础. 方法 自正常成人志愿者获取成人骨髓基质细胞(BMSCs),于体外诱导培养获得Md-NSCs,应用寡核苷酸基因芯片检测Md-NSCs中与细胞侵袭转移相关基因的表达情况;应用实时定量PCR(RT-PCR)检测验证基因芯片的结果.结果 基因芯片检测结果显示,与新鲜正常成人骨髓细胞去红细胞相比较,Md-NSCs中与细胞侵袭转移相关基因(MMP1、MMP2、MMP17、ITGA3、RhoB、RhoC及RhoD)均呈高度表达:RT-PCR检测结果显示.MMP2、ITGA3、RhoC在Md-NSCs中高度表达,分别为新鲜正常成人骨髓细胞去红细胞含量的2.84×100倍、2.22×102倍及4.92×100倍. 结论 Md-NSCs在中枢神经系统中具有高迁移能力可能与该细胞中促进细胞侵袭转移相关基因的高度表达相关.另外.这些高度表达的基因属于重要的癌基因.因此对Md-NSCs致瘤性问题的深入研究值得重视.     

引产儿与正常成人骨髓间充质干细胞的比较*

背景：骨髓间充质干细胞是多能干细胞,同时可参与免疫调节反应,而成人及引产胎儿骨髓均是间充质干细胞的重要来源。 目的：通过引产儿与正常成人骨髓间充质干细胞的细胞形态、免疫表型、增殖活性及分泌细胞因子的比较,揭示二者生物学特点的差异。 方法：采用密度梯度离心法分离引产儿与正常成人骨髓单个核细胞,通过贴壁法培养骨髓间充质干细胞,收集传3代后的骨髓间充质干细胞,流式细胞术鉴定其免疫表型、MTT比色法检测其增殖活性以及用ELISA法检测细胞培养上清液中白细胞介素6、血小板源性生长因子和表皮生长因子的水平。 结果与结论：引产儿组和正常成人组骨髓间充质干细胞形态相似、表型相同,分泌细胞因子水平无显著差异,但引产儿细胞增殖活性显著高于正常成人。提示引产儿与正常成人骨髓间充质干细胞除增殖活性有差异外,其余生物学特点相似,引产儿可以为间充质干细胞研究提供新的骨髓来源。     

胎儿骨髓源Flk1+间充质干细胞的归巢机制

背景：间充质干细胞移植后是否成功,依赖于经静脉输注后能否定居于靶器官并长期存活,这个过程被称为归巢。然而,调节和控制间充质干细胞归巢的分子机制目前尚不十分清楚。 目的：探讨胎儿骨髓源Flk1+间充质干细胞向骨髓归巢的机制,观察基质细胞衍生生长因子1及其受体CXCR4对干细胞归巢效率的影响,摸索提高其归巢和长期植入效率的方法。 设计、时间及地点：细胞学体内实验,于2005-09/2006-07在中国医学科学院、中国协和医科大学组织工程中心完成。 材料：Flk1+骨髓间充质干细胞来源于流产胎儿,由天津医科大学第二附属医院妇产科提供。6~8周龄NOD/SCID小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所。 方法：采用流式细胞仪、实时定量PCR等方法检测特定细胞因子刺激前后Flk1+间充质干细胞CXCR4表达和体外迁移能力的变化。NOD/SCID小鼠预先经全身亚致死量照射后,从尾静脉输入经或未经细胞因子刺激的Flk1+间充质干细胞,对照组注射等体积生理盐水。移植后24 h,应用流式细胞仪分析骨髓中供体细胞的含量,或在移植后定期从小鼠的尾静脉取血,分析外周血中白细胞、红细胞及血小板的数量变化。移植后6个月,实时定量PCR法检测小鼠骨髓中的人特异性DNA含量,了解人源细胞的植入情况。 结果：Flk1+间充质干细胞的胞浆中有CXCR4表达,在适当细胞因子刺激下,能够在短时间内被诱导至细胞表面表达。通过24 h短时间细胞因子刺激,不仅能够上调细胞表面及内部的CXCR4,而且可以增加细胞在体外沿基质细胞衍生生长因子1浓度梯度迁移的活性,促进细胞植入经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠体内后向骨髓的归巢及长期存活,同时也加快了受体小鼠的造血恢复;用CXCR4中和抗体处理的Flk1+间充质干细胞,则明显减少其移植后在受体小鼠中的归巢和植入。 结论：基质细胞衍生生长因子1及其受体CXCR4在Flk1+间充质干细胞迁移和归巢中发挥着重要作用,增加细胞表面CXCR4的表达,有助于促进Flk1+间充质干细胞向骨髓归巢和加快受体造血恢复。     

