全反式维甲酸联合细胞因子诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的作用

目的 探索全反式维甲酸(ATRA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)在诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞过程中的作用.方法 应用Ficoll分离骨髓中单核细胞,贴壁培养,观测形态并用流式细胞仪检测其细胞表面标志;用含ATRA、bFGF、EGF的条件培养基对培养的细胞向神经细胞诱导分化;采用免疫荧光染色法对分化的细胞进行鉴定.结果 分离培养的贴壁细胞具有典型的BMSCs形态和细胞表面标志,诱导后细胞表达神经元和星形胶质细胞标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP) .结论 ATRA联合细胞因子具有诱导BMSCs在体外分化为神经元样细胞的能力.     

促大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外培养和向神经元样细胞分化的方法。方法通过梯度分离获得成年大鼠MSCs,在细胞因子和氧化剂作用下对其诱导分化为神经元样细胞,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经巢蛋白（Nestin）的表达情况,流式细胞仪检测分析诱导率。结果BMSCs被转化神经元样细胞并表达Nestin。应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）所获得的神经元样细胞诱导率高（49.7%）。结论bFGF、BHA能促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞迁移能力变化的研究

目的研究体外定向诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经元样细胞的方法,探讨其分化后迁移能力变化的分子机制。方法体外培养BMSCs,以β-巯基乙醇(BME)1 mmol·L-1诱导分化,于诱导后12 h、24 h分别观察细胞形态变化,RT-PCR鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(Neurofilament)、胶质纤维酸性蛋白(β-tubulinⅢ)mRNA的变化。Western blot检测CXCR4表达变化,细胞迁移实验检测BMSCs诱导前后迁移能力的变化。结果诱导后,BMSCs胞体收缩,突起伸出;RT-PCR发现诱导出的神经元样细胞的NSE、Neurofilament、β-tubulinⅢmRNA明显增加;Western blot结果表明神经元样细胞表面CXCR4的表达明显增加,细胞迁移实验发现神经元样细胞向SDF-1α的迁移能力明显增加。用CXCR4特异的抑制剂AMD3100处理后细胞迁移被明显抑制。结论在体外骨髓基质干细胞以BME为诱导剂可定向分化为神经元样细胞,且发现其迁移能力明显增加,其机制可能与其表面CXCR4表达上调有关。     

丹参水煎液对BMSCs分化为神经元样细胞的诱导作用研究

目的：研究丹参水煎液诱导BMSCs分化为神经元样细胞的作用,探索提高MSCs向神经元样细胞分化的诱导条件。方法：全骨髓贴壁法分离大鼠BMSCs,倒置显微镜观察诱导后细胞形态学特征,流式细胞仪进行BMSCs表面抗原鉴定,对诱导后的细胞进行Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定。结果：培养的细胞经流式细胞仪检测,符合BMSCs表面标志特征。各对照组诱导后阳性细胞率均高于空白组,P〈0．01,其中丹参组Nestin阳性细胞率高于β-巯基乙醇组,P〈0．01,丹参组NSE阳性细胞率高于β-巯基乙醇组,P〈O．05;各诱导组GFAP表达为阴性。结论：丹参水煎液可以诱导BMSCs向神经元样细胞分化。     

丹参水煎液诱导BMSCs分化为神经元样细胞的最佳剂量研究

目的：研究丹参水煎液诱导BMSCs分化为神经元样细胞的最佳剂量。方法：全骨髓贴壁法分离大鼠MSCs,倒置显微镜观察诱导后细胞形态学特征,流式细胞仪进行MSCs表面抗原鉴定,不同剂量丹参水煎液诱导BMSCs向神经元样细胞分化,对诱导后的细胞进行Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定。结果：培养的细胞经流式细胞仪检测,符合BMSCs表面标志特征。各对照组诱导后阳性细胞率均高于空白组,P〈0.01,丹参诱导组（80ul/ml）Nestin阳性细胞率高于其他诱导组,P〈0.05;各诱导组GFAP表达为均阴性。结论：丹参水煎液诱导BMSCs向神经元样细胞分化的最佳剂量为80ul/ml。     

中药诱导间充质干细胞向神经细胞分化后的免疫调控作用

目的:探讨多种中药成分体外定向诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化,并研究分化细胞的免疫调控能力.方法:通过贴壁法分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),体外扩增培养.多种中药成分定向诱导分化为神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(CFAP)的表达.通过单向混合淋巴细胞反应(MLR),观察神经细胞分化的hMSCs对人外周血T淋巴细胞(human peripheral blood lymphocyte,hPBL)免疫调控作用.结果:hMSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.黄芪,天麻,人参诱导1～3小时后大部分hMSCs转变为神经元样细胞,出现胞体和突起.免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性,GFAP阴性.混合培养结果显示分化hMSCs抑制hPBLs增殖反应.结论:多种中药成分和中药制剂可在体外诱导hMSCs分化为神经元样细胞,分化hMSCs抑制人淋巴细胞增殖反应,具有免疫词控作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及初步鉴定

