hsa-miR-19a-3p下调靶基因SEMA4C抑制胃癌细胞增殖、侵袭能力

目的:探讨SEMA4C在胃癌中的表达以及hsa-miR-19a-3p下调SEMA4C对胃癌细胞增殖、侵袭能力的影响.方法:收集23例胃癌组织和对应癌旁组织标本,采用免疫组化染色、Real-time PCR方法检测SEMA4C的表达,并分析其与临床资料的相关性;检索Targetscan、Miranda等数据库预测调控SEMA4C基因的microRNA,并利用Real-time PCR、双荧光素酶报告系统检测加以证实;通过脂质体转染使人胃癌细胞系BGC823内过表达hsa-miR-19a-3p,Real-time PCR、Western blot检测SEMA4C的表达,通过细胞集落形成实验和Transwell小室研究BGC823细胞的增殖、侵袭能力的变化.结果:胃癌组织中SEMA4C阳性率87.0%,高于癌旁组织(x2=20.30,P<0.000 1),胃癌组织中SEMA4C mRNA的表达高于癌旁组织(t=13.47,P<0.000 1).SEMA4C的表达与胃癌TNM分期(P=0.036 4)、分化程度(P=0.042 7)、淋巴结转移度(P=0.012 8)有关.生物信息学分析hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-214-5p、hsa-miR-138-5p可能调控SEMA4C表达,胃癌组织中hsa-miR-19a-3p的表达低于癌旁组织(t=8.233,P<0.000 1),hsa-miR-214-5p(t=0.846 3,P=0.097 6)、hsa-miR-138-5p(t=1.345,P=0.185 7)表达与癌旁组织无明显差异,hsa-miR-19a-3p转染后荧光素酶表达下降至0.46±0.12(F=5.685,P=0.003 2).hsa-miR-19a-3p转染后,SEMA4C mRNA(F=34.39,P<0.000 1)、SEMA4C蛋白(F=67.49,P<0.000 1)表达减少,BGC823细胞克隆数目减少(F=20.77,P<0.000 1),Transwell下室细胞数较少(F=16.37,P=0.000 4).结论:SEMA4C在胃癌中过表达并与肿瘤的发生发展有关,hsa-miR-19a-3p通过下调靶基因SEMA4C抑制胃癌细胞增殖、侵袭能力来发挥其抗肿瘤效应.     

缺氧诱导的肝癌靶向性基因治疗载体的构建和检测

目的：构建缺氧诱导的AFP基因启动子（HRE-AFPp）调控的基因表达载体，并检测该调控元件的特异性和对缺氧诱导的反应性。方法：用PCR方法从人类基因组中扩增VEGF基因缺氧反应元件（HRE）和AFP基因启动子（AFPp），将上述片段与含有报告基因（强化绿色荧光蛋白基因）载体pEGFP-1的多克隆位点连接，构建成为缺氧诱导的AFP基因启动予调控的基因表达载体（pEGFP-[HRE]AFPp）。用脂质体法将表达载体转染表达或不表达AFP的细胞系，G418筛选阳性克隆，荧光显微镜观测重组AFPp的活性，并用流式细胞术检测缺氧诱导是否对其有调控作用。结果：成功地将HRE、AFPp克隆到报告基因载体pEGFP-1的多克隆位点，酶切鉴定和DNA序列分析无误，荧光显微镜观测证实EGFP能在AFP阳性肝癌细胞特异性表达，流式细胞术检测证实，16h缺氧诱导能增强EGFP的表达（P〈0．01）。结论：缺氧诱导的AFP顺式作用元件修饰的基因治疗载体，在基因转录水平特异性调控目的基因的表达，为下一步将其作为肝癌基因治疗载体奠定了基础。     

