人21.5kDa MBP基因对肝癌HepG-2细胞增殖与凋亡作用研究

目的 探讨人21.5kDa髓鞘碱性蛋白(MBP)对肝癌HepG-2细胞增殖与凋亡的影响.方法 用含21. 5kDa MBP基因的pSVCEP-MBP-CAT质粒转染肝癌细胞(HepG-2),设空质粒转染为对照组,用RT-PCR、Western blot杂交检测转染效果,后以H2O2处理上述细胞,通过MTT测定细胞增殖曲线,DNA琼脂糖电泳、免疫细胞化学分析、彗星电泳、TUNEL原位杂交等多种方法检测凋亡及相关蛋白的表达情况.结果 人21.5kDa MBP基因在肝癌HepG-2细胞转染成功, MTT测定细胞增殖曲线显示阳性转染组细胞有增殖和抗凋亡的作用,DNA琼脂糖电泳显示对照组有大量的DAN ladder形成,Caspase-3免疫组化证实对照组细胞Caspase-3表达显著升高,彗星电泳和TUNEL原位杂交显示对照组DNA损伤及凋亡严重而转染组较轻. 结论人21.5kDa MBP对肝癌HepG-2细胞有促进增殖和抗凋亡的作用.     

人脑髓鞘碱性蛋白基因cDNA在大肠杆菌中表达的初步研究

将ＢａｍＨＩ酶切的人脑髓鞘碱性蛋白（ＭＢＰ）基因ｃＤＮＡ克隆片段和表达载体ｐＧＥＸ５Ｔ重组后转化大肠杆菌，再筛选、趱ＩＰＴＧ诱导，结果显示：阳性克隆１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ有２条特异区带（４９ｋｄ和３５ｋｄ），Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交证实文具区带具ＭＢＰ抗原特异性，蛋白质含量测定、免疫斑点杂交和ＥＬＩＳＡ分析，该膜蛋白表达量占菌体裂液蛋白质总量６％（５０ｍｇ／Ｌ菌液）。     

重组质粒pSUPER-HBs RNAi的构建及筛选

目的:利用pSUPER-RNAi载体系统进行HBs RNAi序列的初步筛选和干扰效果鉴定。方法:设计并合成针对HBs基因区的3条siRNA(HBs-siRNA1、HBs-siRNA2、HBs-siRNA3),构建3种重组载体pSUPER-HBs-siRNA,与HBV质粒同时瞬转人胚肾293T细胞,72 h后观察转染效果,实时定量PCR和ELISA法鉴定3种干扰序列对HBs的干扰效果,筛选最佳干扰序列。结果:成功构建3种干扰质粒pSUPER-HBs-siRNA,能高效转染人胚肾上皮细胞293T,转染效率在70％以上；实时定量PCR和ELISA法结果均显示HBs-siRNA2可有效抑制HBs的表达,抵制率可达80%,而HBs-siRNA1、HBs-siRNA3干扰效果不显著,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建3种干扰质粒pSUPER-HBs-siRNA,筛选出其中能有效抑制HBs基因表达的pSUPER-HBs-siRNA2序列,为后续研究奠定了基础。     

MBP的提取,鉴定及EAE模型的建立

本实验通过脱脂、抽滤、酸化等步骤，提取了髓鞘碱性蛋白，对其性质进行了鉴定，结果表明，提取的髓鞘碱性蛋白具有与文献报告结果大致相同的特性。我们应用获得的髓鞘生蛋白成功地在豚鼠建立了实验性变态反应性脑脊髓炎模型。     

慢病毒携带人Galectin-3基因RNAi的有效靶点筛选

目的 构建携带人Galectin-3基因的RNAi慢病毒载体,测定感染滴度,并对不同靶点进行有效筛选.方法 根据Galectin-3基因设计4对,经退火制备的双链DNA oligo,连接经双酶切的线性化pGCL-GFP/U6载体,转化后经PCR鉴定,阳性克隆测序,质粒抽提,经CaCl2导入293T细胞,包装成慢病毒,收集病毒上清并检测其滴度.将含Galectin-3基因的RNAi病毒颗粒,感染靶细胞,荧光显微镜观察细胞荧光,感染率>50%时,收集细胞抽提RNA,RT-PCR检测Galectin-3 mRNA水平,评价干扰效果.结果 经测序、PCR分析证实目的 序列成功连接到载体上,载体构建成功,包装成高滴度慢病毒.感染MCF-7细胞系后,细胞荧光显示感染率>50%,定量RT-PCR检测结果发现:1#和3#靶点敲减Galectin-3基因效率达95%、85%.结论 成功构建并筛选了携带有人Galectin-3基因的RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步研究Galectin-3在肿瘤细胞中的作用提供实验平台.     

