2型糖尿病KKAy小鼠海马神经元存活信号转导途径的异常及APP17肽对其的改善作用

目的　观察APP17肽对 2型糖尿病KKAy小鼠大脑海马神经元一些信号转导蛋白表达的影响。方法　将KKAy小鼠分为正常对照组 (C组 )、糖尿病组 (DM组 )和APP17肽治疗组 (DM +APP17P组 )。APP17肽皮下注射 ,每周 3次 ,每次 8μg·kg-1。 12wk后将 3组小鼠颈部离断 ,处死 ,冰浴中快速分离海马组织 ,匀浆后 ,用于免疫沉淀并蛋白印迹检测 ,部分快速灌注固定做免疫组化染色和Tunel细胞染色。结果　DM组 pMAPK的表达低于C组和DM +APP17P ;CREB、pCREB、Bax、Bcl 2的表达 3组之间差异无显著性。结论　 2型糖尿病KKAy小鼠存在海马胰岛素信号转导通路的异常 ,主要表现为Ras途径和PI3 K两条途径的异常。这种信号转导途径的异常可通过神经元一定程度上的自我调节而改善 ,不出现凋亡状态 ;App17肽作为神经营养因子能激活海马神经元存活信号转导通路上游成分 ,从而使存活信号转导通路恢复正常     

APP17肽对APP转基因小鼠突触相关蛋白表达的影响

目的研究APP17肽对APP转基因小鼠(APP V717 I)海马神经元突触相关蛋白表达的影响。方法将3 mon龄的APP转基因小鼠随机分为模型组和APP17肽治疗组(皮下注射0.16 mg.kg-1.d-1,每周3次),并以相同年龄和背景的C57BL/6 J小鼠做正常对照组。7 mon后行Morris水迷宫测定,小鼠脑组织灌注固定后进行PSD-95、Shank1蛋白的免疫组化染色。结果模型组小鼠水迷宫实验的逃避潜伏期明显长于治疗组和正常对照组,且模型组小鼠大脑海马CA4区中的PSD-95、Shank1阳性反应神经元明显减少,染色浅;APP17肽治疗组与正常对照组相近。结论APP转基因小鼠大脑中存在突触后致密区蛋白表达异常,由此引起突触功能损害,进而导致记忆、学习能力的改变;而APP17肽能通过提高PSD-95、Shank1的表达,使突触的损伤接近恢复正常。并能改善小鼠的记忆、学习能力。     

APP17肽对D-半乳糖老化小鼠海马神经元IRS和PI3K表达的影响

目的通过对胰岛素受体底物-1(IRS-1)、胰岛素受体底物-2(IRS-2)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)在海马表达的观察,研究APP17肽对D-半乳糖老化小鼠海马神经元信号转导途径上游步骤的影响。方法小鼠随机分为3组,每组22只:正常对照组(C组)、D-半乳糖模型组(D组)、APP17肽治疗组(D+P组)。D、D+P2组每日皮下注射半乳糖100mg·kg-1。D+P组每周一、二、五皮下给药APP17肽0·35μg/只。4个月后,小鼠灌注固定,行脑冰冻切片,用PI3K、IRS-1、IRS-2抗体进行免疫组化染色。Westernblot应用IRS-1抗体染色。结果免疫组织化学染色方法检测海马神经元胰岛素受体底物-1、胰岛素受体底物-2、PI3K的表达,结果显示3种抗体C组深染的阳性细胞排列整齐,染色深,突起深染,可见2~3级分支,细胞计数与D组差异有显著性;D组海马阳性反应细胞着色浅,少有突起,细胞数目少,分别为正常对照的67·5%、63·68%和48·6%。APP17肽治疗组(D+P组)染色结果与C组相似,阳性细胞数目接近C组,与半乳糖老化组比较差异均有显著性,P<0·05,但阳性细胞突起少于C组,排列亦不如C组整齐。Westernblot结果亦显示D组海马表达IRS-1减少,应用17肽后IRS-1表达上调,但不如C组数值高。结论D-半乳糖老化小鼠海马神经元IRS-1、IRS-2、PI3K的表达明显下降;APP17肽能上调D-半乳糖老化小鼠海马IRS-1、IRS-2和PI3K的表达。     

