人脂肪间充质干细胞与软骨细胞接触式共培养的实验研究

目的探讨接触式细胞共培养条件下,人软骨细胞对脂肪间充质干细胞的诱导分化效应。方法用4,6-联脒-2-苯基吲哚(PKH26)荧光标记脂肪间充质干细胞,与软骨细胞进行接触式细胞共培养,细胞比例为1:1,单独培养的脂肪间充质干细胞为对照组。共培养2周后,应用流式细胞仪分选荧光标记阳性的脂肪间充质干细胞,提取细胞总RNA,采用Real-Time PCR检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因的相对表达改变。结果成功分离提取脂肪间充质干细胞;Real-timePCR检测结果显示,共培养组脂肪间充质干细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因相对表达较对照组显著增加(P0.05),蛋白多糖上调307倍,Ⅱ型胶原上调584倍。结论与软骨细胞接触式共培养后,人脂肪间充质干细胞能够被诱导分化为软骨细胞。     

脂肪干细胞复合PLGA体外诱导成软骨的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞接种于PLGA支架复合培养体外诱导成软骨的能力.方法 收集脂肪干细胞,调整细胞悬液密度为4.0×1010>/L,接种在PLGA支架材料上进行复合,在特定培养基条件下,对脂肪干细胞/PLGA进行成软骨诱导,于诱导3周后应用扫描电镜观察,藩红O/固绿染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测成软骨表型;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因表达情况.结果 脂肪干细胞接种子PLGA材料后,复合体表面逐渐光滑润泽,质地逐步增韧,体外诱导后细胞/PLGA支架复合体基本保持原状;3周时取材行扫描电镜观察,可见细胞在材料表面附着生长,基质分泌明显,连串成片;石蜡切片藩红O/固绿染色可见诱导组细胞胞外基质分泌旺盛,和支架材料连接成片,呈强阳性红染;胞外基质Ⅱ型胶原免疫组织化学着色阳性;RT-PCR检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因均阳性表达.结论 脂肪干细胞能够和PLGA复合培养,在特定诱导培养基条件下可以向软骨方向分化,形成类软骨样组织.     

人脂肪干细胞体外培养及向软骨细胞诱导分化的实验研究

目的:观察人脂肪基质干细胞(ADSCs)体外分离培养及成脂、成软骨诱导分化的生物学性状,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性.方法:(1)人脂肪组织来源于健康成年女性腹部吸脂术,酶消化法分离出ADSCs,体外培养扩增.(2)取第3代ADSCs,测细胞生长曲线,流式细胞仪测原代细胞表面标记;成脂和成软骨诱导分化.(3)倒置显微镜观察油红O、阿尔辛蓝(AB-PSA)染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色检测分化情况;RT-PCR检测相关标志基因表达.结果:(1)体外培养的ADSCs细胞形态均一,传代稳定.(2)经成脂诱导,细胞内出现空泡,油红O染色呈红色,RT-PCR检测到有Leptin、PPAR-γ表达;经成软骨诱导,AB-PSA染色呈紫红色,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色胞浆呈棕黄色,RT-PCR检测COLLⅡ、SOX9和aggrecan表达.结论:脂肪干细胞能向软骨细胞方向诱导分化,可作为软骨组织工程种子细胞.     

体外共培养诱导骨髓间充质干细胞向雪旺细胞分化

目的:观察体外雪旺细胞环境对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的诱导分化作用。方法:分离和体外培养新生大鼠MSCs和雪旺细胞;实验组MSCs经DAPI标记后与雪旺细胞按1∶2比例共培养,观察细胞的形态变化,在第1,3,6天时使用免疫细胞化学染色检测MSCs中Nestin,GFAP及S-100表达。对照组MSCs单独培养,其余处理与实验组相同。结果:共培养1 d后部分MSCs出现雪旺细胞样形态,Nestin表达率为(83.4±3.5)%,随时间增加而降低。GFAP及S-100表达率随时间而增加。对照组细胞形态无变化,不同时间点均有少量MSCs表达Nestin,而GFAP和S-100未见表达。结论:MSCs可通过体外共培养向雪旺细胞分化。     