心脑血管疾病血清MBP,sIL—2R及TNF检测的临床意义

应用国产髓鞘碱性蛋白ＥＬＩＳＡ检测药盒，测定了３２例不同年龄组心，脑血管疾病患者血清中ＭＢＰ水平，发现除脑梗塞，中风患者血清ＭＢＰ水平较其他疾病者升高外６０岁以上的老人血清中亦有较高水平的ＭＢＰ     

首发精神分裂症患者血清NSE和MBP的变化

目的通过对首发精神分裂症患者神经元特异性烯醇化酶（NSE）和髓鞘碱性蛋白（MBP）的测定，了解神经分裂症患者是否存在神经系统损伤。方法选择79例首发精神分裂症患者和29例健康自愿者对照。采用双抗体夹心酶标免疫分析法分别测定其血清中的NSE和MBP。并分别评定入组第1d及第7周后的阳性和阴性症状量表（PANSS）。结果患者组NSE和MBP含量明显高于对照组，与PANSS总分减分率呈负相关。结论精神分裂症患者有可能存在神经系统损伤，且损伤程度可能与疗效有关。     

脑白质疏松患者血清MBP水平与MRI分级的研究

目的 探讨髓鞘碱性蛋白(MBP)在脑白质疏松(LA)患者中的临床意义.方法 实验分为5组:正常对照组(N)、无危险因子LA组(NLA)、高血压并LA组(HBP+LA,HLA)、糖尿病并LA组(DM+LA,DLA)、高血脂并LA组(HL+LA,LLA)、心脏病并LA组(CD+LA,CLA),用酶联免疫分析法测定60例LA患者和30例健康人血清MBP的含量.将LA患者根据其严重程度分为4级,所有参加研究者进行MRI检查.结果 LA组患者血清MBP的含量显著高于正常对照组(P<0.05,P<0.01),而且随脑白质疏松严重程度的加重而血清MBP的含量也随之明显升高(P<0.05,P<0.01).伴有危险因子组LA患者血清MBP含量明显高于不伴危险因子组(P<0.05).结论 MBP与LA的发生、发展有着一定的关系,血清MBP含量与影像学资料结合可以反映LA的严重程度.     

FGL2基因RNAi慢病毒载体的构建及外源性筛选与鉴定

目的拟构建人纤维蛋白原样蛋白2(FGL2)凝血酶原酶基因RNA干扰慢病毒载体,为调控人FGL2凝血酶原酶表达水平提供有利的工具。方法根据人FGL2凝血酶原酶基因的mRNA序列选择4条靶序列,设计合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生FGL2慢病毒载体,采用PCR及测序鉴定,应用Western blot技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列。用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以系列稀释法测定病毒滴度。结果 PCR扩增和测序结果显示,人FGL2凝血酶原酶核苷酸链序列插入正确,外源性筛选确定一条干扰效率高的有效靶序列。利用筛选确定的有效靶序列,包装产生慢病毒,其浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/ml。结论证实实验成功构建了FGL2基因RNA干扰慢病毒载体。     

乳腺癌组织中ASNS和MBP表达水平及临床意义

目的 研究乳腺癌组织中门冬酰胺合成酶(asparagine synthetase, ASNS)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)的表达,分析两者的临床意义。方法 以90例乳腺癌患者为研究对象,均手术病理证实,随访3～36个月,平均随访(32.45±2.13)个月。应用免疫组织化学检测癌及癌旁组织中ASNS和MBP的表达,Spearman秩相关分析两指标表达的相关性,统计学分析ASNS、MBP表达与临床病理特征的关系,Kaplan-Meier分析ASNS、MBP表达对乳腺癌患者生存预后的影响,单因素及多因素COX回归分析影响乳腺癌患者生存预后的因素。结果癌及癌旁组织中ASNS阳性率分别为73.33%(66/90)、24.44%(22/90),MBP阳性率分别为27.78%(25/90)、86.67%(70/90)。癌组织中ASNS阳性表达率明显高于癌旁组织(χ~2=21.679,P<0.001),MBP阳性表达率明显低于癌旁组织(χ~2=45.139,P<0.001)。Spearman秩相关分析结果示乳腺癌组织中ASNS、MBP蛋白呈显著负相关(r=-0.569,P<0.001)。不同肿瘤分期及淋巴结转移患者癌组织中ASNS、MBP阳性率差异有统计学意义(均P<0.05)。随访期间死亡18例,3年总体生存率为80.00%(72/90)。ASNS阳性组的3年总体生存率显著低于ASNS阴性组(χ~2=5.113,P=0.001),MBP阳性组的3年总体生存率显著高于阴性组(χ~2=7.335,P=0.007)。ASNS阳性、MBP阴性、肿瘤分期Ⅲ期及淋巴结转移是影响乳腺癌预后的独立危险因素。结论 乳腺癌中ASNS表达升高,MBP表达降低,两者是乳腺癌患者不良生存预后的独立危险因素。     

