关节软骨细胞体外培养及生物学特性的实验研究

目的:探讨关节软骨细胞培养方法及其生物学特征。方法:从4周龄新西兰乳兔关节分离静置培养软骨细胞,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态变化,并计数绘制生长曲线。用番红-O,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法观察蛋白多糖,碱性糖胺聚糖(GAGs),Ⅱ型胶原的分泌情况,用PCR鉴定Ⅱ型胶原,Aggrecan基因的表达。结果:成功建立兔关节软骨细胞体外培养实验方法。形态学及免疫化学染色显示体外培养3代以内的软骨细胞可保持表型稳定而3代后软骨细胞呈现增殖缓慢及衰老现象。结论:本实验建立的体外培养关节软骨细胞方法简单可行,3代内的兔软骨细胞表型稳定且生物学活性较高,具备可用于实验研究的能力。     

兔关节软骨细胞的分离培养及生物学特征

目的 探讨兔关节软骨细胞分离培养的方法和生物学特性。方法 从4周龄新西兰白兔关节分离培养软骨细胞，倒置显微镜下观察原代及传代培养的细胞形态学变化，并计数绘制生长曲线。测定细胞冻存复苏后的存活率。用甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法了解葡萄糖胺多糖（GAGs），Ⅱ型胶原的合成情况并鉴定细胞。结果 成功建立体外培养兔关节软骨细胞的实验方法。原代培养的软骨细胞呈多角形，传代3次后出现反分化。形态学、免疫化学染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定，冷冻复苏存活率为92％。结论 本文建立的体外培养关节软骨细胞的方法简单可行。体外培养的兔软骨细胞表型能保持3代稳定，具有良好的生物学活性，可用于实验研究，可经深低温冷冻保存。     

软骨细胞体外分离培养与鉴定的实验研究

目的探讨兔关节软骨细胞分离、培养和鉴定的方法，建立软骨细胞的体外培养体系。方法4周龄新西兰白兔采用机械-酶消化法，分离膝关节软骨细胞接种培养以及传代培养．倒置相差显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化对细胞进行鉴定。结果成功建立了体外培养软骨细胞的实验方法。原代培养的软骨细胞呈多角形，传代3次后出现反分化。形态学、免疫化学染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定。甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色阳性。细胞传至5代后．出现“成纤维细胞样”。结论本研究建立了简单易行的软骨细胞分离、培养方法；初代、第2代、第3代细胞生长良好，适合于实验研究；软骨细胞5代培养后．细胞袁型发生改变。     

乳兔关节软骨细胞的分离、培养及生物学特性的观察

目的：建立乳兔软骨细胞分离及培养的方法,观察软骨细胞在体外培养中的生物学特性.方法：采用两步消化法,将乳兔关节软骨进行分离、培养.采用苏木精伊红染色和甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定,用MTT法绘制生长曲线、并在倒置显微镜观察各代软骨细胞形态、通过免疫组化染色、逆转录聚合酶反应（RT PCR）法观察其生物学特性.结果：通过两步酶消化法,成功分离出乳兔关节软骨细胞,培养24 h后细胞贴壁呈短梭形.培养2周左右软骨细胞聚集似“铺路石”样.MTT法显示细胞生长曲线近似“S”形.甲苯胺蓝呈阳性结果,并随代数增加阳性结果呈减弱趋势.通过免疫组化染色和RT PCR显示随代数增加软骨细胞Ⅰ型胶原表达增强,Ⅱ型胶原表达减弱.结论：本研究采用两步酶消化法,成功从乳兔软骨内获取大量活性好、纯度高的软骨细胞,3代以内软骨细胞生长良好,并保持其生物学特性,适于软骨组织工程的应用.3代以后开始出现去分化现象.     

