实时荧光定量聚合酶链反应检测沙门菌（A～F群）方法的建立和应用

目的 建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测沙门菌,评价其优越性.方法 根据沙门菌保守的HilA基因序列合成引物和探针,建立快速检测沙门菌的实时荧光定量PCR.结果 所建立的实时荧光定量PCR具有简便、快速、敏感性高、特异性强、抗干扰性好和可重复性强等特点,与实际应用检测结果相符.结论 建立的实时荧光定量PCR可用于口岸食品和公共场所从业人员的沙门菌检测.     

鲍曼不动杆菌耐药性快速检测方法的建立与评估

目的评估对实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)快速检测鲍曼不动杆菌耐药性方法的效果。方法设计鲍曼不动杆菌(ATCC 19606)外膜蛋白A特异性探针,采用实时荧光定量PCR准确测定63株鲍曼不动杆菌经一定浓度庆大霉素、米诺环素、美罗培南、左氧氟沙星和头孢哌酮/舒巴坦孵育后的生长情况,比较抗菌药物孵育0和6h后鲍曼不动杆菌基因组DNA量,判断鲍曼不动杆菌耐药性,并与微量肉汤稀释法结果进行对比。结果建立的实时荧光定量PCR检测鲍曼不动杆菌耐药性方法与微量肉汤稀释法一致性高,Kappa值为0.879,P0.05。以微量肉汤稀释法为参考方法,实时荧光定量PCR的符合率达93.97%,灵敏度为92.53%,特异性为95.74%,阳性预测值为96.41%,阴性预测值为91.22%,Youden指数为0.88。结论实时荧光定量PCR与微量肉汤稀释法结果有高度一致性,且前者灵敏度高、特异性强、检测速度快,可用于快速检测鲍曼不动杆菌的耐药性。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测沙门菌(A～F群)方法的建立和应用

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测沙门菌,评价其优越性。方法根据沙门菌保守的H ilA基因序列合成引物和探针,建立快速检测沙门菌的实时荧光定量PCR。结果所建立的实时荧光定量PCR具有简便、快速、敏感性高、特异性强、抗干扰性好和可重复性强等特点,与实际应用检测结果相符。结论建立的实时荧光定量PCR可用于口岸食品和公共场所从业人员的沙门菌检测。     

实时荧光定量PCR快速检测百日咳鲍特菌方法学建立及评价

目的 建立实时荧光定量PCR检测百日咳鲍特菌的方法。 方法 以百日咳鲍特菌的重复插入序列IS481为目的基因,设计探针和引物, 以克隆的IS481基因片段为DNA模板,在荧光定量PCR仪上建立实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,并进行灵敏度、重复性、特异性实验。 结果 建立的定量标准曲线阈值循环数（Ct）与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.998);最低检测浓度为10^{2 copies/μl;批内及批间变异系数均小于4%;对临床其他常见呼吸道病原体不出现特异性扩增曲线。 结论 实时荧光定量PCR法检测IS481基因可用于百日咳鲍特菌的快速检测,具有较好的灵敏度、特异性及重复性。}     

浙江省衢州市应用聚合酶链反应检测钩端螺旋体效果评价

目的 建立聚合酶链反应(PCR)检测钩端螺旋体的快速方法,应用于宿主动物钩端螺旋体的快速检测,同时比较PCR方法和常规检测的效果.方法 根据中国疾病预防控制中心提供的引物,以致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、溶藻弧菌、沙门菌、霍乱弧菌、痢疾志贺菌、非O1、O139霍乱弧菌、副溶血性弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7为对照,建立PCR检测钩端螺旋体的快速方法,用于钩端螺旋体的快速检测.结果 衢州市2006年分离钩体菌株进行PCR鉴定结果与血清学鉴定结果相符.100只鼠和100只蛙肝、脾、肾标本进行PCR检测,PCR检测阳性率10%,钩体菌株培养分离率仅为1%,二者差异有统计学意义(2=16.05,P0.005).结论 PCR检测钩端螺旋体灵敏度高、特异性强,可用于钩端螺旋体的快速检测.     