类叶升麻苷调节AKT/NFκB通路改善APP/PS1双转基因小鼠的认知障碍作用

目的探讨类叶升麻苷(acteoside,AS)对APP/PS1双转基因小鼠脑组织AKT、NFκB的影响。方法健康APP/PS1转基因小鼠50只,♀♂各半,对照C57鼠10只,连续60 d灌胃给药,在给药期间进行筑巢实验和新物体识别实验,检测小鼠海马和皮层中AKT、NFκB相关蛋白的表达。结果与模型组相比,AS可以明显改善小鼠的筑巢行为能力,增强阿尔茨海默病小鼠的探索新物体的兴趣。同时,与模型组相比,AS可以显著降低海马及皮层组织中NFкB p-p65/NFкB p65的比值,提升p-AKT-308/AKT、p-AKT-473/AKT的比值。结论AS可能通过对AKT、NFκB的调节,从而抑制神经细胞凋亡和保护神经细胞,以治疗神经退行性疾病。     

右美托咪定对减轻 APP/PS1小鼠海马区炎性因子分泌及细胞凋亡的作用

目的 探讨右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)对APP/PS1转基因小鼠海马区抗炎抗凋亡的作用,并探讨其可能的机制.方法 2018年3月至2019年3月,将APP/PS1小鼠采用随机数字表法分为模型组(TG)、DEX低、高剂量组(TG+10、20μg/kg DEX,每天腹腔注射1次,连续4周)和4-苯基丁酸(PBA)阳性对照组(TG+400 mg/kg PBA,每天腹腔注射1次,连续4周),另取野生型C57BL/6小鼠作为对照组(WT);水迷宫检测各组小鼠的学习与记忆能力;Nissl染色各组小鼠海马区神经细胞的数量;TUNEL检测各组小鼠海马区凋亡细胞数;ELISA检测各组小鼠海马区白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)蛋白的表达;WB法检测海马区B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)的表达;WB法检测小鼠海马区内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和内质网应激蛋白(CHOP)的表达.结果 与TG组比较,PBA和DEX明显提高APP/PS1小鼠的学习与记忆能力;增强海马区神经元的数量并减少神经细胞的凋亡;显著降低IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白的浓度;抑制Bax/Bcl-2和裂解的caspase-3的表达;降低GRP78和CHOP的蛋白表达.结论 DEX对APP/PS1小鼠海马区炎症因子分泌以及细胞凋亡有一定的减轻作用,可能是通过抑制海马区内质网应激来发挥治疗作用.     

2-（α-羟基戊基）苯甲酸钾盐（PHPB）对APP/PS1转基因小鼠海马神经元、突触和轴突损伤的保护作用

目的利用10月龄APP/PS1转基因小鼠考察2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐(PHPB)对海马神经元、突触及轴突损伤的保护作用。方法 10月龄APP/PS1转基因小鼠及同龄野生型对照小鼠被随机分为3组:野生对照组(n=10),APP/PS1转基因组(n=10),PHPB治疗组(n=10)。PHPB治疗组每天灌胃给予30 mg·kg~(-1)PHPB,其余两组给予相同体积的生理盐水。连续给药3个月后,进行活体1H-MRS检测,之后取海马组织进行电镜观察,高尔基染色,免疫组化染色及Western蛋白印迹实验检测,考察病理改变及药物的改善作用。结果电镜结果显示,野生对照组小鼠海马CA1及CA3区神经元饱满,双层核膜清晰完整,核内染色质分布均匀。核周线粒体丰富,高尔基体和核糖体等细胞器形态基本正常。APP/PS1小鼠海马神经元呈现细胞皱缩,染色质聚集,线粒体肿胀,脊断裂,高尔基体变性扩张等病理改变,此外在轴突可见大量聚集的未成熟自噬囊泡。经PHPB给药后,上述病理改变均呈现不同程度的改善。此外,相比于野生对照组小鼠,APP/PS1小鼠CA1及CA3区的突触密度明显降低(P<0.01),突触后致密区厚度明显变薄(P<0.05),经PHPB给药后,该区域突触密度及PSD厚度显著提升(P<0.05)。高尔基染色结果显示,相比于同龄野生型小鼠,APP/PS1小鼠CA1区及DG区海马神经元二级和三级树突分枝上的树突棘密度明显降低(P<0.01),经PHPB治疗后可见明显提升(CA1:P=0.070;DG:P<0.05)。Sholl分析显示相比于同龄野生型小鼠,APP/PS1转基因小鼠海马DG区神经元分枝数目明显降低(P<0.05),PHPB治疗能够明显提升其树突分枝数量(P<0.05)。Western蛋白印迹实验结果显示,相比于同龄野生型小鼠,APP/PS1小鼠海马组织中PSD-95,SYP等突触相关蛋白的含量明显降低(P<0.01),自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明显提升,而PHPB能够显著提升APP/PS1转基因小鼠海马组织中PSD-95的含量(P<0.05),并下调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(P<0.01),提示其对突触丢失及自噬异常的改善作用。免疫组化结果显示,相比于同龄野生型小鼠,APP/PS1小鼠海马区LC3-Ⅱ阳性染色面积显著增加,而经PHPB治疗后,阳性区域面积呈降低趋势(P=0.055),提示PHPB可以对LC3-Ⅱ阳性自噬囊泡聚集造成的轴突变性起到一定缓解作用。在体1H-MRS结果显示,相比于同龄野生型小鼠,APP/PS1小鼠海马NAA及Glu等代谢物含量明显降低(P<0.05),而经PHPB治疗后2种代谢物含量均呈上调趋势(NAA:P=0.077;Glu:P=0.066)。由于NAA主要存在于成熟神经元及轴突,而Glu作为兴奋性神经元的神经递质主要储存于突触,该结果进一步表明APP/PS1转基因小鼠海马的退行性病变,及PHPB对该区域神经元和突触的改善作用。结论 PHPB能够明显改善APP/PS1转基因小鼠海马神经元及细胞器微观结构,提升突触数量,PSD厚度,增加树突棘密度,上调突触相关蛋白含量,改善海马神经元自噬障碍及代谢异常,表现出对海马神经元、突触及轴突损伤的保护作用。     