胰岛素样生长因子Ⅰ与透明质酸对人胚关节软骨细胞表型的影响

【目的】研究胰岛素样生长因子Ⅰ (IGF Ⅰ )和透明质酸 (HA)联合培养对人关节软骨细胞生物学行为的影响 ,判断其稳定软骨细胞表型的效果。【方法】分离培养人关节软骨细胞 ,从第 4代开始 ,用hIGF Ⅰ和HA联合培养 ,通过电镜观察、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原和aggrecan免疫组化及RT PCR判断联合培养第 8代软骨细胞表型的变化。自然传代的第 6代细胞为对照组。【结果】IGF Ⅰ和HA联合培养的第 8代细胞胞浆内含有丰富的粗面内质网和分泌小泡 ;RT PCR显示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性而Ⅰ型胶原mRNA表达阴性 ;甲苯胺蓝染色显示细胞浆内有大量的紫色异染颗粒 ;Ⅱ型胶原和aggrecan免疫组化见 80 %～ 92 %的细胞染色呈阳性或强阳性 ,平均灰度分别为 85 92和 116 2 3,均显著低于对照组 ,说明处理组染色较对照组增强。【结论】IGF Ⅰ和HA联合培养的第 8代细胞仍能保持透明软骨细胞的表型 ,为体外获得高数量级别的有正常功能的人关节软骨细胞提供一种新方法。     

SV40LTAg基因永生化软骨细胞体外培养的生物学特性

目的探讨永生化关节软骨细胞体外培养的生物学特性。方法用SV40LTAg(类人猿40病毒大T抗原)基因转染原代培养的关节软骨细胞,构建永生化关节软骨细胞系(immortalized cartilage chondrocytes)并体外培养,以正常关节软骨细胞(normal cartilage chondrocytes)作对照。倒置显微镜下观察永生化软骨细胞的形态学变化和增殖情况;应用甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察永生化软骨细胞在培养过程中酸性粘多糖(GAG)和胶原分泌情况。结果永生化关节软骨细胞体外培养呈贴壁单层生长,长期传代(50代)仍有很强的增殖能力,形态呈现多角形和三角形,GAG和胶原染色均呈阳性。结论构建的永生化关节软骨细胞在体外培养能长期维持软骨细胞的特征性表型。     

胶原酶消化分离兔关节软骨细胞及体外聚集培养的观察

目的通过观察采用单一胶原酶消化分离、体外聚集培养获得的兔关节软骨细胞的生物学性状,证实这种获得方法的可靠性。方法取活体成年兔关节软骨,体外采用Ⅱ型胶原酶一次性消化,高密度聚集培养后用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况,常规染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色法观察软骨细胞表型变化。结果 （1）收集细胞总量为（1.2～2.6）×105个·g-1。台盼兰检测细胞活性率平均为96.7%。（2）前三代细胞生长迅速,形态呈短梭形、三角形、多边形等,融合时呈卵圆形。（3）经过聚集扩增培养后Mallory及甲苯胺兰异染反应均为阳性,Ⅱ型胶原免疫组化结果为阳性。结论单一胶原酶消化分离、体外聚集培养这一方法可以获取大量优良的软骨细胞。     

SV40LTAg基因永生化软骨细胞体外培养的生物学特性

目的 探讨永生化关节软骨细胞体外培养的生物学特性。方法 用SV40LTAg(类人猿40病毒大T抗原)基因转染原代培养的关节软骨细胞。构建永生化关节软骨细胞系(immortalized cartilage chondrocytes)并体外培养，以正常关节软骨细胞(normal cartilage chondrocytes)作对照。倒置显微镜下观察永生化软骨细胞的形态学变化和增殖情况；应用甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，观察永生化软骨细胞在培养过程中酸性粘多糖(GAG)和胶原分泌情况。结果 永生化关节软骨细胞体外培养呈贴壁单层生长，长期传代(50代)仍有很强的增殖能力，形态呈现多角形和三角形，GAG和胶原染色均呈阳性。结论 构建的永生化关节软骨细胞在体外培养能长期维持软骨细胞的特征性表型。     

胶原-纤维蛋白混合凝胶对关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原的影响

目的：以胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行关节软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,研究载体对软骨细胞在其中的表达及合成Ⅱ型胶原的影响。方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,制成软骨培养物并在体外培养。培养第3周时,取材进行Masson染色、Ⅱ型胶原寡核苷酸探针原位杂交和Ⅱ型胶原的免疫组化观察。 结果：体外培养3周,培养物内细胞大部分存活, Masson染色形成软骨陷窝,同源性细胞簇出现,细胞周围有蓝色物质环绕存在,原位杂交证实其软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA,免疫组化证实软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。 结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可促进关节软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的细胞外基质成分。     