Taqman-探针荧光定量PCR鉴定溶藻弧菌方法的建立

目的建立一种基于DNA回旋酶B亚单位基因(gyrB)基因的Taqman-探针荧光定量聚合酶链式反应(PCR)鉴定溶藻弧菌的方法。方法以溶藻弧菌标准株(ATCC)和溶藻弧菌野生株(WT)为研究对象,通过软件设计溶藻弧菌gyrB基因的特异性PCR引物及Taqman-探针,采用荧光定量PCR仪进行检测,评价该检测方法的特异性和灵敏度。结果 Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对溶藻弧菌gyrB基因的检测灵敏度为10~(-3)mg/L;在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌6种其他常见致病菌时未出现阳性扩增,特异性均为100%。结论成功建立Taqman-探针荧光定量PCR是一种特异性、灵敏度均较好的鉴定溶藻弧菌的方法,该方法适用于溶藻弧菌的快速检测,具有应用价值。     

海洋创伤弧菌LAMP快速诊断方法的建立与评价

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术,建立海洋创伤弧菌快速、简便、特异且敏感的检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评价。方法选取海洋创伤弧菌溶细胞素(vvhA)基因作为靶基因,根据GenBank公布的序列设计4条LAMP引物;对47株细菌(包括20株弧菌属细菌)进行LAMP和聚合酶链式反应(PCR)扩增,并做特异性比较;对创伤弧菌M06株增菌液10倍倍比稀释,提取DNA后进行灵敏度的检测,并与常规PCR作比较;构建含vvhA基因片段的重组质粒,作为LAMP反应体系的标准阳性对照。结果常规PCR实验出现假阳性结果,而LAMP实验只有海洋创伤弧菌出现阳性扩增,其他样品均为阴性,无假阳性和假阴性结果,表明引物的特异性较好,加入钙黄绿素和电泳结果相一致;针对vvhA基因建立的LAMP技术其最低检测下限为每个反应4×10CFU,是常规PCR(每个反应4×10~2 CFU)的10倍,呈现较好的灵敏度。重复实验过程两遍,PCR和LAMP技术检测结果稳定。结论建立了一种用于检测海洋创伤弧菌的LAMP检测方法,该方法特异性强,灵敏度高,方便快捷,特别适合用于现场和床旁的快速检测。     

志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光聚合酶链反应快速检测方法的应用研究

目的建立志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术,为从患者、食品和环境中快速分离和鉴定志贺菌提供技术支撑。方法根据志贺菌ipaH基因序列设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针;通过对PCR扩增体系和反应条件的优化,建立志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法;用添加已知志贺菌浓度的样本验证方法敏感性;用志贺菌标准菌株、分离株以及大肠埃希菌、沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性。结果用本研究建立的志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法检测志贺菌,其Ct值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系（Y=-3.93×log（X）＋37.34,R=0.999）,最低检测浓度为30cfu/ml,3株志贺菌标准株,30株志贺菌分离株检测结果均为阳性;而沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等91株其他细菌的Ct值均〉35或扩增曲线成一平滑直线。与常规分离鉴定方法比较差异无统计学意义（P〉0.05,χ^2=0.27）。对于纯菌和食品样品整个检测过程仅需2h和10h。结论志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术具有特异性强,敏感性高,易操作等优点,有很好的应用前景和研究价值。     

金黄色葡萄球菌肠毒素快速分型体系的建立及应用

目的 建立SYBR-Green荧光PCR体系金黄色葡萄球菌肠毒素快速分型体系,应用于金黄色葡萄球菌食物中毒和食品风险监测快速诊断.方法 根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E基因的保守序列设计特异性引物,分别建立SYBR-Green荧光PCR体系.应用该系列体系检测185株金黄色葡萄球菌野生株的肠毒素基因A～E型.结果 建立的SYBR-Green荧光PCR系列体系其DNA灵敏度为1.34～2.80 ng/μL,菌液灵敏度为46～96 CFU/mL;用以检测185株金黄色葡萄球菌的肠毒素基因A～E型,携带一种基因型的为58.38%,同时携带两种以上毒素基因占4.86%.结论 建立的荧光PCR反应体系快速、灵敏度高、特异性强,能应用于金黄色葡萄球菌肠毒素基因的准确分型,对食物中毒诊断和食品风险监测很有意义.     

