辛伐他汀对大鼠系膜细胞增殖、凋亡及细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响

目的 观察辛伐他汀(simvastatin)诱导大鼠系膜细胞增殖、凋亡及可能参与其中的凋亡信号通路，探讨他汀类药物非降脂依赖性肾保护作用的相关机制。方法 四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定系膜细胞的增殖状况。透射电子显微镜、碘化丙啶染色(PI)流式细胞仪(FCM)分析检测系膜细胞的凋亡。活化半胱氨酸检测试剂盒定性及定量检测细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达。结果 (1)MTT检测显示辛伐他汀可显著抑制大鼠系膜细胞的增殖(P < 0.05)。(2)辛伐他汀处理细胞24 h后，电镜下可见细胞体积缩小、染色质浓染、致密、边移和凋亡小体形成；FCM检测均可见亚二倍体凋亡峰。定量分析发现，系膜细胞数量与辛伐他汀浓度呈剂量依赖性(P < 0.05)。(3)活化半胱氨酸检测到辛伐他汀组细胞内caspase-3的表达，并且随药物浓度和作用时间的增加而增加。结论 辛伐他汀非降脂依赖的肾保护作用的作用机制之一是诱导系膜细胞凋亡，从而抑制其增殖，其机制可能与激活caspase-3有关。     

环扎法致大鼠脊髓损伤早期减压后caspase-3的表达及其与神经细胞凋亡相关性研究

[目的]探讨大鼠急性脊髓损伤后早期不同减压时间对神经细胞凋亡及caspase -3表达的影响.[方法]采用环扎法大鼠急性脊髓损伤压迫模型.84只SD大鼠,随机分成4组,对照组即A组:行椎板减压;实验组分为B组:环扎术后8h行减压术;C组:环扎术后72 h行减压术;D组:环扎术后不行减压术.分别于手术后1、3、7、21 d行HE染色、免疫组化染色测定caspase -3的表达、原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)标记法(TUNEL法)检测神经细胞的凋亡水平、行为学(BBB评分,斜板评分)观察大鼠神经功能恢复情况.[结果]各组不同时间点BBB评分、斜板评分之间比较具有显著性差异(P＜0.05);实验组caspase -3、Tunel阳性细胞均在术后1d增多、3d达高峰、7d表达减弱、21 d仍有表达;不同时间点caspase -3、Tunel阳性细胞数比较均具有统计学差异,二者成正相关(r =0.69 ～0.98,P＜0.05).[结论]环扎法致大鼠脊髓损伤动物模型是一种理想的脊髓损伤造模方法.大鼠脊髓损伤早期减压可能阻止或减轻脊髓神经细胞凋亡.     

脊髓损伤后细胞凋亡与半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶-3表达及其意义

半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶家族是诱导脊髓损伤后细胞发生凋亡的关键酶,其中半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶-3是最重要的效应性蛋白水解酶,其活化对细胞凋亡是必需的。抑制半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶-3的活性或拮抗其功能可使细胞凋亡受抑,减轻继发性组织损伤,有助于神经功能恢复。     

体温控制对重型颅脑损伤患者脑脊液中caspase-3、caspase-9及预后的影响

目的 探讨体温控制对重型颅脑损伤患者神经细胞凋亡及预后的影响. 方法 将42例重型颅脑损伤患者随机分为两组:实验组(n=22)患者采用亚低温治疗仪将患者急性期7d内的肛温持续控制在36℃ ～37℃;对照组(n=20)未控制体温,当体温超38℃时予常规方法降低体温.收集患者入院后第1、3、5、7d的脑脊液标本,比较两组患者脑脊液中caspase-3、caspase-9的浓度及预后的差异. 结果 ①组间比较,caspase-3及caspase-9的浓度值均在第1d无统计学差异(P＞0.05);实验组第3、5及7d浓度均低于对照组(P＜0.05).②根据伤后3～6个月GOS评分,实验组患者预后良好率高于对照组(P＜0.05). 结论 体温控制在36℃～37℃可降低重型颅脑损伤患者脑脊液中caspase-3及caspase-9的浓度,降低预后不良的发生率,改善患者的预后.     

