乙肝病毒X蛋白结合蛋白(HBXIP)在肝癌中的表达及定位

目的:研究乙肝病毒X蛋白结合蛋白(HBXIP)在人肝癌细胞中的表达和定位.方法:蛋白印迹法检测HBXIP在人肝癌细胞系中蛋白和基因的表达,激光共聚焦扫描显微镜检测内源HBXIP在BEL7402、HepG2肝癌细胞中的定位.结果:HBXIP在人肝肿瘤细胞系中蛋白和基因表达水平增高,激光共聚焦扫描显微镜观察发现HBXIP主要定位于BEL7402、HepG2细胞核中.结论:HBXIP在人肝癌细胞系中高表达,主要定位于肝癌细胞核内,可能是人肝癌重要的调节因子.     

p57kip2蛋白在乳腺癌组织和细胞系中的表达和定位

目的：研究p57kip2在人乳腺癌组织和细胞系中的表达和定位.方法：免疫印迹法检测人乳腺肿瘤细胞系中p57kip2的表达.人乳腺肿瘤组织进行免疫组化染色,检测p57kip2在组织中的表达.激光共聚焦扫描显微镜检测内源p57kip2在MCF-7细胞中的定位.结果：p57kip2在乳腺癌细胞系内表达,免疫组化染色分析和激光共聚焦扫描显微镜证实p57kip2主要定位于细胞核内.结论：p57kip2在乳腺癌细胞内表达,p57kip2主要定位于乳腺癌组织细胞核内,可能是参与肿瘤细胞基因转录调控和蛋白表达的重要蛋白之一.     

p21活化激酶4在乳腺癌细胞中的表达及定位

目的:研究p21激活激酶4（PAK4）在人乳腺癌细胞和组织中的表达和定位。方法:蛋白印迹法检测PAK4在人乳腺癌细胞系中蛋白和基因的表达,激光共聚焦扫描显微镜检测内源PAK4在MCF-7乳腺癌细胞中的定位。结果:PAK4在人乳腺肿瘤细胞系中蛋白和基因表达水平增高,激光共聚焦扫描显微镜观察发现PAK4主要定位于MCF-7细胞质中。结论:PAK4在人乳腺癌细胞系中高表达,主要定位于乳腺癌组织细胞质内,可能是人乳腺癌重要的调节因子。     

白杨黄素对人胃癌细胞SGC7901的放疗增敏作用及其相关机制研究

目的:探讨白杨黄素对人胃癌SGC7901细胞增殖的放射增敏作用及其相关机制.方法:应用克隆形成实验分别检测不同浓度白杨黄素及60Co γ射线联合应用对人胃癌细胞系SGC7901细胞生存率的影响;应用吖啶橙(AO)/溴化乙碇(EB)荧光染色和TUNEL法分别检测白杨黄素与60Co γ射线联合应用后对人胃癌细胞系SGC7901细胞凋亡的影响;应用Westen-blot检测与细胞凋亡调控相关的蛋白Caspase-3、Survivin和Bcl-2的表达情况.结果:白杨黄素能够明显增强60Co γ射线对人胃癌SGC7901细胞克隆集落形成的抑制作用;增强60Co γ射线导致的人胃癌SGC7901细胞的凋亡;白杨黄素能够上调60Co γ射线处理过后人胃癌SGC7901细胞内活性Caspase的表达,下调细胞内凋亡抑制蛋白Survivin和Bcl-2的表达.结论:对于胃癌细胞系SGC7901,白杨黄素可以作为一种有效的放射增敏剂.     

Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中的克隆及表达

目的:在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中对Ro60进行克隆,对Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR和药敏胃癌细胞系SGC7901中的表达情况进行比较分析。方法:应用RT-PCR法克隆Ro60的编码基因,通过DNA序列测定对所克隆的基因进行验证。应用半定量RT-PCR法检测Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR和药敏胃癌细胞系SGC7901中的表达情况。结果:在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中,成功克隆了Ro60的编码基因,其DNA序列与Ro60的cDNA序列完全一致。半定量RT-PCR结果显示,Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中的表达强度显著高于药敏胃癌细胞系SGC7901细胞中的表达强度,P<0.01。结论:Ro60在耐药胃癌细胞系中高表达,该分子可能是一种胃癌多药耐药相关分子。     