TaqMan实时荧光定量PCR检测艰难梭菌

目的 建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于艰难梭菌的快速检测;评价基于纯培养艰难梭菌和粪便中艰难梭菌的2种标准曲线;并应用该荧光定量PCR法对急性艰难梭菌感染（CDI）的小鼠进行粪便含菌量检测评价。方法 针对艰难梭菌基因组中16S rRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套快速检测艰难梭菌含量的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、灵敏性;绘制艰难梭菌纯菌浓度梯度稀释标准曲线和粪便中同浓度梯度艰难梭菌的标准曲线,比较两者的差异;用艰难梭菌高毒株NAP1/027感染用抗生素处理的C57BL/6小鼠,建立CDI小鼠模型,同时应用该荧光定量PCR和活菌培养法定量检测小鼠粪便中的艰难梭菌含量变化。结果 建立的TaqMan实时荧光定量PCR具有较高的灵敏性和特异性,生成标准曲线的相关系数为0.999 8,斜率为-3.400 4;用纯培养艰难梭菌和粪便中艰难梭菌分别制备标准曲线,结果表明2种标准曲线定量检测结果差异无统计学意义。建立CDI小鼠模型,应用该荧光PCR能有效、准确的检测出粪便中艰难梭菌的含量,可替代费时费力的活菌培养计数法。结论 用纯培养艰难梭菌来制备标准曲线不影响对含菌粪便标本的准确定量检测,荧光定量PCR能准确快捷地检测CDI小鼠粪便中的艰难梭菌含量,比活菌计数更快速和方便,可用于艰难梭菌感染小鼠模型中小鼠肠道内艰难梭菌定植的定量检测。     

环介导等温扩增技术快速检测副溶血性弧菌

目的建立一种检测副溶血性弧菌（Vp）快速且特异的环介导等温扩增（LAMP）检测方法。方法针对副溶血性弧菌不耐热溶血素（tlh）基因特异性序列的6个位点设计4条LAMP引物,65℃保温约60min,完成对副溶血性弧菌的扩增,扩增产物经肉眼、SYBR Green Ⅰ染色、电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测1株副溶血性弧菌和12株非副溶血性弧菌来验证LAMP方法的特异性;将副溶血性弧菌菌液作一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测,比较两者敏感性。结果1株副溶血性弧菌出现LAMP扩增反应：通过肉眼、SYBR Green Ⅰ染色和电泳均能观察到LAMP扩增产物的出现,酶切证实了LAMP产物的特异性;12株非副溶血性弧菌未出现LAMP扩增。LAMP检测tlh基因的特异性和敏感性与普通PCR相同,LAMP检测tlh基因的检测下限为15cfu／mL。结论建立了一种快速、敏感、特异的副溶血性弧菌检测方法,适合日常监测及快速检测的需要。     