诱导脂肪干细胞成软骨分化的研究进展

由创伤或其他病因引起的关节软骨病变通常难以自愈,且目前临床上的治疗方法疗效欠佳。脂肪干细胞 (adipose derived stem cells,ADSCs)是一种来自脂肪组织、具有多向分化潜能的干细胞,基于ADSCs成软骨分化能力的 组织工程学疗法为关节软骨缺损的修复再生提供了新的思路。体外诱导ADSCs分化成软骨的方法主要是采用生长因 子和支架材料模拟体内微环境,进而促进ADSCs向软骨细胞分化,其相关应用已取得初步成功。     

脂肪干细胞向软骨细胞诱导分化能力的研究

目的 探讨脂肪干细胞体外定向分化为软骨细胞的能力.方法 在特定培养基条件下,采用"微团"培养方法对脂肪干细胞进行成软骨诱导,于诱导7,14d后应用Ⅱ型胶原免疫组化和aggrecan免疫荧光检测成软骨表型;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测脂肪干细胞诱导0周、2周和4周后前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因表达情况.结果 脂肪干细胞经诱导后,由长梭形转变为三角形、多角形或短梭形.逐渐聚集成结节,胞外基质Ⅱ型胶原免疫组化着色和aggrecan免疫荧光阳性,前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因均稳定表达.结论 脂肪干细胞在特定培养基条件下可以定向软骨细胞方向分化,并能够稳定表达软骨细胞特异袁型.     

中药诱导干细胞软骨分化的实验研究进展

关节软骨退变和其继发的骨质增生是骨关节炎（Osteoarthritis,OA）的核心病理改变。在机械性和生物性因素作用下,关节软骨细胞、细胞外基质以及软骨下骨正常合成和降解偶联失衡,关节软骨纤维化、溃疡、缺失,软骨下骨的硬化,骨赘形成和软骨下囊变,形成关节炎。膝关节是关节软骨退变最常见部位,致残率高。中医药在治疗骨关节病方面,有丰富的经验,临床疗效也较好。很多学者对中药诱导干细胞软骨分化,治疗骨关节炎的作用机理做了深入研究。本文就相关实验研究情况做一综述。     

体外诱导鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的:探讨小鼠胚胎干细胞(ESCs)在转化生长因子β1(TGFβ1)联合内脏内胚层END2细胞共培养诱导条件下分化为心肌细胞的特征。方法:小鼠胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上增殖培养,先将ESCs悬浮培养形成23d的拟胚体(EBs),再将23dEBs种植到含有TGFβ1的24孔板中进行诱导,以及种植到铺有END2细胞饲养层的24孔板中进行诱导,培养液中同时加入TGFβ1。免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌动蛋白(αActin)及肌钙蛋白T(TnT)的表达,透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。流式细胞仪检测EBs集落心肌细胞的平均分化率。结果:TGFβ1诱导组和TGFβ1联合内脏内胚层END2细胞共培养诱导组分别有43%,91%(P<0.05)的拟胚体出现自发节律性收缩,均表达心肌细胞特异性蛋白αActin和TnT,以及观察到心肌样超微结构,但在共培养的条件下,自发节律性收缩区域较大,且细胞形态较单一。两诱导组EBs集落心肌细胞平均分化率分别是35%,74%(P<0.05)。结论:TGFβ1联合内脏内胚层END2细胞共培养对小鼠ESCs向心肌细胞定向分化有协同作用,具有较高的诱导分化率。     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外构建软骨的初步研究