重组人促红细胞生成素对新生大鼠缺氧缺血时脑组织Bid mRNA表达及caspase-3活性的影响

目的 研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)对新生大鼠缺氧缺血时脑组织Bid mRNA表达及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性的影响,以探讨其神经保护作用机制.方法 7日龄雄性SD大鼠90只,体重12～18 g,随机分为3组(n=30):假手术组(S组)、缺氧缺血组(HIBD组)和rhEPO组.HIBD组和rhEPO组建立HIBD模型后,分别腹腔注射生理盐水和rhEPO 3 000 IU/ks.于腹腔注射后6、12、24、48和72 h(T1～5)时每组各处死6只大鼠,取左侧大脑组织100 mg,采用RT-PCR法检测Bid mRNA表达,比色法测定caspase-3活性.结果 与S组相比,HIBD组和rhEPO组大鼠T1-5时脑组织Bid mRNA表达上调,caspase-3活性升高(P＜0.01);与HIBD组相比,rhEPO组T1-5时脑组织BidmRNA表达下调(P＜0.01),T2-4时caspase-3活性降低(P＜0.01).脑组织Bid mRNA表达与caspase-3活性呈正相关(r=0.911,P＜0.01).结论 外源性rhEPO可通过下调Bid mRNA表达和降低caspase-3活性从而对HIBD后脑组织产生保护作用.     

靶向survivin基因不同位点的siRNA对PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察靶向survivin基因不同位点的小干扰RNA(siRNA)对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞survivin mRNA表达的抑制作用以及对细胞增殖和凋亡的影响. 方法 根据survivin mRNA的结构特点,选取2个不同的作用位点,设计和构建负载survivin shRNA片段的2种重组质粒载体.以脂质体法转染PC-3细胞株,荧光显微镜下观察转染效率.实验分为survivin 1组、survivin 2组、阴性对照组和空白对照组.转染后24、48和72 h,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中survivin mRNA的表达,MTT法检测siRNA对PC-3细胞增殖的影响,流式细胞术检测凋亡率. 结果 与对照组相比,survivin 1组、survivin 2组对survivin mRNA的表达均能产生抑制效应,48 h抑制率最高,survivin 1抑制率高,达52%.实验组均能抑制PC-3细胞的增殖,survivin 1抑制细胞增殖的能力强.转染48 h后,细胞凋亡最明显,survivin 1组凋亡率高,达13.6%±1.8%. 结论 在RNAi研究中,根据特定靶基因mRNA的结构特点来进行siRNA的设计和筛选,在前列腺癌的基因治疗中具有一定的实际应用价值.     

依托咪酯预处理对HL-60细胞凋亡相关蛋白表达的影响

目的 探讨依托咪酯预处理对HL-60细胞procaspase-3、caspase-9 p35和caspase-8 p20表达的影响.方法 体外培养HL-60细胞,选择指数生长期的细胞,随机分为3组(n=3):对照组(C组)、依托咪酯组(E组)和依托咪酯预处理组(EP组).C组不给予任何处理;E组加入依托咪酯标准品500 μmol/L孵育24 h;EP组先加入依托咪酯标准品1μmol/L孵育1 h,冲洗后于培养基中培养4 h,再加入500 μmol/L依托咪酯孵育24 h.采用Western blot法测定procaspase-3、caspase-9 p35和caspase-8 p20的表达水平.结果 与C组比较,E组和EP组HL-60细胞procaspase-3表达下调,caspase-8 p20和caspase-9 p35表达上调(P＜0.05);与E组比较,EP组HL-60细胞procaspase-3表达上调,caspase-8 p20 和caspase-9 p35表达下调(P＜0.05).结论 依托咪酯预处理可抑制依托咪酯导致的procaspase-3表达下调和caspase-8 p20、caspase-9 p35表达上调,从而抑制依托咪酯诱发的HL-60细胞凋亡.     

肾上腺髓质素对缺氧复氧诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨肾上腺髓质素(ADM)对缺氧复氧(HR)诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡的影响及其机制.方法 体外培养的NRK-52E细胞,随机分为4组:正常对照组、HR组、空质粒+HR组、ADM质粒+HR组.采用Fugene HD转染试剂,将pcDNA3.1-myc-his B空质粒和ADM真核表达质粒分别转染至NRK-52E细胞内,应用免疫细胞化学的方法检测转染效率,转染成功48 h后制作HR模型.锥虫蓝摄取法进行细胞计数并计算细胞存活率,分光光度法检测上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量评价细胞活力;Annexin V和PI染色结合流式细胞仪技术检测细胞凋亡率;RT-PCR法检测ADM、Bax、Bcl-2、Fas的mRNA表达;Western印迹法检测活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、8、9(Caspase-3、8、9)的蛋白表达.结果 HR组ADM的表达显著高于正常对照组(P＜0.05).ADM质粒+HR组的ADM表达显著高于空质粒+ HR组(P＜0.05).与正常对照组相比,HR组活细胞计数和细胞存活率显著降低,LDH含量及细胞凋亡率显著升高,Bax、Bcl-2、Fas、活性Caspase-3、8、9表达显著上调,Bax上调更明显,故Bax/Bcl-2升高(均P＜0.05).与HR组相比,ADM质粒+HR组活细胞计数和细胞存活率显著升高,LDH含量及细胞凋亡率显著降低,Bax、Fas、活性Caspase-3、8、9表达显著下调,Bcl-2表达进一步上调,Bax/Bcl-2降低(均P＜0.05).空质粒+HR组和HR组比较,上述各指标差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 ADM在NRK-52E细胞中的高表达可以减轻HR诱导的细胞凋亡,其机制至少部分是通过抑制线粒体通路和死亡受体通路实现的.     