高位臂丛神经撕脱伤大鼠血清及脑脊液中髓鞘碱性蛋白的动态变化

目的：通过臂丛神经高位撕脱伤大鼠血清及脑脊液中髓鞘碱性蛋白（MBP）的测定,探询其变化规律,可提供一种非影像学的诊断方法,用以鉴别臂丛神经的根性撕脱和非根性撕脱.方法：将Wistar雌性大鼠39只随机分为臂丛神经根性撕脱伤和高位非根性撕脱伤各6组及对照组,共13组.其中损伤12组分别以CarlstedtT法[1]颈椎后入路制成臂丛神经根性撕脱伤和高位非根性撕脱伤损伤动物模型,于规定时间处死,抽取脑脊液和血液,定量测定MBP.结果：（1）根性撕脱伤组：与对照组比较,血液和脑脊液中MBP含量于损伤后均出现显著增高（P＜o.01）,有统计学意义;（2）高位非根性撕脱伤组：与对照组比较,血液中MBP含量于损伤后出现显著增高（P＜0.01）,而脑脊蒗中MBP含量无显著差异.结论：高位臂丛神经损伤大鼠血液中MBP含量均可出现显著增高.而脑脊液中是否出现MBP含量变化,则可以作为一项判断该损伤是否累及神经根的参考指标,有诊断意义.     

用于抗HBV RNAi重组质粒的构建

目的构建针对乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原的siRNA表达载体pSuper-HBV,以用于后继的RNAi研究.方法根据RNA作用原理设计,针对HBV S/C区的相应序列,再将其克隆入含聚合酶Ⅲ H1-RNA启动子的表达载体pSuper.结果经酶切鉴定、电泳和测序分析证明,含作用序列的重组质粒pSuper-HBVs/pSuper-HBVc及随机序列对照组pSuper-HBVcontrol构建是成功的.结论用于抗HBV RNAi的重组质粒可于体外成功构建,但仍需进一步实验来确定最佳作用靶点.     

人21．5kDaMBP基因沉默对神经胶质瘤细胞增殖与凋亡的作用研究

目的：研究人21．5kDa人脑髓鞘碱性蛋白（MBP）基因沉默对神经胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响。方法将21．5kDaMBP序列特异性短发夹RNA（shRNA）重组质粒pGenesil‐1‐MBP‐3转染神经胶质瘤细胞株（U251）作为MBP基因沉默组,以空质粒转染为阴性对照组,脂质体转染为脂质体空转组;用实时定量PCR（RT‐PCR）和Westernblot方法检测各组21．5kDaMBPmRNA和蛋白的表达水平,CCK‐8法测定细胞增殖曲线,流式细胞法分析细胞凋亡率。结果与阴性对照组相比,MBP基因沉默组细胞中21．5kDaMBP在mRNA和蛋白水平的表达均显著下降（P＜0．05）、细胞增殖活性明显降低（P＜0．05）、细胞凋亡率显著增高（P＜0．05）。结论人21．5kDaMBP基因沉默对神经胶质瘤细胞U251具有显著的抑制增殖和促进凋亡的双重调节作用。     

发卡样CTGF特异性RNA干扰重组体的构建及筛选

目的：利用Pgenesil 1质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA表达的质粒，并筛选有效的抑制序列。方法:分别设计3对有小发夹结构的两条DNA序列及1对非特异对照序列，经退火成互补双链,再克隆至带有U6启动子的质粒载体Pgenesil 1中，构建重组体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析。将构建成功的4组重组体转染HSC T6 24?h后，通过半定量RT PCR分析HSC T6 CTGFmRNA的表达水平，与空白对照及仅加转染试剂组比较分析。结果:CTGF的shRNA片段被成功克隆到Pgenesil 1质粒载体中，经酶切与测序证实构建成功，转染HSC T6 24?h后，与空白对照组相比，通过半定量RT PCR分析发现有两组细胞CTGFmRNA水平明显下降，24?h抑制效率分别为(74±5)%,(P<0.01);(61±3)%,(P<0.05)。转染非特异shRNA组及仅加转染试剂组CTGFmRNA表达水平无明显变化。结论:成功构建了能表达CTGFshRNA的3组重组体，并筛选出能高效抑制CTGF表达的shRNA序列，为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了实验基础。     