多肽P165对糖尿病小鼠学习记忆功能及海马神经元蛋白表达的影响

目的研究多肽P165对糖尿病模型小鼠学习记忆能力及海马神经元蛋白表达的影响。方法用链脲佐菌素诱发小鼠糖尿病模型,应用P165(0.07,0.17,0.3mg·kg-1)灌胃治疗,5wk后进行Morris水迷宫试验;小鼠脑组织海马做Akt、PI3K、P-CREB、Bcl-2、Bax、CytoC免疫组织化学染色;另一部分鼠脑海马,做Bcl-2、Bax抗体蛋白免疫印记。结果①水迷宫试验:糖尿病模型小鼠到达站台游动时间比正常对照组延长(P<0.01);而P165(0.07,0.17,0.3mg·kg-1)灌胃治疗组较DM组动物分别缩短(P<0.01)。②神经免疫组织化学实验及Westernblot结果:糖尿病给予P165小鼠与对照组小鼠海马组织内神经元表达细胞存活相关蛋白及抗凋亡相关蛋白PI3K、Akt、P-CREB、Bcl-2阳性细胞数相似,明显高于糖尿病小鼠(P<0.01);糖尿病给予P165小鼠与对照组小鼠表达凋亡蛋白Bax、CytoC阳性细胞数相似,明显少于糖尿病小鼠(P<0.05)。Westernblot结果相同。结论糖尿病小鼠海马神经元表达细胞存活相关蛋白下降,神经元表达细胞凋亡相关蛋白增加,导致其学习记忆能力下降。P165应用可以使上述蛋白恢复到接近正常,从而改善糖尿病小鼠学习记忆能力。     

氟西汀对阿尔茨海默病模型小鼠的神经元保护作用

目的:研究氟西汀对老年APP/PS1双重转基因阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力的影响及对神经元的保护作用.方法:实验分为动物实验和细胞实验.动物实验中取APP/PS1双重转基因小鼠随机分为氟西汀组(n=8)和生理盐水组(n=8),另取C57同窝生同月龄正常小鼠10只为对照组.氟西汀组小鼠给予氟西汀(10 mg/kg)腹腔注射,生理盐水组及对照组注射等量生理盐水1次/d,持续8周.Morris水迷宫实验进行行为学检测.Tunel染色检测海马区神经元凋亡.细胞实验中将人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)培养48 h后分为正常组、Aβ组、氟西汀组和氟西汀+Aβ组,后3组分别在含10μmol/L β-淀粉样蛋白、100 nmol/L氟西汀和100 nmol/L氟西汀+10μmol/L β-淀粉样蛋白的DMEM中继续培养48 h.行原位细胞凋亡染色检测各组细胞凋亡.结果:水迷宫定位航行实验中,氟西汀组小鼠较生理盐水组相比平均潜伏期明显缩短(P＜0.01);空间探索实验中跨越平台次数增加(P＜0.01);海马区凋亡神经元数量减少(P＜0.01).细胞实验中,氟西汀组和氟西汀+Aβ组与Aβ组相比,凋亡细胞数量明显减少(P＜0.01).结论:氟西汀对神经元细胞有保护作用,能减少神经元的凋亡,长期服用氟西汀能显著改善APP/PS1阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆力能力.     