目的：探讨体外获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）方法以及通过形态学观察BMSCs在培养过程中是否存在自分化现象。方法应用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs ,倒置显微镜下观察细胞形态,直接荧光抗体染色法鉴定培养的细胞,免疫细胞化学方法鉴定其向神经元的诱导分化。结果原代末期及传代的BMSCs呈均一长梭形生长,第三代荧光抗体染色CD29,CD90阳性表达,神经元特异性标记物Nse（神经元特异性烯醇化酶）表达阳性,BMSCs在未加任何诱导剂时培养30d时发生了自分化现象。结论贴壁培养法是一种有效的获得高纯度BMSCs的方法,在体外培养时BMSCs可发生自分化现象。     

骨髓间质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的：诱导骨髓间质干细胞（BMSCs）向心肌样细胞分化，为 BMSCs 心肌再生移植治疗提供基础。方法取第5代的 BMSCs，5-氮杂胞苷诱导24 h，显微镜下进行形态学观察，3周后通过 RT - PCR 检测心肌蛋白 desmin 和αMHC 的表达。结果 BMSCs 经5-氮杂胞苷诱导后，细胞形态发生变化，出现肌管结构，RT - PC R 检测结蛋白（desmin ）和αMHC 的表达阳性。结论在体外成功诱导 BMSCs 分化成为心肌样细胞。     

鼠神经生长因子诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的:观察鼠神经生长因子(mNGF)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的影响。方法:4周龄健康SD大鼠60只,按随机数字表法分为治疗组(n=30)和正常对照组(n=30)。治疗组在常规培养的基础上加入浓度为0.1μg/mL mNGF作为诱导液。将培养的第3代BMSCs制成单细胞悬液,诱导后3d,观察细胞形态变化,行神经元特异性烯醇酶(NSE)免疫荧光检测,计算阳性率。结果:正常对照组细胞仅有少量NSE的表达,治疗组细胞表达NSE阳性率较对照组细胞显著增加(P<0.01)。结论:mNGF可诱导大鼠BMSCs向神经元样细胞分化。     

人骨髓基质干细胞向神经元分化的实验方法改进

目的 改进人骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化的方法，使诱导分化后的神经元样细胞存活时间延长，为其将来可能的临床应用提供理论基础。方法 采用Percoll液分离成人骨髓基质干细胞(hBMSCs)，体外扩增，流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达．应用丁羟茴醚(BHA)和二甲基亚砜(DMSO)，NT-3和PDGF定向诱导hBMSCs分化为神经元样细胞。结果 hBMSCs在体外扩增后，流式细胞检测结果显示CD29、CD44表达阳性，CD11b、CD45表达阴性；加入诱导剂一定时间后，细胞形态发生改变，同时神经丝蛋白表达阳性，胶质纤维酸性蛋白表达阳性。结论 成人骨髓基质干细胞在体外可分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞，而且较单独使用BHA DMSO诱导的方法延长了诱导后的细胞存活时间。     

创伤性脑组织匀浆条件下川芎嗪对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的最佳诱导剂量研究

目的观察创伤性脑组织匀浆条件下,川芎嗪诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞的分化,并寻找川芎嗪的最佳诱导浓度。方法①Wistar幼鼠麻醉后,取其股骨、胫骨和肱骨,从骨髓中分离BMSCs,接种于培养瓶培养并传代,于倒置显微镜下观察细胞形态。②采用Feeney自由落体撞击法制作中度脑损伤大鼠模型,取伤后24h大鼠创伤脑组织制作匀浆,用含1.00,1.15,1.30,1.45g/L 4种剂量盐酸川芎嗪的达氏修正伊氏培养基(DMEM)对体外培养的第4代BMSCs诱导12h。③倒置显微镜下观察细胞诱导后形态学变化,应用免疫细胞化学染色技术检测细胞内神经元特异性烯醇化酶(NSE)和细胞巢蛋白(Nestin)的表达,并比较4种剂量川芎嗪诱导后各组神经元样细胞抗原的表达率。结果原代细胞接种3d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,诱导后细胞出现类似神经元细胞样形态;免疫细胞化学方法检测显示多数细胞巢蛋白、NSE阳性表达,1.30g/L浓度组细胞的NSE阳性表达率最高,表达量为(66.4±4.7)%,细胞巢蛋白表达量为(62.23±4.47)%。结论川芎嗪可诱导BMSCs分化为神经元样细胞,在创伤性脑组织匀浆条件下1.30g/L为其最适诱导剂量。     