下调RPL23对胃癌耐药细胞SGC7901/ADR药物敏感性的影响

目的:检测人胃癌细胞系SGC7901及其阿霉素（ADR）耐药细胞系SGC7901/ADR中RPL23的表达差异,探讨胃癌细胞中RPL23表达对ADR耐药的影响。方法:qPCR检测RPL23在SGC7901/ADR与SGC7901两种细胞系中的表达差异;MTT法检测下调RPL23后SGC7901/ADR细胞对ADR的敏感性;流式细胞仪检测下调RPL23后对细胞凋亡的影响;Western Blot检测凋亡相关分子Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达。结果:qPCR结果显示,RPL23在 SGC7901/ADR细胞系中的表达高于其在SGC7901细胞系中的表达(P＜0.001)。MTT法结果显示,下调RPL23后,在SGC7901/ADR细胞系中ADR的IC50明显升高(P＜0.001)。凋亡检测结果显示,下调RPL23后,SGC7901/ADR细胞凋亡率明显增加(P＜0.001)。Western Blot结果显示,下调RPL23后,细胞中Caspase-3表达明显升高,Bcl-2表达明显降低。结论:RPL23在SGC7901/ADR中的表达高于SGC7901细胞,下调RPL23表达可提高其对ADR的敏感性并促进细胞凋亡,提示RPL23可能通过作用于Bcl-2调节细胞凋亡。     

胃癌耐药细胞EXOs的提取鉴定及可能存在的耐药信息传递作用的初步探讨

目的:探讨胃癌耐药细胞（SGC7901/Adr）分泌的外泌体（exosomes,EXOs）在细胞间可能存在的耐药信息传递作用。方法:选用胃癌亲本细胞SGC7901及其阿霉素耐药细胞SGC7901/Adr为模型,用PEG方法提取EXOs;透射电子显微镜观察鉴定细胞EXOs形态;Western Blot检测CD9、CD63、TSG101、Calreticulin以及P-糖蛋白（P-gp）的表达;运用激光共聚焦显微镜观察胃癌SGC7901和SGC7901/Adr细胞及加入阿霉素耐药细胞SGC7901/Adr外泌体处理后的敏感细胞内阿霉素药物浓度变化。结果:透射电子显微镜下观察到,胃癌SGC7901和SGC7901/Adr细胞来源的EXOs为直径在30~100 nm之间的囊性小泡,呈圆形或椭圆形,大小均匀一致。Western Blot检测胃癌SGC7901和SGC7901/Adr细胞来源的EXOs,携带有外泌体生物标记分子CD9（四次跨膜分子）、CD63（四次跨膜分子）以及TSG101表达,Calreticulin为阴性表达。进一步检测发现在SGC7901/Adr细胞来源的EXOs中存在P-gp蛋白表达。经过阿霉素耐药细胞SGC7901/Adr外泌体处理后的敏感细胞,胞内可见阿霉素聚集减少,核区分布减少,荧光强度减弱。结论:胃癌耐药细胞分泌的EXOs可能通过传递P-gp蛋白的形式,具有传递耐药信息的作用。     

下调PHLDB3对胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR药物敏感性的影响

目的:探讨下调PHLDB3对胃癌耐药细胞系 SGC7901/ADR 药物敏感性的影响。方法:采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹技术（Western blot）的方法检测胃癌及癌旁正常组织中PHLDB3的表达（分别是20对和10对）;qRT-PCR和Western blot检测PHLDB3在胃癌细胞系 SGC7901以及胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达;MTT法检测SGC7901、SGC7901/ADR及转染PHLDB3 siRNA后 SGC7901/ADR的半数抑制浓度（IC50）值;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:qRT-PCR和Western blot结果显示:PHLDB3在胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织（P<0.000 1）;PHLDB3在耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达明显高于其亲本细胞系SGC7901（P<0.000 1和P<0.05）。Western blot结果显示:相对于转染 PHLDB3 negative control（NC）组,转染 PHLDB3 siRNA组的SGC7901/ADR细胞中PHLDB3的表达降低（P<0.005）。MTT结果显示:SGC7901与 SGC7901/ADR的IC50值分别为（1.5±0.1） μg/ml与（5.5±0.2） μg/ml（P<0.000 1）;SGC7901/ADR 转染 PHLDB3 siRNA 后对顺铂的IC50值明显下降（P<0.05）。流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测凋亡,结果显示:下调PHLDB3的表达后,SGC7901/ADR细胞的凋亡率明显增加（P<0.05）。结论:PHLDB3能够促进胃癌细胞系 SGC7901/ADR产生多药耐药。     