靶向IGF-1R的siRNA表达载体的构建及其对肺癌细胞的促凋亡作用

目的构建IGF-1R的siRNA表达载体，并观察其在人肺腺癌A549中对IGF-1R表达抑制及诱导细胞凋亡的作用。方法设计并构建了pENTR／U6-shRNA-1和pENTR／U6-shRNA-2，同时设计并构建了pENTR／U6-shRNA—luc作为对照，转染A549细胞，48h后检测IGF-1R表达及分析细胞凋亡情况。结果相对于对照组，pENTR／U6-shRNA-1和pENTR／U6-shRNA-2转染组IGF-IR mRNA的表达量分别为（22．1±2．5）％和（80．1±3．9）％，蛋白的表达分别为（15．2±3．1）％和（47．1±4．1）％，组间差异具有统计学意义（P〈0．05）。pENTR／U6-shRNA-1转染组抑制了Akt的磷酸化，增加了3％乙醇诱导的细胞凋亡作用，并使77．5％细胞停留在G0／G1期。结论IGF-1R的siRNA表达载体能有效地抑制IGF-1R的表达和诱导细胞凋亡。     

survivin和caspase-3在病理性瘢痕成纤维细胞中的表达及其意义

目的研究病理性瘢痕成纤维细胞中survivin和caspase-3的表达水平，以及两种凋亡相关因子与病理性瘢痕发生、发展机制的关系。方法以普通瘢痕为对照，采用RT—PCR和免疫组化方法，研究体外培养的病理性瘢痕成纤维细胞中survivin和caspase-3 mRNA和蛋白的表达变化，并进行比较分析。结果病理性瘢痕成纤维细胞中survivin的mRNA和蛋白（65．47％、72．43％）的表达水平高于普通瘢痕（P〈0．01）；caspase-3的mRNA和蛋白表达水平低于普通瘢痕（22．85％、6．34％，P〈0．01）；survivin、caspase-3在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表达差异有统计学意义（P〈0．05）。结论survivin和caspase-3在病理性瘢痕成纤维细胞中的表达异常。在病理性瘢痕的发生、发展中起重要的作用。     

RNAi人端粒酶逆转录酶基因腺病毒表达载体的构建及对肾癌细胞生长的抑制作用

目的 构建表达端粒酶逆转录酶(hTERT)基因小干扰RNA(siRNA)腺病毒载体,观察其对肾癌细胞系Ketr-3生长抑制作用.方法 将病毒Ad-hTERT体外感染人肾癌细胞系Ketr-3,分别用结晶紫染色、噻唑蓝(MTT)法检测其对细胞生长的影响,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定hTERT基因mRNA的表达水平,免疫组织化学检测hTERT抗原的表达.结果 结晶紫、MTT结果表明:在MOI=50时,Ad-hTERT感染的Ketr-3细胞发生明显病变;MOI=50的Ad-hTERT感染Ketr-3细胞后,在第3、5、7天细胞存活率分别为(92.3±1.2)%、(82.0±1.0)%和(72.0±1.0)%,与对照组比较差异有统计学意义(P《0.05);RT-PCR结果表明:病毒Ad-hTERT感染Ketr-3细胞3d后,hTERT mRNA表达是对照组的(50.5±1.7)%,差异有统计学意义(P《0.01);免疫组织化学结果表明:Ad-hTERT处理组的hTERT抗原表达较对照组显著减少.结论 转录hTERT基因siR-NA的重组腺病毒载体为肾癌基因治疗提供了新的工具.     