目的探讨不同浓度软骨细胞提供的软骨微环境诱导骨髓基质干细胞(BMSC)体外构建软骨的可行性.方法将体外分别培养扩增的猪BMSC与耳软骨细胞按不同比例混合(9:1,8:2),均以5.0×107/mL的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架作为共培养组,以相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC分别接种作为阳性及阴性对照,以20%上述浓度的单纯软骨细胞接种作为低软骨细胞浓度对照.各标本于体外培养4周时取材,通过大体观察、组织学以及免疫组化等方法对新生软骨进行初步评价.结果各组细胞均与材料粘附良好.8:2共培养组及阳性对照组在体外培养4周时,外观已类似软骨组织并基本保持了材料的大小和形状,组织学显示有较连续的成熟软骨形成,免疫组化也均显示有大量Ⅱ型胶原分泌.9:1共培养组在培养过程中稍有缩小和变形,组织学上仅在培养物的边缘可见到连续的软骨样组织.阴性对照组明显皱缩变形,组织学未见成熟软骨陷窝.低软骨细胞浓度组复合物明显变薄,只在局部形成了不连续的软骨组织,新生软骨量明显少于共培养各组及阳性对照组.结论软骨细胞能够提供软骨微环境诱导BMSC成软骨分化并形成软骨,20%浓度的软骨细胞已能够达到良好的诱导效果.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化的实验研究

目的 观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)与血管平滑肌细胞直接接触培养后向血管成分细胞的分化及超微结构改变.方法 将MSCs(DAPI标记)与血管平滑肌细胞按一定的比例混合培养后,用平滑肌细胞抗体SM-α-actin、calponin免疫荧光染色,并用透射电镜观察MSCs的超微结构改变,检测MSCs的分化情况.结果 MSCs与血管平滑肌细胞混合培养5d后免疫荧光染色,可见胞核蓝染的MSCs与抗SM-α-actin、抗calponin (绿色)的双标细胞出现;而单独培养的MSCs抗SM-α-actin阳性,抗calponin为阴性.并且混合培养后的MSCs电镜下可见肌丝状结构.结论 血管平滑肌细胞直接接触可以诱导MSCs向血管平滑肌细胞分化.     

CDMP1诱导大鼠脂肪干细胞体外成软骨细胞的实验研究

目的:应用软骨形态发生蛋白(CDMP1)体外诱导SD 大鼠脂肪干细胞向软骨方向分化,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性以及CDMP1诱导的最佳剂量.方法:无菌取8只SD大鼠腹股沟脂肪组织,脂肪干细胞体外培养至第二代,以1×104/孔密度接种于24孔培养板里,12 h 后加入诱导液(10 mL/L新生牛血清-DMEM培养液, CDMP1),分ABCD四组(A组:50 μg/L CDMP1 基础培养液; B组:100 μg/L CDMP1 基础培养液;C组:150 μg/L CDMP1 基础培养液;D组:基础培养液 ),以D组为阴性对照组.诱导14 d,倒置显微镜观察细胞形态的变化,MTT法测定CDMP1对其增殖分化能力的影响,行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果:诱导后可见脂肪干细胞形态由长梭型明显向软骨细胞的多角形方向转变.MTT法测定CDMP1对脂肪干细胞的增殖能力提高,其中以C组为最,但ABC三组之间两两比较无统计学意义,故提示CDMP1诱导的最佳浓度约为50 μg/L .甲苯胺蓝染色法示糖胺聚糖(GAG)均匀分布于基质中,免疫组化示诱导组Ⅱ型胶原表达阳性,对照组未见阳性表达.结论:CDMP1诱导大鼠脂肪干细胞可以分泌软骨特异性基质糖胺聚糖(GAG)和Ⅱ型胶原,并使其向软骨方向增殖分化,以50 μg/L 为CDMP1诱导的最佳浓度,并有望成为软骨组织工程种子细胞的新来源的方法之一.     

脂肪干细胞体外培养特性及成脂成软骨分化研究

目的:分析脂肪干细胞体外培养的特性和体外向成脂细胞和成软骨细胞分化的情况.方法:采集成年兔腹部脂肪组织,体外分离培养脂肪干细胞,并进行成脂细胞和成软骨细胞的体外诱导分化,采用油红O染色证明成脂细胞分化,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和Alcian Blue染色证明成软骨细胞分化.结果:脂肪干细胞形态为菱形,细胞可稳定传代,各代次间无形态上的差异.经油红O染色发现,脂肪干细胞可形成阳性脂滴,表明具有成脂分化能力.经Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和Alcian Blue染色后发现,脂肪干细胞可形成Ⅱ型胶原和硫酸蛋白聚糖,表明具有成软骨分化能力.结论:脂肪干细胞具有成脂成软骨分化能力,可成为脂肪和软骨组织工程研究的种子细胞.     