大鼠膝关节软骨细胞体外培养去分化时间的实验研究

目的:观察大鼠膝关节软骨细胞体外培养后自然退变时间,为骨关节炎研究提供合适靶细胞。方法:大鼠膝关节软骨细胞体外培养,传代,行甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色鉴定软骨细胞,通过Western Blot检测其特征性Ⅱ型胶原的表达情况对传代软骨细胞表型进行鉴定。结果:大鼠膝关节第5代软骨细胞和前4代比较,Ⅱ型胶原表达明显减少(P<0.05),结论:大鼠膝关节软骨细胞体外培养前4代能维持正常的软骨细胞表型,第5代开始发生退变,前4代可以做为软骨细胞研究的靶细胞。     

两种培养基对软骨细胞体外培养影响的对比研究

目的：研究不同培养基中兔关节软骨细胞生物学行为的差异，为软骨组织工程中软骨细胞的培养寻找最合适的培养基。方法：取3个月龄新西兰兔关节软骨消化获取软骨细胞，以相同密度分别用两种培养基(F-12、1640)进行培养，观察其形态、生物学行为、增生速度、特征性产物分泌量及黏附能力。分析两种培养基培养结果，对比其对体外培养关节软骨细胞的影响。结果：软骨细胞在1640培养基中贴壁、生长较快，细胞形态均一，特征性产物分泌旺盛。结论：在两种培养基中1640培养基更适合进行关节软骨细胞体外培养。     

Sox9基因在终板软骨细胞退变模型中的表达变化及意义

目的 建立大鼠腰椎终板软骨细胞体外自然退变模型,并探讨Sox9基因在终板软骨细胞自然退变中的变化及作用.方法 取大鼠腰椎终板软骨细胞,酶消化及自然传代法分离培养大鼠终板软骨细胞,建立体外终板软骨细胞培养模型.采取绘制细胞生长曲线、HE、甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色等方法,对该模型进行鉴定.RT-PCR检测各代细胞中Sox9、Ⅱ型胶原mRNA的表达变化.结果 大鼠终板软骨细胞表达特征性Ⅱ型胶原,其生长情况及细胞表型类似于关节软骨,细胞传至4、5代后表现出细胞形态呈梭形、细胞增殖速度减慢等退变的特征.与原代相比,Sex9基因mRNA在4、5代终板软骨细胞的表达明显下降(P<0.05),受其调控的Ⅱ型胶原mRNA的表达也相应降低,两者表达变化呈正相关(r=0.912,P<0.05).结论 终板软骨细胞自然退变模型成功建立,为椎间盘退变机制研究提供了较好的细胞学基础.Sox9基因与终板软骨细胞自然退变存在明显关联,Sox9基因的表达下降可抑制软骨终板细胞的增殖及基质合成,从而促进或诱发椎间盘的退变.     

地塞米松磷酸钠对兔关节软骨细胞体外培养的影响

目的探讨地塞米松磷酸钠对体外培养兔关节软骨细胞的影响。方法兔关节软骨细胞常规培养后随机分为对照组和实验组,对照组用不合地塞米松磷酸钠的DMEM培养液培养,实验组则分别加入含不同浓度地塞米松磷酸钠的DMEM培养液,应用流式细胞术及免疫细胞化学法检测软骨细胞增殖情况及其合成Ⅱ型胶原能力,并应用透射电子显微镜观察软骨细胞超微结构的变化。结果实验各组软骨细胞进入S期、G2＋M期的细胞比率较对照组软骨细胞减少、进入G0／G1期的细胞比率增加,免疫细胞化学阳性信号的平均灰度值与对照组平均灰度值的差异均有显著性,电镜下见软骨细胞线粒体、粗面内质网数量减少。结论地塞米松磷酸钠可抑制软骨细胞的增殖,可能与抑制关节软骨细胞的Ⅱ型胶原和蛋白合的合成能力有关。     