Caspase-12短发夹状RNA在内质网应激性凋亡中的作用

目的构建凋亡因子Caspase-12的短发夹状RNA（siRNA），观察其在体外对鼠粒单系白血病细胞WEHI-3细胞对凋亡的抵抗作用。方法设计并合成一对针对Caspase-12编码基因的siRNA，构建表达此siRNA的重组质粒psiRNA-Caspase-12，转染入WEHI-3细胞。检测胞内Caspase-12的mRNA和蛋白的表达。并检测转染后WEHI-3细胞的抗凋亡能力。结果酶切分析和测序证实构建成功，siRNA对Caspase-12的表达均有明显的抑制作用。染后WEHI-3细胞的抗凋亡能力增加。结论构建的重组质粒能有效抑制Caspase-12基因在白血病细胞株WEHI-3中的表达。并对内质网应激性凋亡具有抵抗能力。     

白介素-1受体拮抗剂对大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋亡和caspase-3表达的影响

目的：观察白介素-1受体拮抗剂（IL—1Ra）对脊髓损伤（SCI）后继发性神经细胞凋亡和caspase-3表达的影响。方法：60只SD大鼠，随机分为假手术组、脊髓损伤组、IL-1Ra治疗组和生理盐水对照组，每组15只。采用Allen’s法建立大鼠急性SCI动物模型．IL—1Ra治疗组和生理盐水对照组于SCI后立即硬膜下腔内分别注射IL-1Ra（10μg／10μl）和等量生理盐水，于伤后24h以损伤为中心（假手术组取相应部位），切取长约8mm脊髓组织．用蛋白印迹法和免疫组化染色法检测caspase-3表达的变化：采用实时定量PCR法检测caspase-3mRNA的表达情况；用原位末端标记法（TUNEL）检测SCI后神经细胞凋亡情况。结果：SCI后24h，SCI组与假手术组比较受损伤的脊髓组织中caspase-3mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P〈O．05），且TUNEL阳性细胞明显增多（P〈O．01）：IL—1Ra治疗组大鼠受损伤节段脊髓组织caspase-3表达及TUNEL阳性细胞数较生理盐水对照组）均明显减少（P〈O．01）。结论：IL-1Ra治疗可减少急性SCI后脊髓组织中caspase-3的表达和神经细胞凋亡的发生。     

携带超抗原SEA基因的特异性溶瘤腺病毒载体的构建和鉴定

目的 构建携带超抗原SEA基因的肿瘤特异性溶瘤腺病毒表达载体.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中获得SEA全长基因序列,酶切后克隆入pCA13质粒,构建重组病毒质粒pCA13-SEA.将鉴定正确的pCA13-SEA与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3通过Lipofectamine 2000共转染HEK293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-SEA.Ad-SEA在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化、测定其滴度.结果 克隆得到771bpSEA全长基因.经PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,SEA基因成功克隆到溶瘤腺病毒载体中,可实现SEA基因的表达,且病毒滴度达6.5×109pfu/ml.结论 成功构建表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体.     

靶向Pik3cb shRNA表达载体的构建及其对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的构建大鼠Pik3cb shRNA真核表达载体，并检测其下调大鼠血管平滑肌细胞Pik3cb mRNA表达的效应。方法根据Genbank中大鼠Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-1，酶切鉴定和测序无误后分别命名为pU6-Pik3cb—shRNA．1和pU6-Pik3cb—shRNA-2。通过脂质体转染大鼠胸主动脉平滑肌细胞，确定转染效率；通过荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测Pik3cb mRNA的表达；TUNEL法检测细胞凋亡。结果pU6-Pik3cb—shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2经测序和PCR扩增与原序列相同，转染大鼠平滑肌细胞48h时转染率为15．7％，荧光定量PCR结果显示转染组Pik3cb mRNA表达明显减少，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05），错配质粒组与对照组比较Pil（3cb mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05）。TUNEL结果显示转染组凋亡细胞明显增加，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论成功构建重组真核表达质粒pU6-Pik3cb—shRNA，并有效下调大鼠胸主动脉平滑肌细胞Pik3cb mRNA的表达，为靶向Pik3cb防治移植血管再狭窄的基因治疗奠定了基础。     

靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ基因siRNA腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建、鉴定靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPAR-γ)基因的siRNA腺病毒载体.方法 遵循siRNA片段的设计原则,依据GenBank中PPARγ基因(AF013266)的序列,设计3个特异性靶序列(36～54位、73～91位和404～422位);体外合成对应发卡样DNA片段,经退火后,将其克入pSIREN-Shuttle载体,通过PCR和I-Ceu I和PI-Sce I酶切鉴定后,再亚克隆入pAdeno-X腺病毒载体.对插入序列进行DNA序列分析.结果 发卡样siRNA单链DNA寡核苷酸退火后,电泳可见明亮靶条带;PCR扩增和酶切鉴定得到阳性克隆pSIREN-Shuttle-siPPARγ-1、pSIREN-Shuttle-siPPARγ-2和pSIREN-Shuttle-siPPARγ-3.亚克隆重组腺病毒载体pAdeno-X siPPARγ1、pAdeno-X-siPPART-2和pAdeno-X-siPPARγ-3,经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致.结论 成功构建3个靶向PPARγ基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步的基因治疗研究奠定了实验基础.     