两种核酸检测法在副溶血性弧菌耐热直接溶血素和不耐热溶血毒素中的应用评估

目的 比较CPA-核酸试纸条法与荧光定量PCR法检测副溶血性弧菌（VP）的tlh种特异性基因和tdh毒力基因的灵敏度与特异性。方法 采用CPA-核酸试纸条法和荧光定量PCR法同时对655株不同来源的VP菌株进行tlh、tdh基因检测。结果 CPA-核酸试纸条法与荧光定量PCR法检测结果相同,VP菌株的tlh基因检测阳性率均为100%（655/655）。两种方法对tdh基因的检测结果也完全一致,tdh基因临床株与海产品株阳性检测率均分别为95.8%（207/216）与2.27%（10/439）。CPA-核酸试纸条法对tlh、tdh基因检测具有高度特异性,灵敏度可达6.2103 cfu/ml菌液,从核酸制备至完成检测最快仅需1 h。结论 VP临床株与涉水产品分离株普遍携带tlh种特异性基因,而tdh毒力基因主要存在于临床标本而在涉水产品株极少存在,可采用敏感、特异的CPA-核酸试纸条法,做VP腹泻患者的床边诊断以及食物中毒事故现场的快速检测。     

一起引起食物中毒的非O1群霍乱弧菌实验室鉴定

目的 查明引发浙江省宁波市某服饰公司食物中毒事件的病原菌.方法 对采集到可疑食品和肛拭等标本参照GB/T4789-2003标准进行细菌的分离、鉴定及血清学分型;参照霍乱防治手册检测菌株的CT毒力基因.结果 6份患者大便标本与14份轻微腹泻患者或腹部不适者大便标本中检出非O1群霍乱弧菌O29血清型9株,其中腹泻患者标本检出6株,轻微腹泻患者中检出3株,检出率为45.0%.未检出志贺菌、副溶血性弧菌、致病性大肠杆菌、O1群和O139霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌,剩余食物未检出志贺菌、副溶血性弧菌、致病性大肠杆菌、O1群和O139霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌.结论 此次食物中毒为非O1群霍乱弧菌O29血清型所致.     

甲鱼及养殖水中5株带毒力基因O1群霍乱弧菌的分离与鉴定

目的监测杭州市江干区水产品中O1群和O139群霍乱弧菌并对分离菌株进行病原学鉴定及分子分型。方法按《霍乱防治手册》第5版对51份样品进行霍乱弧菌分离与鉴定。运用改良Kirby-Bauer纸片法和PCR检测5株霍乱弧菌对14种临床常用抗生素的敏感性及是否携带ctxA和tcpA毒力基因,并用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子分型。结果从51份样品中检出O1群霍乱弧菌5株,其中小川型4株,稻叶型1株。5株霍乱弧菌的ctxA和tcpA毒力基因结果均为阳性。5株菌株对11种抗生素敏感,对红霉素和利福平中介,稻叶型菌株对氨苄西林敏感,小川型菌株对其耐药。PFGE分为两型,两型间仅有一条带的差异。结论本次分离的5株O1群霍乱弧菌均携带ctxA和tcpA毒力基因,故有必要加强对水产品尤其是甲鱼的监测及管理。     

血清凝集、基因测序联合检测群霍乱弧菌的应用

目的 避免霍乱弧菌检测假阳性,提高检测正确率。方法 随机选取2013年1～7月,全国各省市CDC送往中国CDC霍乱初筛阳性菌株14株; 用LB营养琼脂培养12 h,挑取单菌落进行霍乱弧菌血清凝集,同时水煮模板法提取菌株的DNA。针对弧菌属16SrDNA序列设计引物,进行弧菌16SrDNA PCR检测,电泳观察16SrDNA产物,将16SrDNA阳性产物送测序公司测序,测序结果在NCBI网站上进行Blast比对,分析比较血清凝集和Blast比对结果。结果 共选取14株菌进行实验,血清凝集阳性12株,2株未凝。经弧菌16SrDNA扩增,电泳观察14株菌均扩增出相应的片段,说明所选菌株均为弧菌属。将14株菌的16SrDNA阳性产物测序,并将测序结果进行Blast比对:2株血清未凝集菌均是哈维氏弧菌; 12株血清凝集阳性的菌中,1株是需钠弧菌,其余11株是霍乱弧菌。结论 血清凝集和基因测序联合检测群霍乱弧菌,可避免霍乱弧菌检测假阳性,提高检测正确率。     