EGCG通过抑制p75~(NTR)通路对APP/PS1小鼠学习记忆障碍的改善作用

目的探讨(-)表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对APP/PS1转基因小鼠学习记忆障碍的改善作用及其对海马内p75NTR信号通路及其介导的神经细胞凋亡的影响。方法以Morris水迷宫及被动避暗实验观察其行为学变化,TUNEL法及fluoro-Jade B法检测神经细胞凋亡及神经元退行性变,并以Western blot法检测小鼠海马p75NTR相关蛋白的表达水平。结果 EGCG可明显改善APP/PS1转基因小鼠的学习记忆障碍,抑制神经细胞凋亡及退行性改变。同时,EGCG可明显抑制p75NTR通路,降低其剪切产物p75ICD表达及JNK2磷酸化水平,减少p53和cleaved-caspase 3蛋白表达,从而抑制神经细胞凋亡和改善学习记忆障碍,发挥神经保护作用。结论 EGCG通过抑制p75NTR信号通路,抑制神经细胞凋亡,改善学习记忆障碍。     

APP17肽对谷氨酸引起神经毒作用的影响

目的　通过观察APP17肽和谷氨酸对人神经母细胞瘤株SY5Y生长及NT 3、NF表达的影响 ,初步证实APP17肽对谷氨酸引起的神经元毒性具有一定保护效应。方法　MTT代谢率、LDH漏出率测定、细胞计数 ,WesternBlot观察SY5YNT 3、NF表达。结果　谷氨酸可使MTT代谢率降低、细胞计数减少 ,LDH漏出率升高 ,NT 3、NF表达减少 ,加入APP17肽可使上述指标恢复或接近正常。结论　谷氨酸对神经元有毒性作用 ,而APP17肽可减轻这种损伤 ,对神经元产生保护作用。     

Effects of presenilins and β-amyloid precursor protein on delayed rectifier potassium channels in cultured rat hippocampal neurons1

AIM: To study the effects of presenilin-1 (PS-1), presenilin-2 (PS-2), and amyloid beta-protein precursor (APP695) on delayed rectifier potassium channels (IK) in the cultured rat hippocampal neurons. METHODS: PS-1, PS-2, and APP695 were transfected into the cultured rat hippocampal neurons by transient transfection techniques. The IK current was observed by the whole cell patch-clamp techniques. RESULTS: IK was increased in cultured rat hippocampal neurons, after transient transfection of PS-1, PS-2, and APP695. IK amplitudes and densities were significantly increased from (1689 +/- 412) pA, (48 +/- 18) pA/pF (mock cells, GFP alone, n=17) to (5565 +/- 1403) pA, (252 +/- 107) pA/pF (PS-1/GFP, n=22, P<0.01), (3804 +/- 1651) pA, (120 +/- 58) pA/pF (PS-2/GFP, n=16, P<0.01), and (4978 +/- 904) pA, (218 +/- 70) pA/pF (APP695, n=22, P<0.01). But PS-1, PS-2, and APP695 did not alter the activation curve of IK (P>0.05). CONCLUSION: Overexpression of PS-1, PS-2, and APP695 increased IK in the cultured rat hippocampal neurons. The upregulation of IK may be related to neuronal apoptosis after PS-1, PS-2, and APP695 were transfected.     

APP17肽对心肺复苏大鼠海马神经元NGF、BDNF表达的影响

目的观察心肺复苏术后大鼠海马神经元神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达的变化,以及APP17肽对NGF、BDNF表达的影响。方法采用窒息法制作大鼠呼吸心跳骤停模型,然后行心肺复苏术(cardiopulmonary re-suscitation,CPR)。♂性Wistar大鼠18只,随机分3组:手术对照组(A组)、心肺复苏组(B组)、心肺复苏+APP17肽组(C组),复苏至自主循环恢复(return of spontaneous circula-tion,ROSC)时静脉注射APP17肽10μg·(300g)-1。应用免疫组化方法观察各组大鼠复苏2h后海马神经元表达NGF、BDNF情况。结果与对照组(A组)相比心肺复苏组(B组)大鼠海马神经元NGF、BDNF表达明显降低(P<0.05);心肺复苏+APP17肽组(C组)NGF、BDNF表达明显增加,高于B组和A组(P<0.01)。结论心肺复苏模型大鼠自主循环恢复2h海马神经元NGF、BDNF表达降低,APP17肽能恢复神经元NGF、BDNF的表达,对缺血、缺氧性神经元损伤有保护作用。     