Transplantation of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells for traumatic brain injury

Results from the present study demonstrated that transplantation of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells into the lesion site in rat brain significantly ameliorated brain tissue pathological changes and brain edema, attenuated glial cell proliferation, and increased brain-derived neurotrophic factor expression. In addition, the number of cells double-labeled for 5-bromodeoxyuridine/glial fibrillary acidic protein and cells expressing nestin increased. Finally, blood vessels were newly generated, and the rats exhibited improved motor and cognitive functions. These results suggested that transplantation of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells promoted brain remodeling and improved neurological functions following traumatic brain injury.     

体外培养骨髓源性神经干细胞的细胞遗传学分析

目的评价体外培养的成人骨髓源性神经干细胞的遗传稳定性。方法制备骨髓源性神经干细胞的染色体标本，以常规染色和G显带进行染色体的核型分析。结果体外培养的成人骨髓源性神经干细胞的染色体数目为正常人类的46条染色体，未见非整倍体染色体像；G显带图像核型分析显示其为二倍体正常核型，染色体中未发现有缺失、倒位、易位、双着丝粒和环状染色体等结构异常。结论体外培养分化形成的骨髓源性神经干细胞保持了遗传学上的稳定性．为其进一步的临床应用提供了实验依据。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和定向神经分化

目的 探讨成人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和定向神经诱导分化的条件.方法 从正常成人志愿者髂骨中分离获取MSCs,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,以含有脑源性生长因子(BDNF)联合维A酸(RA)的培养液对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学法对诱导后的细胞鉴定.结果 诱导1h有部分细胞表达神经干细胞标志巢蛋白nestin,6h后大部分细胞具有典型神经元形态.表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞占细胞总数的(46.45±2.54)%.结论 MSCs可通过体外培养并纯化,应用BDNF联合RA可以在体外诱导MSCs成为神经元样细胞.     

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化：Wnt3a信号分子的诱导作用**

背景：Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节。已有证据显示此通路参与了对神经前体细胞增殖、分化以及决定细胞命运的调控。目前有关Wnt信号通路对间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用还少见报道。目的：寻找促进间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。方法：采用密度梯度离心法在体外分离培养SD大鼠股骨间充质干细胞并培养。传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD34、CD45,筛选并鉴定培养细胞。采用神经营养因子碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a诱导方案,通过免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a、Wnt5a在间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用,以碱性成纤维细胞生长因子单独培养为对照。结果与结论：间充质干细胞经培养、传代后,细胞贴壁生长,形态均一,呈长梭形,流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达, CD34、CD45低表达。Wnt3a诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性,胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好;Wnt5a诱导组及对照组巢蛋白呈弱阳性表达,神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。RT-PCR结果显示,Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异性烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显;胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后有比较弱的扩增条带出现。结果说明Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

Immunomodulatory influence of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on neuroinflammation in astrocyte cultures

The therapeutic benefits associated with mesenchymal stem cells (MSCs) largely result from their immunomodulatory and neurotrophic properties. In this study, we evaluated the effects of MSCs on astrocyte cultures exposed to lipopolysaccharide. In response to this inflammatory trigger, astrocytes showed an increased expression of pro-inflammatory genes (IL-1β, TNFα, IL-6), which was attenuated by pre-exposure to MSC conditioned medium. Furthermore, mediators released by MSCs increased cell proliferation and altered the regulation of intermediate filaments (GFAP, vimentin), pro-inflammatory enzymes (iNOS, COX-2) and receptors (TLR4, CD14, mGluR3, mGluR5). These data demonstrate that MSCs influence diverse cell types participating in the response to neuroinflammation.     