下调CACNA2D1对胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR药物敏感性的影响

目的:探讨下调CACNA2D1对胃癌耐药性细胞系SGC7901/ADR耐药的影响。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)的方法检测16对胃癌及癌旁组织以及胃癌细胞系SGC7901和SGC7901/ADR中的CACNA2D1 的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹技术（Western blot）检测CACNA2D1的蛋白表达情况;MTT法检测SGC7901、SGC7901/ADR及转染CACNA2D1 siRNA后SGC7901/ADR的IC50值;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:qRT-PCR结果显示:CACNA2D1在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.01);CACNA2D1在耐药细胞系SGC7901/ADR中的表达明显高于其亲本细胞系SGC7901(P＜0.01)。蛋白免疫印迹技术结果显示相对于转染CACNA2D1 negative control（NC）组,转染CACNA2D1 siRNA组的胃癌细胞CACNA2D1表达降低;MTT结果显示细胞系SGC7901与SGC7901/ADR的阿霉素半数抑制浓度（IC50）分别为（1.3±0.6）μg/ml与（5.5±0.45）μg/ml;SGC7901/ADR转染CACNA2D1 siRNA后对阿霉素的IC50明显下降。流式细胞术检测凋亡结果显示,CACNA2D1的表达下调后,SGC7901/ADR细胞的凋亡比明显增加。 结论:CACNA2D1能够促进胃癌SGC7901/ADR细胞系产生多药耐药。     

Smad4过表达对人胃癌细胞增殖和NF-êB通路的影响

目的:构建pEGFP-C1-Smad4表达载体,观察Smad4过表达对人胃癌SGC7901细胞增殖的影响,探讨其与NF-êB的相关性.方法:构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与Smad4的融合表达载体, 转染人胃癌SGC7901细胞,荧光显微镜观察转染后细胞EGFP的表达,Western blotting检测SGC7901-Smad4细胞中Smad4和NF-kB的表达,电泳迁移率变异分析(electrophoretic mobility shif assay,EMSA)检测过表达Smad4对胃癌SGC7901细胞NF-kB 活化的影响,MTT法检测过表达Smad4对SGC7901细胞增殖的影响.结果:在转染pEGFP-C1-Smad4的人胃癌SGC7901细胞(SGC7901-Smad4)中观察到EGFP的表达;Western blotting检测显示,SGC7901- Smad4细胞中Smad4过表达,并伴随核转录因子NF-êB p65的表达水平下调;EMSA检测显示Smad4过表达可下调NF-êB活化;MTT法显示过表达Smad4显著抑制SGC7901细胞增殖(P<0.05或P<0.01).结论:Smad4过表达显著抑制人胃癌细胞增殖,其机制可能与下调NF-kB信号通路有关.     

USP22截短质粒构建鉴定及其在肝细胞肝癌细胞中的功能初探

目的:构建编码ubiquitin specific peptidase 22(USP22)截短蛋白的表达质粒,探索USP22在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的作用及其分子机制,并初步解析USP22在HCC细胞系中对细胞增殖及索拉菲尼作用的影响。方法:设计合成针对于人源USP22截短质粒序列的引物,通过PCR的方法以含有USP22全长蛋白编码序列的表达载体作为模板,扩增目的片段,再用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切,连接转化后,将构建好的质粒进行酶切鉴定及测序,证明USP22截短质粒构建成功。将构建好的USP22全长及截短表达质粒转染到HCC细胞系HCC-LM3中,分别进行Western blot和confocal实验检测USP22全长及截短质粒在HCC-LM3细胞中的表达及定位。生物学功能方面,利用MTS法检测USP22全长对HCC细胞增殖及索拉菲尼作用的影响。结果:成功构建了USP22截短表达质粒,并在HCC细胞系HCC-LM3中验证了其蛋白表达;USP22全长及所构建的截短质粒编码蛋白在HCC-LM3中定位于细胞核;此外,生物学功能实验证实USP22促进HCC-LM3细胞增殖,并削弱了索拉菲尼对HCC-LM3细胞生长的抑制作用。结论:在HCC-LM3细胞中,USP22及其截短质粒编码蛋白均定位于细胞核;USP22促进HCC细胞增殖,且可能参与在HCC治疗中的索拉菲尼耐受进程。     

Expression of Amphiregulin, a Novel Gene of the Epidermal Growth Factor Family, in Human Gastric Carcinomas

The expression of mRNA for amphiregulin (AR), a novel gene of the epidermal growth factor family, was examined in 8 human gastric carcinoma cell lines and 32 gastric carcinoma tissues as well as corresponding normal mucosa. Of the 8 gastric carcinoma cell lines, 7 expressed 1.4 kb AR mRNA at various levels. The expression of AR mRNA by TMK-1 and MKN-28 cells was increased by treatment with epidermal growth factor or transforming growth factor α. In surgical cases, all the gastric carcinoma tissues and their adjacent normal mucosa expressed AR mRNA. Interestingly, 20 (62.5%) out of 32 tumors expressed AR mRNA at higher levels than their corresponding normal mucosas (tumor/normal ≥1.2). No obvious correlation was observed between the AR mRNA levels and the histological types or tumor staging of gastric carcinoma. Immunohistochemically, AR protein was localized to the cytoplasm and/or nucleus in tumor cells. These results suggest that AR produced by tumor cells may be involved in the pathogenesis and/or progression of human gastric carcinoma.     