肝细胞性肝癌组织CD133+细胞肿瘤干细胞特性的研究

目的 越来越多的研究表明,肝癌细胞系中能检测到肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)的存在.本研究旨在探讨从肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织样本中分离获得的CD133+细胞是否具有CSCs特性.方法 将2014-02-01-2015-06-30广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科25例手术获得的新鲜HCC组织和对应癌旁组织,采用酶消化法分别消化成单个肝癌细胞和单个肝细胞,利用流式细胞术检测部分单个肝癌细胞和单个肝细胞CD133的表达率.用剩余的单个肝癌细胞进行原代培养,流式细胞术将培养获得的肝癌细胞分选为CD133+和CD133-细胞,通过平板克隆形成实验、肿瘤球形成实验和裸鼠移植瘤形成实验对比分析这两组细胞的CSCs特性.结果 25例HCC组织中CD133的表达率为3.8％～8.3％,平均值为(5.8±1.6)％,而癌旁组织CD133的表达率为0.1％～0.4％,平均值为(0.2±0.1)％,两者比较差异有统计学意义,t=17.12,P＜0.001.CD133+和CD133-细胞的平均克隆率分别为(25.2±0.8)％和(7.6±0.8)％,两者比较差异有统计学意义,t=81.95,P＜0.001.CD133+和CD133-细胞的平均成球率分别为(20.3±0.6)％和(12.5±1.4)％,两者比较差异有统计学意义,t=68.17,P＜0.001.CD133+细胞的裸鼠移植瘤形成能力明显高于CD133-细胞.结论 从HCC组织样本中分离获得的CD133+细胞具有明显的CSCs特性.     

肝癌干细胞研究进展与方向

近年来随着“干细胞”的概念被引入肿瘤学研究,肿瘤干细胞学说逐渐形成。该学说认为,导致肿瘤发生和维持肿瘤生长的是一小群叫做“肿瘤干细胞”的细胞;这些细胞在肿瘤组织中数量极少,具有自我更新、分化及抗治疗能力等干细胞样特性。在过去的数年中,研究者分别通过侧群细胞技术及CD133、CD90、OV6、EpCAM等标志鉴定和分离得到具有很强的体外克隆形成及体内成瘤能力的小群肝癌细胞,为肝癌干细胞的存在提供了有力证据。本文对肿瘤干细胞理论和肝癌干细胞相关研究进展进行了综述,对肝癌干细胞在肝癌诊断和治疗方面的重要性进行了讨论,并对我们面临的有关挑战、机遇和未来的研究方向进行了分析。     

姜黄素对化学诱导大鼠肝癌缺氧模型血管生成的影响

目的:探讨姜黄素对二乙基亚硝胺( diethylnitrosamine, DEN)诱发大鼠肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）缺氧后血管形成的影响。方法: 采用DEN诱发大鼠HCC,结扎肝动脉并构建大鼠HCC缺氧模型。将HCC模型大鼠按照数字表法随机分为单纯碘化油栓塞组（A组）、碘化油联合姜黄素栓塞组（B组）、碘化油联合肝周包膜组（C组）、碘化油联合姜黄素及肝周包膜组（D组）,每组10 只。比较各组大鼠相应治疗后HCC细胞及组织VEGF、微血管密度（microvessel density,MVD）及大鼠中位生存时间（median survival time,MST）。结果：B组与D组的VEGF蛋白表达及MVD均比A组显著降低（P<0.01）,而C组上述指标则与A组无显著变化（P>0.05）。B、C、D组比A组大鼠MST均显著延长（P<0.05）,D组大鼠的MST高于B、C组（P<0.05）。结论：姜黄素可抑制HCC缺氧大鼠肿瘤血管的生成,可降低VEGF表达及MVD,起到延长大鼠生存期的作用。     

姜黄素对缺氧诱导肝癌细胞HepG2上皮细胞间质转分化（EMT）的逆转作用

目的：探讨姜黄素对缺氧诱导下人原发性肝癌细胞HepG2上皮细胞间质转分化的影响和可能机制。方法：将HepG2细胞分为3组：正常对照组、CoCl2组、CoCl2＋姜黄素组。分组干预48小时后,四甲基偶氮唑盐（MTF）法检测细胞增殖能力,相差显微镜观察细胞形态变化,划痕试验检测细胞迁移能力,Real—timeRT—PCR检测HIFl—α mRNA的表达变化,Westernblot检测HIFl-α蛋白,上皮细胞表面标志E—Cadherin和间质细胞表面标志vimentin的变化。结果：分组干预48h,CoCl2组细胞增殖较对照组增高,而CoCl2＋姜黄素组增殖较正常组降低;CoCl2组较正常对照组迁移能力显著增强,CoCl2＋姜黄素组细胞迁移能力与CoCl2组相比明显下降;Real—timeRT—PCR显示3组细胞HIFl—αmRNA的表达无明显差异;但是Westernblot结果发现,相对于正常对照组,CoCl：组HIFl—α蛋白明显上调,CoCl2＋姜黄素组HIFl-d蛋白变化不大;同时,CoCl2组E—cadherin表达水平下降而vimentin表达水平上升,CoCl2＋姜黄素组无明显变化。结论：姜黄素可逆转缺氧诱导的肝癌细胞HepG2增殖和迁移能力增加,可能与其抑制缺氧诱导的HIFl-仅蛋白上调和上皮细胞问质转分化有关。     