PTEN调节神经样细胞微管相关蛋白tau的聚集及意义

目的观察体外诱导成人骨髓基质干细胞(BMSC)向神经细胞分化过程中,在第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(PTEN)调节细胞骨架中轴突标志分子微管相关蛋白tau(MAPT)分布及聚集的特征,并探讨其意义。方法从成人骨髓中分离基质干细胞,在体外经细胞因子诱导分化2周后成为神经样细胞,将未分化的BMSC作为对照组;应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法研究MAPT的表达变化;经PTEN抑制剂BPV作用于该细胞后,用结合有荧光剂的鬼笔环肽直接染色细胞微丝肌动蛋白,并联合用免疫荧光细胞化学方法染色MAPT,在激光共聚焦显微镜下观察MAPT和肌动蛋白的定位及关联性。结果成人骨髓来源的基质干细胞经诱导分化后,MAPT的m RNA在分化1周和2周时相对表达水平为0.24±0.04和0.52±0.04,高于对照组BMSC的0.04±0.02(P<0.05)。MAPT蛋白表达水平分别为0.18±0.03和0.44±0.05,高于对照组0.06±0.04(P<0.05)。细胞染色后,经BPV作用后MAPT由弥散状态变为聚集状态,并分布于细胞一侧,神经样细胞开始出现极性。结论 BMSC来源的神经细胞分化成熟时,PTEN参与调节细胞骨架中轴突标志分子MAPT的转运和聚集,为神经细胞的轴突进一步生长提供物质支持。     

骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究进展

无论是在体外实验还是在体内实验,骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)都可以向中枢神经系统(CNS)神经细胞分化,但争议颇多。因为功能性神经元不仅要具有典型神经元的形态、特异性标记,还要求具有可兴奋性、能和其他神经元形成突触联系、产生突触电位等,所以对骨髓间充质干细胞是否能诱导出真正具有功能的神经元存在很大分歧。在此对BMSCs向神经细胞诱导分化研究的现状、存在的问题及发展前景给予综述。     

全骨髓法分离培养骨髓间充质干细胞及向神经样细胞分化的研究

目的 目前尚缺乏标准的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离方法 ,实验通过全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,并诱导分化为神经样细胞,以寻找一种简便、实用的分离方法 .方法 取大鼠骨髓.全骨髓培养法结合差速贴壁法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增.倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点,免疫组化染色鉴定细胞.用MTT法间接测定不同代数细胞活力.诱导分化.先用碱性成纤维细胞生长冈子(bFGF)预诱导24h,然后加入丁羟基茴香醚诱导(BHA)和二甲基亚砜(DMSO)诱导.观察诱导过程中细胞的形态变化,并用免疫组化染色法鉴定细胞.结果 全骨髓培养法成功分离培养BMSCs,免疫荧光染色示CD90、CD71、CD106表达阳性.CD45阴性.MTT法检测细胞活力示2、4、6代细胞于酶标仪490 nm波长处吸光度值均高于第8、10代细胞.细胞经诱导后,细胞呈神经样细胞形态,并且神经元特异性表面标志β微管蛋白(β-Ⅲ-Tubulin)、巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达阳性.结论 采用全骨髓培养法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞,其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化为神经样细胞.     

鹿茸精诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的:探讨鹿茸精体外定向诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法:通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外扩增培养。鹿茸精定向诱导分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。鹿茸精诱导3小时后大部分骨髓间充质干细胞转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性,GFAP阴性。结论:鹿茸精可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

HGF＋EGF联合诱导大鼠BMSCs分化肝样细胞的研究

目的在成功分离并培养大鼠骨髓间充质干细胞的基础上,用HGF、EGF以及HGF＋EGF诱导其向肝细胞方向分化,并采用不同方法鉴定细胞分化能力,试图为肝细胞移植等寻找新的种子细胞来源。方法应用HGF、EGF、HGF＋EGF诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞。实验分组：A组：未加任何诱导因素的BMSCs;B组：HGF（20ng/ml）,诱导分化BMSCs;C组：EGF（10ng/ml）,诱导分化BMSCs;D组：HGF（20ng/ml）＋EGF（10ng/ml）,诱导分化BMSCs。相差显微镜下观察细胞形态的变化;在诱导第7、21天行免疫细胞化学染色检测肝细胞标志AFP和CK18。结果在加入各种诱导成分后,梭形或成纤维细胞样细胞随着诱导时间的延长,变成纺锤形、不规则圆形或多角形细胞,数量逐渐变多,形似肝细胞。在诱导分化第7天和21天免疫细胞化学染色各诱导组均可检测出AFP和CK18表达,图像分析表明HGF＋EGF联合诱导分化的AFP、CK18阳性率最高,HGF次之,EGF则较弱。结论 HGF、EGF、HGF＋EGF均能诱导大鼠骨髓间充质千细胞分化为肝样细胞,分化后的肝样细胞能分泌肝细胞特异性产物AFP、CK18。     