苯那普利对糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡的影响

目的探讨血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)苯那普利对糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响。方法单侧肾切除大鼠ip STZ诱发糖尿病模型,每日ig苯那普利(10 mg·kg^-1),共12周。采用原位末端标记法检测肾脏细胞凋亡情况,流式细胞术和免疫组化检测肾皮质凋亡相关基因Fas和Fas-L的表达。结果糖尿病组较对照组肾小球、肾小管凋亡细胞数明显增多,Fas和Fas-L的表达亦显著增强;苯那普利治疗组较糖尿病组凋亡细胞数减少,Fas和Fas-L的表达减弱。结论苯那普利可能通过影响凋亡相关基因Fas和Fas-L的表达而抑制肾脏细胞凋亡,从而发挥肾脏保护作用。     

去窦弓神经大鼠心肌细胞凋亡及其相关基因蛋白表达的时程

目的:研究去窦弓神经（SAD）大鼠心肌细胞凋亡及其相关基因蛋白表达的时程。方法:10周龄SD大鼠行SAD术或假手术（Sham）,术后4、8、16和32周对SAD及相应Sham组大鼠的心肌连续切片,采用末端标记TUNEL法检测细胞凋亡;采用ABC法检测Bcl-2、Bax、Fas和Fas-L蛋白的表达,并用计算机图像分析技术进行观察和比较。结果:与Sham组相比,SAD大鼠心肌细胞凋亡率增加,Bcl-2表达减少,Bax、Fas、Fas-L表达增高,Bcl-2/Bax比率降低。结论:心肌细胞凋亡及其相关基因表达失调可能参与SAD大鼠的心肌重构,且具有一定的时间窗。     

LTBP2通过TLR4/NF-κB信号通路抑制糖尿病大鼠海马神经元凋亡

目的 探讨沉默潜在转化生长因子 β 结合蛋白 2（LTBP2）基因对糖尿病大鼠学习记忆功能的影响及 机制。方法 雄性SD大鼠45只一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）55 mg/kg,72 h后采尾静脉血测血糖,将血糖＞ 16.7 mmol/L 的大鼠定为糖尿病模型;模型诱导成功后将大鼠随机分成3组：糖尿病（DM）组、si-LTBP2组（大鼠海马 给予腺病毒包装的针对LTBP2的siRNA 10 μL）、sc-LTBP2组（大鼠海马给予LTBP2对照序列10 μL）,每组15只。另 取15只正常大鼠作为对照（CON）组。12周后,水迷宫检测大鼠学习记忆能力;免疫组织化学染色和实时荧光定量聚 合酶链式反应（qPCR）检测海马LTBP2表达;Western blot检测海马LTBP2、Toll样受体4（TLR4）、核因子（NF）-κB蛋 白相对表达量;TUNEL染色检测海马神经元凋亡。结果 与CON组相比,DM组、si-LTBP2组和sc-LTBP2组LTBP2、 TLR4、NF-κB表达明显增加,海马神经元凋亡明显增多,大鼠学习记忆能力明显下降（均P＜0.05）。与DM组相比, si-LTBP2 组 LTBP2、TLR4、NF-κB 表达明显降低,海马神经元凋亡明显减少,大鼠学习记忆能力明显提升（均 P＜ 0.05）。结论 沉默海马LTBP2的表达可明显改善糖尿病大鼠学习记忆能力,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号 通路有关。     

UPAN对去卵巢大鼠神经元退行性变的作用

目的　通过观察UPAN对卵巢切除大鼠学习、记忆功能 ,海马神经元超微结构以及有关蛋白质表达的影响来证实UPAN对神经元退行性变有改善作用。方法　♀大鼠 ,行双侧卵巢切除手术造模 ,并于 6wk后皮下注射UPAN进行治疗 ,12wk后行水迷宫实验 ,至 13wk开始行灌注固定 ,取脑组织作超薄切片进行电镜分析 ;作冰冻切片进行雌激素受体 (ERα)、糖元合成激酶 (GSK 3)、细胞周期动态激酶(CDK 5 )、蛋白磷酸酯酶 (PP 1、PP2A及PP 2B)免疫组化染色。结果　水迷宫检测卵巢切除组大鼠较正常组游完全程所须时间明显延长及错误反应次数明显增多 ,UPAN治疗组结果与正常组接近。去卵巢组大鼠海马神经元超微结构明显损害 ,ERα表达增高 ,GSK 3、CDK 5、PP 1、PP2A及PP 2B表达增高 ,但以蛋白激酶GSK 3和CDK 5增高最为明显。使用UPAN治疗后能明显改善海马神经元超微结构的损害 ,使上述有关蛋白质的表达恢复到正常水平。结论　去卵巢大鼠存在着学习、记忆功能障碍 ,海马神经元超微结构以及有关蛋白质的表达出现异常改变。UPAN能明显改善其学习、记忆功能 ,维持海马神经元超微结构的完整性以及使有关蛋白质表达恢复到正常水平。