铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因的克隆表达及生物学活性

目的克隆表达铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因并检测其活性. 方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组中扩增多糖解聚酶基因,将其克隆于原核表达载体pQE-31中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达;采用Ni-NTA柱亲和层析分离纯化目的蛋白;提取铜绿假单胞菌生物膜胞外多糖,观察目的蛋白对胞外多糖的降解活性. 结果采用PCR技术成功扩增了铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因,所构建的重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化E.coli JM109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约为20.4×103,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要在上清中以可溶形式表达. 经Ni-NTA柱亲和层析后蛋白纯度大于95%. 初步活性检测结果表明重组PaP3多糖解聚酶蛋白对生物膜胞外多糖具有一定的降解作用. 结论重组噬菌体PaP3多糖解聚酶在体外可以特异性的降解铜绿假单胞菌的胞外多糖,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF原核表达载体的构建及表达

目的 克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF基因,构建原核表达载体并鉴定表达。方法 从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,PCR扩增OprF羧基端,克隆至原核表达载体pET28b中,构建重组表达载体pET28b-F。重组质粒经酶切和序列测定后,转化E.coli BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,进行SDS-PAGE检测。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后OprF蛋白免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤方法制备相应单克隆抗体并用ELISA方法进行鉴定。结果 pET28b-F原核表达载体构建成功。重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprF。获得4株高分泌型特异性单克隆细胞株,其中2株单克隆抗体可用于制备双抗体夹心法ELISA试剂盒,检测铜绿假单胞菌。结论 成功克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF羧基端基因片段并在大肠杆菌中进行表达,筛选出特异性抗OprF单克隆抗体。     

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因的扩增与克隆

目的PCR扩增及克隆铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶基因.方法从铜绿假单胞菌培养物中提取染色体DNA,PCR扩增弹性蛋白酶基因成熟蛋白编码区,A-T克隆于pMD 18-T载体中,对重组质粒进行酶切与测序鉴定.结果从高GC含量的铜绿假单胞菌染色体DNA中扩增到弹性蛋白酶基因并进行了克隆与鉴定.结论本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础.     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH基因扩增、融合、克隆及原核表达

目的 在大肠杆菌中串联表达铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH，获得重组融合蛋白OprF／H，为抗铜绿假单胞菌的疫苗研究打下基础。方法 从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA，设计PCR引物扩增出OprF和OprH基因，扩增片段经过酶切、连接和PCR扩增后，割胶回收PCR产物并将其克隆至克隆质粒，测序后构建表达质粒pGEX-F／H，并转化大肠杆菌BL21。结果 重组表达质粒经IPTG诱导后表达融合外膜蛋白OprF／H。结论 成功构建融合外膜蛋白OprF／H的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达成功。     

木糖氧化产碱菌中亚硝酸盐还原酶基因的克隆与表达

目的：对木糖氧化产碱菌中亚硝酸盐还原酶基因(nir)进行克隆并表达,并测定酶的活力,探讨亚硝酸盐还原酶(NiR)对亚硝酸盐的降解特性。方法：提取木糖氧化产碱菌DNA,根据GenBank公布的nir基因序列设计引物,利用PCR技术扩增nir基因,克隆至表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-nir,通过双酶切和测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得重组蛋白。将细胞发酵液超声破碎,提取粗酶,测定酶活力。结果：经PCR扩增及测序鉴定得到长度为1 083 bp的目的片段;经终浓度0.6 mmol?L-1IPTG、30℃诱导表达5 h,获得相对分子质量为37 000的重组蛋白;在pH6.5、反应温度35℃时,测得酶活力为51.74 U•mL^-1。结论：成功克隆nir基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,且表达产物有酶活。     