脂肪间充质干细胞成软骨细胞诱导后的再培养

目的 探索藻酸盐凝胶中高密度培养脂肪间充质干细胞(ADSCs)成软骨细胞诱导后,利用凝胶释放的细胞再培养形成软骨组织的新方法。方法 取大鼠腹股沟脂肪组织,Ⅰ型胶原酶消化得到ADSCs原代培养,传代后采用流式细胞术检测间充质细胞表面CD90、CD44表达鉴定细胞。将第6代细胞高密度培养于藻酸钙凝胶中,用软骨诱导培养基诱导培养2周,将细胞放自凝胶中释放并单层培养成软骨诱导2周,观察细胞变化。培养出的组织块经Ⅱ型胶原酶消化后,行免疫细胞化学染色,检测软骨特异性Ⅱ型胶原蛋白的表达。结果 ADSCs原代呈梭形生长,传代后呈规律排列旋涡状生长,间充质干细胞表面CD90、CD44呈阳性。藻酸钙-ADSCs成软骨诱导2周后,释放出的细胞贴壁后逐渐聚集,形成一定体积的质硬组织块,免疫组化检测显示,新生组织块细胞胞质中软骨特异性Ⅱ型胶原蛋白呈阳性表达,表明大鼠ADSCs向软骨细胞分化。结论 藻酸盐凝胶中高密度培养大鼠ADSCs成软骨细胞诱导后,利用诱导后的细胞再培养可形成新的软骨组织。     

脂肪源性神经干细胞诱导分化为γ-氨基丁酸能神经元的体外研究

目的探讨诱导脂肪源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化为GABA能神经元的体外培养方法,为细胞移植修复神经系统损伤提供种子细胞。方法贴壁培养C57BL/6小鼠(附睾脂肪垫)脂肪来源的干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),流式细胞仪进行表型鉴定(CD45、CD90、CD105)及标志物纤连蛋白(fibronectin)鉴定后,在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、2%B27的Neuro-basal培养基中诱导成NSCs。用免疫荧光细胞染色法进行NSC特异性标记物Nestin、增殖能力BrdU检测,再次添加脑源性神经营养因子、骨形成蛋白2后,维甲酸(RA)诱导分化为γ-氨基丁酸能神经元,并进行其标志物GABA的检测。结果分离纯化的ADSCs CD90、CD105表达强阳性,CD45表达阴性;诱导后的干细胞球经Nestin及BrdU鉴定为NSCs,且具有较强的增殖能力;神经干细胞诱导分化后的神经元GABA抗体染色呈阳性。结论在特定神经营养因子作用下,ADSCs在体外诱导生成的NSCs可被诱导分化为GABA能神经元。     

Differentiation of adipose-derived neural stem cells into GABAergic neurons in vitro

目的 探讨诱导脂肪源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化为GABA能神经元的体外培养方法,为细胞移植修复神经系统损伤提供种子细胞.方法 贴壁培养C57BL/6小鼠(附睾脂肪垫)脂肪来源的干细胞(adiposederived stem cells,ADSCs),流式细胞仪进行表型鉴定(CD45、CD9O、CD105)及标志物纤连蛋白(fibronectin)鉴定后,在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、2％ B27的Neurobasal培养基中诱导成NSCs.用免疫荧光细胞染色法进行NSC特异性标记物Nestin、增殖能力BrdU检测,再次添加脑源性神经营养因子、骨形成蛋白2后,维甲酸(RA)诱导分化为γ-氨基丁酸能神经元,并进行其标志物GABA的检测.结果 分离纯化的ADSCs CD90、CD105表达强阳性,CD45表达阴性;诱导后的干细胞球经Nestin及BrdU鉴定为NSCs,且具有较强的增殖能力;神经干细胞诱导分化后的神经元GABA抗体染色呈阳性.结论 在特定神经营养因子作用下,ADSCs在体外诱导生成的NSCs可被诱导分化为GABA能神经元.     