构建兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型

背景：目前尚缺乏诱导骨髓间充质干细胞向髓核细胞转化的体外模型。 目的：建立兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞分化为类髓核细胞的体外模型,为髓核细胞体内移植培养种子细胞提供实验依据。 设计、时间及地点：对比观察,于2008-08/2009-03在青岛大学医学院附属医院骨科研究所和中心实验室完成。 材料：8周龄新西兰大白兔2只用于兔髓核细胞的分离培养;人椎间盘髓核组织为术中取自16岁先天性脊柱侧弯患者T12L1、L1,2椎间盘髓核组织,患者家属知情同意。人骨髓间充质干细胞株为广州赛业生物科技有限公司产品。 方法：将人骨髓间充质干细胞和兔髓核细胞新式分层共培养(应用去掉挂臂、膜孔为0.4 μm的小室,膜底与贴壁细胞相接触,膜上下两种细胞比例为50%∶50%)7 d,同时设立传统的分层培养(带有挂臂的小室)组、单独人骨髓间充质干细胞培养组和髓核细胞培养组为对照。 主要观察指标：反转录-聚合酶链反应和Western blot检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达。 结果：传统分层培养组及单独人骨髓间充质干细胞培养组不表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。新式分层培养组、单独髓核细胞培养组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达均高于传统分层培养组、单独人骨髓间充质干细胞培养组(P < 0.01)。新式分层培养组与单独髓核细胞培养组比较及传统分层培养组与单独人骨髓间充质干细胞培养组比较,差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：新式分层培养人骨髓间充质干细胞能较高的表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,接近椎间盘未退变人的髓核细胞表达水平,表明成功建立兔髓核细胞诱导人骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的体外模型,为椎间盘退变的细胞治疗奠定了基础。     

Bone marrow-derived mesenchymal stem cells versus adipose-derived mesenchymal stem cells for peripheral nerve regeneration

Studies have confirmed that bone marrow-derived mesenchymal stem cells(MSCs) can be used for treatment of several nervous system diseases. However, isolation of bone marrow-derived MSCs(BMSCs) is an invasive and painful process and the yield is very low. Therefore, there is a need to search for other alterative stem cell sources. Adipose-derived MSCs(ADSCs) have phenotypic and gene expression profiles similar to those of BMSCs. The production of ADSCs is greater than that of BMSCs, and ADSCs proliferate faster than BMSCs. To compare the effects of venous grafts containing BMSCs or ADSCs on sciatic nerve injury, in this study, rats were randomly divided into four groups: sham(only sciatic nerve exposed), Matrigel(MG; sciatic nerve injury + intravenous transplantation of MG vehicle), ADSCs(sciatic nerve injury + intravenous MG containing ADSCs), and BMSCs(sciatic nerve injury + intravenous MG containing BMSCs) groups. Sciatic functional index was calculated to evaluate the function of injured sciatic nerve. Morphologic characteristics of nerves distal to the lesion were observed by toluidine blue staining. Spinal motor neurons labeled with Fluoro-Gold were quantitatively assessed. Compared with sham-operated rats, sciatic functional index was lower, the density of small-diameter fibers was significantly increased, and the number of motor neurons significantly decreased in rats with sciatic nerve injury. Neither ADSCs nor BMSCs significantly improved the sciatic nerve function of rats with sciatic nerve injury, increased fiber density, fiber diameters, axonal diameters, myelin sheath thickness, and G ratios(axonal diameter/fiber diameter ratios) in the sciatic nerve distal to the lesion site. There was no significant difference in the number of spinal motor neurons among ADSCs, BMSCs and MG groups. These results suggest that neither BMSCs nor ADSCs provide satisfactory results for peripheral nerve repair when using MG as the conductor for engraftment.