丹东市散发霍乱病例病原学特征及与水体和海(水)产品霍乱弧菌污染间的关系

目的 探讨丹东市2004-2005年散发霍乱病例病原学特征以及与水体和海(水)产品检出霍乱弧菌的关系.方法 采用血清学和分子生物学相结合的方法,研究不同血清型、噬菌体-生物型霍乱弧菌生化特性、分子分型、聚类分析以及肠毒素基因携带情况.结果 所有噬菌体-生物型为流行株(1b、1d)的霍乱弧菌均为产毒株,肠毒素基因携带率100%,非流行株均不携带赐毒素基因;PFGE分子分型及聚类分析表明病患分离株与水体及海(水)产品分离株之间存在高度遗传相关性.结论 丹东地区霍乱弧菌致病力较强,水体及海(水)产品霍乱弧菌污染是导致霍乱发病的关键,且已形成污染-感染的恶性循环.不良卫生习惯和饮食习惯以及忽视就诊,加剧了这一循环,也在很大程度上为霍乱防制和治疗带来了困难.     

副溶血弧菌的致病性及检测方法

副溶血弧菌是沿海地区的一种嗜盐性细菌,其生长快,繁殖速度高,常通过感染多种海产品而引发人的食物中毒发生,近年来,由副溶血弧菌引起的食源性疾病日益增多,到目前为止,O3：K6型副溶血弧菌菌株已引起了亚洲、欧洲、美洲、非洲等多个国家的大流行。随着由副溶血弧菌引起疾病的规模不断增加和频发,人们对其也更加关注,各种检测方法逐渐取代传统的生化鉴定实验,尤其是在食品微生物检测、流行病学调查以及医院感染监控等方面发挥越来越重要的作用。本文就副溶血弧菌的基础特性。致病性及目前的检测方法作一综述。     

2010-2012年北京市丰台区感染性腹泻病原菌分布及耐药性分析

目的 了解北京市丰台区感染性腹泻致病菌的病原构成、流行特征及病原菌耐药情况,监测病原谱变迁趋势,为本地区细菌性腹泻防治提供依据。 方法 收集2010-2012年4-10月丰台区4家哨点医院肠道门诊腹泻患者的粪便标本,按照中华人民共和国卫生行业标准WS 287-2008、WS 271-2007和WS 289-2008进行沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、致泻性大肠埃希菌等常见肠道致病菌检测,并对病原菌的时间分布、人群分布、血清型别构成进行统计学分析,按美国CLSI(临床实验室标准化协会)推荐的纸片扩散法对近期分离的140株致病菌做了药敏测定。 结果 从收集到的1108份标本中共分离到357株致病菌,阳性率为32.22%。阳性菌中居首位的是副溶血性弧菌,占50.98%,其次为沙门菌,占18.49%。病原菌的检出具有明显的季节性,7－9月是高峰。不同年龄组之间检出率的差异有统计学意义(PP结论 丰台区细菌性腹泻病原菌主要以副溶血性弧菌和沙门菌为主,病原谱已发生变迁,各种病原菌耐药性不同,应加强主动监测。     

636例血标本的病原菌种类分布与耐药性研究

目的 了解本院血培养分离到的病原菌菌种及对抗生素的耐药性.方法 利用Bact/Alert3D全自动血培养仪及其配套的血培养瓶对636份标本进行血培养,阳性血培养转种后用MicroScan A/s-4细菌鉴定及药敏测试仪进行测试.结果 636份血培养标本中,检出病原菌65株(10.22%),革兰阳性球菌占40%,革兰阴性杆菌占55.4%,真菌占4.6%,葡萄球菌属和肠杆菌科的细菌是本院菌血症和(或)败血症的主要病原菌.革兰阳性球菌中未发现对万古霉素耐药的菌株,革兰阴性杆菌对亚胺培南有高度敏感性,但对常用抗生素有较普遍的耐药性.结论 血培养检出菌种复杂,耐药率高,应加强血培养中致病菌及其对抗生素的耐药性监测.