骨髓间充质干细胞的分离、培养及生物学特性

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离培养方法并鉴定其生物学特性.方法 采用全骨髓贴壁细胞培养法进行BMSCs的分离培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特性,绘制细胞生长曲线,并检测细胞在不同诱导条件下向成脂肪细胞和成骨细胞分化的能力.结果 原代大鼠BMSCs培养24 h后镜下观察大部分细胞已经贴壁,传至第三代,细胞形态均一,呈梭形、螺旋样排列.经过约2 d的适应期,3～7 d进入对数生长期,7 d后进入平台期;成骨细胞诱导18 d,茜素红染色可见明显钙结节,成脂肪细胞诱导2周后油红O染色可见明显脂质沉淀.结论 全骨髓贴壁细胞培养法操作简单、快速,可以获取形态均一、纯度较高的BMSCs.     

成人骨髓间充质干细胞体外向视网膜细胞的诱导分化

目的研究取材于成人骨髓的间充质干细胞在一定诱导条件下向视网膜神经细胞的分化。方法成人骨髓经密度梯度离心得到的细胞,根据其高黏附特性体外培养获得间充质干细胞。利用流式细胞仪分析其细胞表型,在体外诱导使其向视网膜神经细胞分化并用免疫荧光法进行鉴定。结果从骨髓中分离培养的细胞具有成纤维细胞样形态,贴壁生长,表型相对均一,表面标志为CD90、CD44、CD147阳性;而CD34、CD38、CD45、CD14、HLA-DR阴性。体外诱导后可以得到表达nestin(神经干细胞标志物)、GFAP(神经胶质细胞标志物)和Rhodopsin(视网膜光感受器细胞标志物)阳性的细胞。结论从人骨髓中分离培养得到的间充质干细胞具有向视网膜神经细胞分化的潜能。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的机制研究

目的体外诱导成人骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化,并探讨分化过程中多效蛋白(PTN)mRNA的表达,以了解MSCs向神经元样细胞分化的特性和机制。方法密度梯度离心加贴壁培养法分离成人MSCs,原代和传代培养。取第6代MSCs设对照和试验组进行诱导,诱导后30 min至3 d,观察细胞形态并计数。免疫细胞化学法和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定分化后细胞神经细胞特异性表面标志神经元烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白(MAP)-2,胶原酸性蛋白(GFAP)和诱导前、诱导后12 h PTN mRNA的表达。结果接种24 h后MSCs开始贴壁,呈圆形或椭圆形。3 d后可见梭状细胞呈集落状生长,10～14 d融合。第5～6代时呈现较均一的成纤维细胞样形态。诱导后胞体向胞核收缩;出现双极及多极细胞。12 h变形细胞增多,细长突起相互连接。24 h后变形细胞增多不明显。诱导后12 h大部分细胞表达NSE(64.79±0.07)%、MAP-2(60.05±0.09)%,未检测到GFAP的表达,RT-PCR半定量检测有NSE mRNA的表达(0.66±0.15)。实验组诱导后12 h细胞有PTN mRNA的表达(0.689±0.017)。结论建立了稳定的成人MSCs培养增殖体系,MSCs可体外诱导分化为神经元样细胞,在分化过程中有外观形态变化和特异性标志物NSE和MAP-2的表达,同时有PTN mRNA的表达,提示PTN可能参与调控了MSCs向神经元样细胞的分化。     

转化生长因子β1联合生长分化因子-5体外诱导骨髓间质干细胞向类髓核细胞分化的实验研究

目的探讨转化生长因子β1联合生长分化因子-5体外诱导骨髓间质干细胞向类髓核细胞分化的可能性。方法取SD大鼠骨髓间质干细胞,流式细胞仪检测两种干细胞CD105、CD90、CD44、CD29、CD45、CD34、CD24的表达。将增殖至第三代的BMSCs分为对照、TGF-β1、GDF-5、TGF-β1+GDF-5四组,分别以含不同细胞因子诱导液培养14d后,采用RT-PCR检测各组细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9基因的表达。结果两种干细胞CD105、CD90、CD44、CD29表达阳性;CD45、CD34、CD24表达阴性。向类髓核细胞诱导培养14d后,TGF-β1、GDF-5、TGF-β1与GDF-5三组的Collagen typeⅡ、Aggrecan、SOX-9基因表达水平较对照组均有明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。联合诱导组经过诱导后的Collagen typeⅡ、Aggrecan、SOX-9基因表达水平明显高于TGF-β1组及GDF-5组,差异有统计学意义(P0.05)。结论 GDF-5与TGF-β1都具有诱导BMSCs向类髓核细胞分化的能力,且二者之间具有协同作用,联合应用可以更好的诱导BMSCs向类髓核细胞分化。