P53,Bcl-2,Bax蛋白在胃癌组织中的表达及意义

目的　探讨胃癌发病的病理学机制。方法　应用免疫组织化学技术和原位杂交技术 ,观察P53 ,Bcl 2 ,Bax蛋白在胃癌和胃溃疡组织中的表达。结果　胃溃疡组织中P53 ,Bcl 2 ,Bax表达的阳性率分别为 0 ,0 ,5 2 .4 % ;胃癌组织中的阳性率分别为 4 2 .2 % ,4 .4 0 % ,93.3% ;P53 ,Bax在胃癌及胃溃疡组织中的表达差异有显著性 (P <0 .0 1,P <0 .0 5 ) ,Bcl 2在胃癌及胃溃疡组织中的表达差异无显著性 (P>0 .0 5 )。结论　P53 ,Bax蛋白在胃癌发生中起重要作用     

乙肝病毒核心蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建2种包含乙肝病毒核心蛋白(HBc)基因的真核表达载体,检测其在人肝癌细胞系BEL7402中的表达.方法 以质粒pUC19/3.0HBV作为模板,PCR扩增HBc基因,分别以pcDNA3.0和pEGFP-N1为母本,构建含HBc基因的真核表达载体pcDNA-HBc-HA及pEGFP-HBc.通过单、双酶切、PCR及DNA测序鉴定其正确性.利用脂质体将其分别转染入人肝癌细胞系BEL7402,并采用RT-PCR、Western blot及荧光显微镜观察的方法,分别检测其mRNA、蛋白质水平的表达.结果 获得与预期分子量大小一致的DNA片段,转染2种质粒的BEL7402细胞均可高水平表达HBc mRNA,而空载体转染组则无表达,转染pEGFP-HBc转染组及pEGFP-N1转染组,均有较强的绿色荧光表达,pcDNA-HBc-HA转染组细胞可检测到HBc-HA融合蛋白的表达.结论 成功构建2种携栽HBc基因的真核表达载体,并可在人肝癌细胞系BEL7402中有效表达.     

RNA干扰中小干扰RNA的设计原则

RNA干扰(RNAi)是由内源性或外源性双链RNA介导的一种高度保守的序列特异性基因表达调控机制,主要通过小干扰RNA(siRNA)和微小RNA发挥作用。由于其具有高效、高特异性、作用稳定等特点,已被广泛地应用于基础实验和疾病治疗的研究中。在进行siRNA介导的RNAi实验时,如何设计高效、特异性抑制靶mRNA的siRNA是实验成败的关键。     

牛β-乳球蛋白基因的克隆及其调控外源基因表达的研究

目的制备乳腺生物反应器所必需的乳腺特异性表达的调控序列,并验证其指导外源基因表达的能力.方法用PCR法从奶牛染色体上分5段扩增出了全长8.2Kb的牛β-乳球蛋白基因,包括1.8Kb的5′侧翼区、1.7Kb的3′侧翼区及4.7Kb的gDNA区.扩增出的各片段克隆到T-载体上,酶切鉴定及序列分析均证实了所扩增片段的正确性.将五个片段与荧光素酶cDNA拼接成荧光素酶瞬时表达载体并在小鼠乳腺中瞬时表达.结果注射荧光素酶瞬时表达载体的小鼠乳汁中明显测出了荧光素酶活性.结论所克隆的牛β-乳球蛋白基因表达调控序列能够指导外源基因在小鼠乳腺中表达.     

RNAi在小鼠卵母细胞和胚胎发育研究中的应用

RNA干扰（HNAi）由双链RNA（daRNA）介导的、序列特异地引起转录后基因沉默的现象，是生物体内抵御转座子和病毒感染的重要保护机制之一，也是在生长发育过程中调节内源基因表达的重要途径。RNAI可作为一种简单有效的代替基因剔除的工具应用于功能基因组学和疾病的基因治疗研究。现综述RNAi机制、作用特征及RNAi相关技术在小鼠卵母细胞和胚胎发育研究中的应用。     

小鼠NMNAT1基因的过表达和RNAi重组慢病毒的构建包装和检测

目的:针对小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1( NMNAT1)基因构建质粒并进行慢病毒包装,同时检测其表达水平和干扰效率,为进一步探讨该基因的功能提供研究工具和实验基础.方法:根据NMNAT1基因信息,用慢病毒载体pLenti6构建三种重组质粒,分别包含NMNAT1 cDNA全长、一个针对NMNAT1的小干扰序列和一个用于干扰对照的阴性序列.把这些质粒包装进慢病毒载体,并检测病毒滴度,再用慢病毒感染Hela细胞检测NMNAT1表达量和RNA干扰效率.结果:测序结果证明目的序列正确地插入到载体内.通过qPCR方法鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度均为2×108 TU/ml以上.表达NMNAT1的重组慢病毒感染Hela细胞,该细胞能够高水平表达NMNAT1蛋白,而携带RNAi序列的慢病毒能够显著抑制其表达,干扰效率在70％以上.结论:针对NMNAT1的过表达和RNAi重组慢病毒制备成功,为进一步研究NMNAT1基因的功能和用慢病毒进行基因治疗提供了良好的研究工具.