人骨关节炎软骨细胞的体外培养

目的:对人骨关节炎软骨细胞的分离、消化和培养进行初步研究,并就其生物学活性同人正常软骨细胞进行比较和评价。方法:以含血清培养液配制的0.05%和0.2%Ⅱ型胶原酶顺序消化关节软骨分离细胞,检测细胞存活率;体外传代培养观察细胞形态、生长、增殖和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体等的变化,以及用流式细胞仪检测有或无IL-1β诱导的细胞凋亡和周期变化。结果:①消化后骨关节炎组原代细胞活力平均为82%,少于正常组的95%(P<0.01)。②MTT检测骨关节炎组细胞增殖低于正常组(P<0.01),Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝O异染反应均较弱,传至第4代软骨细胞生物学特性基本消失。③骨关节炎组细胞凋亡率为6.9%,而正常组为0.5%,IL-1β诱导后凋亡率增加了27.4%,正常组只有12.7%。结论:酶二步消化法具有较高细胞存活率、低污染率和操作简便等特点,分离培养的骨关节炎软骨细胞符合人患骨关节炎时软骨细胞退变的表现,能很好的为骨关节炎细胞水平的研究提供最佳实验对象。     

兔髓核细胞原代培养及其生物学特性的实验研究

目的建立兔髓核组织体外直接分离培养的方法及其相关生物学特性的测定。方法取2周龄健康日本大耳白兔,无菌条件下分离出椎间盘凝胶状髓核组织,直接加入含有20%FBS的DMEM培养液中培养,倒置显微镜下观察原代髓核细胞的形态;细胞爬片培养后进行甲苯胺蓝和番红O染色观察;通过RT-PCR法,免疫组化法检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达;MTT法绘制髓核细胞生长曲线。结果髓核细胞甲苯胺蓝和番红O染色显示阳性;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和蛋白聚糖免疫组化荧光检测呈阳性;RT-PCR鉴定发现细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白聚糖mRNA表达阳性;MTT生长曲线与体外细胞培养时生长过程相符。结论成功建立了髓核组织直接分离培养方法,原代髓核细胞生长状态良好,为组织工程髓核的种子细胞研究提供了实验依据。     

人髁突软骨细胞培养方法探讨

目的探讨人胚髁突软骨细胞培养方法。方法分离出人胚髁突软骨组织,分别采用组织块培养法、传统两次酶消化法、改良酶消化法进行髁突软骨细胞原代培养,倒置相差显微镜下进行细胞形态学观察,甲苯胺蓝和HE染色鉴定软骨细胞。结果倒置相差显微镜观察发现,采用组织块培养法,未见细胞从组织块爬出;而传统的两次酶消化法可获细胞数为10^5／mL,但使用的胶原酶浓度高,消化时间较长;改良的Ⅱ型胶原酶消化联合胰蛋白酶法,对原代髁突软骨细胞分离取得了优良而稳定的效果,可收获细胞数为10^7／mL。结论改良的Ⅱ型胶原酶消化联合胰蛋白酶法是一种良好的人髁突软骨细胞培养的方法。     

基质金属蛋白酶基因在兔关节软骨细胞体外损伤后不同时间点的表达变化

目的:检测基质金属蛋白酶(MMPs)在兔膝关节软骨细胞损伤后不同时间点的表达变化.方法:无菌条件下获取兔膝关节软骨细胞,原代体外培养软骨细胞,6孔板内制备细胞损伤模型.显微镜观察正常细胞和划伤后1、3和7 d的软骨细胞的增殖情况.实时荧光定量PCR检测正常软骨细胞和损伤后1、3和7 d MMPs的mRNA表达水平.结果:成功分离关节软骨细胞,原代培养后成功建立细胞损伤模型.MMP-2 mRNA表达水平在损伤后1、3、7 d比正常组均升高,其中损伤后7 d最高(P<0.05～P<0.01).MMP-3 mRNA表达水平在细胞损伤后1、3、7 d与正常组均明显下降,损伤后7 d最低(P<0.01).MMP-9 mRNA表达水平在损伤后1、3、7 d均比正常组升高,划伤后3 d最高,随后开始下降(P<0.01).结论:MMPs在细胞损伤后的不同时间点表达不同,可为调节细胞外基质基因治疗关节软骨损伤提供实验依据.     

兔甲状软骨细胞体外培养研究

目的:研究体外培养的甲状软骨细胞的生物学特性。方法:分离培养兔甲状软骨细胞,进行原代与传代培养,用倒置显微镜及组织学方法观察细胞形态、功能及生长增殖。结果:原代、第2代、第3代软骨细胞呈圆形或多角形,第4代有一半变成梭形,第6代绝大多数变成长梭形;原代甲状软骨细胞阿新蓝染色阳性,具有合成和分泌糖胺多糖的功能。结论:体外单层培养的兔甲状软骨细胞表型能保持3代稳定,具有正常的生长增殖能力。