成人脂肪间充质干细胞体外定向诱导分化为心肌样细胞的实验观察

目的:探索成人脂肪组织来源的间充质干细胞(ADMSCs)体外分离、培养方法,并化学诱导使其向心肌细胞分化,为心肌再生医学提供理想的种子细胞来源. 方法:体外分离成人ADMSCs并进行传代培养,5-氮胞苷(5-aza)诱导其向心肌细胞分化. 分别于诱导后14,21,28 d时用免疫细胞化学染色、RT-PCR法进行心肌细胞鉴定. 结果:ADMSCs经5-aza诱导后14 d时细胞形态趋向于心肌细胞,诱导28 d免疫细胞化学显示心肌特异性肌钙蛋白I(cTN-I)、结蛋白(Desmin)表达阳性,RT-PCR检测心肌β-肌球蛋白重链(Cardiac β-MHC)基因表达阳性. 结论:成人脂肪组织存在丰富的间充质干细胞且易于分离扩增,体外5-aza诱导可使其向心肌细胞分化,可做为心肌再生医学的理想种子细胞.     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的：研究兔骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外分离、培养及向心肌细胞诱导分化的条件。方法：抽取兔髂骨骨髓，用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化MSCs，第3代细胞（P3）用流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD11b，CD90、CD29。以10μmol／L5-氮胞苷（5-aza）进行诱导分化，4周后，用倒置显微镜、透射电镜观察MSCs形态学变化及超微结构特征，RT—PCR检测心肌特异性β-肌球蛋白重链（β—MHC）、肌钙蛋白I（cTnI）的表达。结果：兔MSCs呈贴壁集落生长，流式细胞术检测显示P3细胞均一性在97％以上，纯度较高。诱导后细胞体积较诱导前增大，更加细长。14天后细胞之间出现连接，排列方向渐趋一致。4周后，透射电镜下有肌丝、心房特殊颗粒及线粒体等心肌细胞超微结构形成。RT—PCR显示B—MHC、cTnI呈阳性反应。结论：MSCs在体外经5-aza诱导可以向心肌细胞进行分化。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的初步实验观察

目的体外培养并诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞。方法采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫细胞化学的方法鉴定肌细胞及心肌细胞特异蛋白的表达。结果诱导后细胞体积较诱导前增大,而且更加细长,呈长梭形。14d细胞之间出现连接,排列方向渐趋一致。免疫细胞化学染色显示Desmin,α-SarcomericActin和心肌特异性cTnI呈阳性反应。结论MSCs可能具有表达心肌细胞的特异性启动或分化调控基因,5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化。     

5-氮胞苷诱导脂肪间充质干细胞向心肌细胞分化的毒理遗传学研究

目的：观察5-氮胞苷（5-aza）对成人脂肪间充质干细胞（ADMSCs）向心肌细胞方向诱导分化的毒理遗传学影响.方法：自成人脂肪组织中分离培养ADMSCs,用5-aza对ADMSCs进行诱导,设立不同诱导浓度的I,II,III,（5,10,20μmol/L）组及对照组IV,光镜下观察细胞的生长情况及形态学变化,免疫细胞化学方法检测心肌特异性肌钙蛋白I（cT-nI）,RT-PCR方法检测cTnI基因的表达,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,并对各诱导组常规核型分析.结果：诱导后4wk I,II,III组ADMSCs呈现类似心肌细胞的形态学特征.I,II,III组免疫组化结果见cTnI阳性表达,RT-PCR条带见cTnI基因表达.各组染色体结构及数目均未见异常.结论：5-aza作为诱导剂对ADMSCs遗传性无不良影响.