Rapid subcellular redistribution of Bax precedes caspase-3 and endonuclease activation during excitotoxic neuronal apoptosis in rat brain

Neuronal apoptosis is induced prominently in the newborn rodent brain by glutamate receptor excitotoxicity and related insults, including trauma and hypoxia-ischemia. However, the molecular mechanisms of this neurodegeneration are unclear. We tested the hypothesis that changes in the subcellular distribution of the proapoptotic protein Bax precede the activation of downstream apoptosis-effector mechanisms such as caspase-3 cleavage and endonuclease activation during the progression of excitotoxic neuronal apoptosis in the striatum of newborn rat. Kainic acid (4 nmol) was injected into striatum of anesthetized 7-day-old rats, and the animals were killed at 2, 6, 12, and 24 h postinsult. Controls were age-matched, vehicle-injected, or naive rats. Counts of ultrastructurally confirmed striatal neuron apoptosis in brain sections were highest at 24 h. Striatal tissue was microdissected and fractionated into cytosolic, mitochondrial-, and nuclear-enriched compartments. Immunoblots showed that Bax translocates from the cytosol fraction to the mitochondrial fraction, with maximal translocation by 2 h in the absence of changes in mitochondrial accumulation. Cleaved caspase-3 levels increase progressively in both cytosolic and mitochondrial fractions between 6 and 24 h. Cleaved caspase-3 accumulates in apoptotic striatal neurons as shown by immunolocalization. Internucleosomal fragmentation of DNA coincides with caspase-3 cleavage. We conclude that rapid translocation of Bax to mitochondria precedes caspase-3 and endonuclease activation during excitotoxic neuronal apoptosis in newborn rat brain and that initiation of this death cascade occurs within 2 h after glutamate receptor activation.     

表达白细胞介素18的条件增殖腺病毒的构建

目的 构建表达白细胞介素(IL)-18的条件增殖腺病毒.方法 以质粒pJW-IL18为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增获得全长IL-18基因并改变其包含的酶切位点Bgl Ⅱ.将IL-18克隆至pCA13质粒,构建重组质粒pCA13-IL18.用Bgl Ⅱ从pCA13-IL18酶切出包含CMV启动子的IL-18表达框,并克隆进条件增殖腺病毒质粒pZD55,构建重组质粒pZD55-IL18.将pZD55-IL18与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染293细胞,9～12 d后出现病毒空斑.提取重组腺病毒的DNA,PCR鉴定正确者即为条件增殖腺病毒ZD55-IL18.大量扩增,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度.结果 成功构建了表达IL-18的条件增殖腺病毒.结论 成功构建的ZD55-IL18为肿瘤靶向治疗奠定基础.     

PLK1基因siRNA的构建及对甲状腺未分化癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 构建保罗样激酶-1(PLK1)基因小干扰RNA(siRNA),并观察其对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 设计合成5个PLK1 siRNA(S1、S2、S3、S4、S5),转染人甲状腺癌ARO细胞后,采用实时定量RT-PCR方法筛选下调PLK1 mRNA效果最好的siRNA;然后以该siRNA转染ARO细胞后,分别以实时定量RT-PCR和Western blot检测各组细胞PLK1基因表达情况;以MTT法检测对各组细胞增殖的影响;分别以caspase-3活性和TUNEL方法明确甲状腺癌细胞凋亡情况.结果 5个siRNA均明显下调PLK1 mRNA水平,以S4效果最好,抑制率达91.5%.MTr结果显示,S4 siRNA转染对甲状腺癌细胞增殖均有明显的抑制作用,且呈浓度和时间依赖性(P<0.05).与对照组比较,S4 siRNA转染组癌细胞caspase-3活性明显升高,且呈浓度和时间依赖性(r=0.919;r=0.957);TUNEL结果显示,S4 siRNA转染组出现明显的凋亡现象,且呈浓度依赖性(r=0.932).结论 PLK1基因在甲状腺未分化癌细胞增殖中具有重要的调控作用.PLK1 siRNA转染可明显抑制癌细胞增殖,诱导凋亡是其重要机制之一.