小干扰RNA特异性沉默泛素特异肽酶22基因对膀胱癌细胞增殖的抑制作用

目的:研究小RNA干扰泛素特异肽酶22(ubiquitin specific peptidase22,USP22)基因表达对膀胱癌EJ细胞增殖的影响。方法:设计并合成针对USP22基因的3条特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)及阴性siRNA,并同时设立空白对照,然后用脂质体Translipid转染EJ细胞。通过实时荧光定量RT-PCR和Western印迹法分别检测转染前后EJ细胞中USP22mRNA和蛋白表达水平,MTT法和克隆形成实验检测细胞增殖率,FCM法检测细胞周期分布。结果:3条针对USP22基因的特异性siRNA均能抑制USP22mRNA和蛋白的表达,其中USP22-siRNA-1的沉默效率最高。转染USP22-siRNA-148h后,EJ细胞中USP22mRNA和蛋白表达水平分别下调65%和80%,而且细胞增殖明显受到抑制,细胞周期被阻滞于G1期。结论:USP22特异性siRNA能够有效沉默USP22基因表达,并显著抑制膀胱癌EJ细胞增殖。推测USP22基因可能成为治疗膀胱癌的一个新靶点。     

Localization of tumor-associated placental protein in human placental tissue and detection in carcinoma cell lines

Sections of human placental villi tissue and carcinoma cell lines (SMMC-7721, (MGC-803 and Kato-111; were examined using the indirect immunoperoxidase histological technique to further investigate the localization of the tumor-associated placental protein (PP) in human placental tissue and the expression of PP on carcinoma cell lines. PP was prepared from placenta in the first trimester. Placental tissue sections exposed to PP antisera showed a marked staining of the trophoblast cells, especially in syncytiotrophoblast. The strongly stained area was localized to the cell membrane of syncytiotrophoblast. In contrast, the nucleus and the cytoplasm of syncytiotrophoblast were stained weakly. The specific PP antisera also stained the carcinoma cell lines. Among different carcinoma cell lines, the degree of staining of liver carcinoma cell line (SMMC-7721) was higher than that of gastric carcinoma cell lines (MGC-803 and Kato-111). In the carcinoma cell lines the presence of antigen similar to PP suggests that oncogene (one) occur in human trophoblast cells as well as mice trophoblast cells.     

ShRNA-mediated silencing of the ubiquitin-specific protease 22 gene restrained cell progression and affected the Akt pathway in nasopharyngeal carcinoma

Ubiquitin-specific protease 22 (USP22) is closely related with poor prognosis of cancer patients. However, the role of USP22 expression in nasopharyngeal carcinoma (NPC) has not been determined. The main aim of this study was to determine the role of USP22 in the pathologic processes of NPC. Immunohistochemistry (IHC), western blot (WB), and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to measure the expression of USP22 in cell lines and tissues of NPC in comparison with expression in non-cancerous cells and tissues. USP22-specific short hairpin RNA (shRNA) was used to knock down USP22 expression in the NPC cell line CNE-1 and CNE-2. Furthermore, the impact of USP22 in cellular proliferation, growth, and cell cycle were detected respectively. WB was used to determine the role of USP22 in the AKT/GSK-3/Cyclin signaling pathway. The expression levels of USP22 were remarkably higher in NPC cell lines and tissues. With cell counting and the MTS assay, cellular growth and proliferation progression of USP22 knockdown cell line was shown to be effectively restrained. The USP22 silencing both in CNE-1 and CNE-2 cells caused them to accumulate in the G0/G1 phase of the cell cycle. USP22 knockdown was also found to modulate the AKT/GSK-3/Cyclin pathway, resulting in downregulation of p-AKT, p-GSK-3β, and cyclinD1. This study suggests that USP22 plays a critical regulatory role in the pathologic processes of NPC, and that it may be a potential biological treatment target in the future.     

三氧化二砷对肝癌HepG2细胞侵袭转移及USP22蛋白表达的影响

目的:探究不同浓度三氧化二砷(As2O3)对肝癌HepG2细胞侵袭转移能力的影响以及对HepG2细胞中USP22蛋白表达的影响,进一步完善其分子机制。方法:CCK8细胞增殖实验检测不同浓度As2O3在不同时间点对HepG2细胞增殖的影响;细胞划痕和Transwell方法检测HepG2细胞在不同浓度As2O3作用下侵袭转移能力的变化;Western blot检测As2O3作用下HepG2细胞中USP22蛋白的表达水平。结果:随着As2O3浓度和作用时间的增加,HepG2细胞增殖明显受到抑制。与对照组相比,24 h时分别用2、4、8 μmol/L的As2O3处理的HepG2细胞侵袭转移能力降低,细胞中USP22蛋白表达水平明显下降。结论:As2O3可抑制人肝癌HepG2细胞侵袭转移能力,其分子机制可能与下调的USP22蛋白水平相关。