编码耐热邻苯二酚2,3-双加氧酶的pheB基因在大肠杆菌中的亚克隆与高表达

目的：构建ｐｈｅＢ基因高表达菌株，研究酶的耐热机制。方法与结果：通过ＰＣＲ扩增方法，对位于质粒ｐＦＤＡ１３上的ｐｈｅＢ基因进行扩增，克隆于ｐＵＣ１１８Ｎ和ｐＵＣ１１９Ｎ上，经双向测序，证明ＰＣＲ过程中并未发生突变，然后亚克隆于高表达载体ｐＪＬＡ５０３，转化Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１，经４２℃诱导，获得了高表达的基因产物，表达量占细菌总蛋白的３４．６％。并与ｘｙｌＥ基因编码的邻苯二酚２，３双加氧酶作了耐热性比较。结论：ｐｈｅＢ基因在大肠杆菌中获得了高表达，高表达后重组酶的耐热性未发生改变。     

铜绿假单胞菌OprH基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprH,研究其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法以铜绿假单胞菌PAO1标准株双链DNA为模板,通过PCR扩增OprH基因。经酶切后与载体pGEX-1λT进行连接,构建重组质粒pGEX-OprH,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 PCR扩增出660 bp的OprH编码基因;重组质粒经双酶切和PCR证实OprH基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE电泳发现表达产物相对分子质量约为47 000 Mr,与前期预测结果一致,大肠埃希菌BL21(DE3)表达蛋白为菌体量的22%;免疫印渍表明Pa抗原免疫的小鼠血清能特异识别47 000 Mr重组蛋白。结论铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprH在E.coli BL21(DE3)中高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因的克隆、原核表达及初步鉴定

目的构建Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因表达载体,并在大肠杆菌中表达相应蛋白。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌的基因,PCR方法扩增lukS-PV,A-T克隆至pGEM-T载体上,经PCR、双酶切和测序鉴定后,亚克隆到pET28a( )表达载体上,鉴定并转化至Rosetta(DE3)plys表达宿主菌中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果构建了lukS-PV-pGEM-T和lukS-PV-pET28a( )重组质粒,经PCR扩增和限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切均得到939bp的目的片段,基因测序与GENEBANK中的PVL的序列一致,宿主菌表达带HIS标签的重组LukS-PV蛋白。结论成功克隆lukS-PV基因和构建重组表达质粒,并在宿主菌中成功表达重组LukS-PV蛋白,为PVL免疫学检测方法的建立奠定基础。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP1内溶素基因克隆、表达及活性分析

目的 构建铜绿假单胞菌噬菌体内溶素重组原核表达载体,检测重组蛋白的酶学活性及抑菌活性.方法 利用重组技术将铜绿假单胞菌裂解性噬菌体PaP1内溶素基因构建到表达载体pQE31中,并在大肠杆菌M15(pREP4)中诱导表达,通过非变性方法纯化重组融合蛋白,利用酶潜电泳、抑菌实验等技术检测酶学活性及抑菌活性.结果 酶谱电泳方法结果显示重组融合蛋白对铜绿假单胞菌细胞壁肽聚糖有降解作用,抑菌活性检测结果显示重组融合蛋白对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌效果.结论 该研究从实验方面证实了噬菌体PaP1内溶素基因的生物学功能.     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain—like基因的克隆及表达

目的克隆弓形虫RH株Calpain-like基因片段,构建原核表达载体,诱导表达Calpain-like基因重组蛋白。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA,在设计合成的引物中引入SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫RH株Calpain-like基因片段,插入pGEM-T载体,提取重组质粒,双酶切获得目的基因,亚克隆到原核表达质粒pET32a,重组子经双酶切、PCR和DNA序列分析鉴定,转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株速殖子cDNA中扩增出316bp的Calpain-like基因片段;含pET32a/Calpain-like的重组质粒在宿主菌经诱导后,获得与预期分子量相符的表达产物。结论成功地克隆和表达弓形虫RH株Calpain-like基因,弓形虫Calpain-like基因的克隆表达为进一步筛选弓形虫疫苗候选分子和治疗药物的靶位提供了研究基础。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。