紫杉醇诱导肝癌细胞SMMC—7721凋亡的实验研究

目的：研究紫杉醇（Taxol)对肝癌细胞SMMC-7721的生长抑制和诱导凋亡的作用。方法：应用MTT法观察紫杉醇对SMMC-7721的生长抑制作用。通过瑞氏染色，荧光显微镜，透射电镜，流式细胞仪和TUNEL染色研究紫杉醇对SMMC-7721诱导凋亡的作用。结果：紫杉醇对肝癌细胞SMMC-7721有明显的生长抑制作用，其IC50为21.6nmol/L。紫杉醇作用细胞后，可看到较为典型的细胞凋亡的形态学变化。细胞核固缩，染色质凝集成新月型紧贴于核膜周边，核碎裂，染色质片断化，凋亡小体形成等，流式细胞仪上可见S期和G2/M期和DNA含量增加，并出现典型的亚二倍体“凋亡小峰”。TUNEL染色显示。紫杉醇作用于SMMC-7721后，随药物浓度增加和作用时间延长，凋亡指数增加。结论：紫杉醇对SMMC-7721有明显的生长抑制作用；紫杉醇对SMMC-7721有诱导凋亡的作用。     

人肝癌干细胞的富集

目的:从人肝癌细胞株中富集癌干细胞(cancer stem cells,CSCs).方法:将肝癌细胞SMMC-7721接种到裸鼠皮下建立动物模型后,荷瘤鼠随机分成4组,每组5只,每周1次腹腔分别注射环磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)0、2、5和10 mg/kg,在肿瘤直径达1.5 cm时获取肿瘤,得到经不同剂量CTX富集的肝癌细胞.比较这些肝癌细胞的侧群(side population, SP)细胞含量、软琼脂克隆形成率、细胞增殖能力及致瘤能力.结果:SP细胞含量、软琼脂克隆形成率、细胞增殖能力及致瘤能力经比较均显示,经CTX(10 mg/kg)富集的肝癌细胞表现最强,且均随着CTX的剂量增加而增长(P<0.05).结论:利用低剂量化疗药能够富集肝癌干细胞,且富集效率与化疗剂量呈正比.     

紫杉醇诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡的实验研究

目的 :研究紫杉醇 (Taxol)对肝癌细胞SMMC 772 1的生长抑制和诱导凋亡的作用。方法 :应用MTT法观察紫杉醇对SMMC 772 1的生长抑制作用 ,通过瑞氏染色、荧光显微镜、透射电镜 ,流式细胞仪和TUNEL染色研究紫杉醇对SMMC 772 1诱导凋亡的作用。结果 :紫杉醇对肝癌细胞SMMC 772 1有明显的生长抑制作用 ,其IC50 为 2 1.6nmol/L。紫杉醇作用细胞后 ,可看到较为典型的细胞凋亡的形态学变化 ,细胞核固缩、染色质凝集成新月型紧贴于核膜周边 ,核碎裂、染色质片断化、凋亡小体形成等。流式细胞仪上可见S期和G2 /M期和DNA含量增加 ,并出现典型的亚二倍体“凋亡小峰”。TUNEL染色显示。紫杉醇作用于SMMC 772 1后 ,随药物浓度增加和作用时间延长 ,凋亡指数增加。结论 :紫杉醇对SMMC 772 1有明显的生长抑制作用 ;紫杉醇对SMMC 772 1有诱导凋亡的作用。     

肝癌细胞系Huh-7中CD133阳性细胞亚群的分离及其特性的研究

目的:研究CD133在人肝癌细胞系Huh-7中的表达,初步探讨肝癌中CD133阳性细胞亚群的干细胞特性.方法:流式细胞荧光激活分选技术纯化肝癌细胞系Huh-7中CD133肿瘤细胞,体外培养并观察其增殖、体内成瘤及分化能力.结果:流式细胞仪检测肝癌细胞系Huh-7中有62.3%的细胞CD133呈阳性表达,流式细胞荧光激活分选的CD133肿瘤细胞在无血清培养基中第3、5、7d的吸光度(OD值)分别为0.310、0.362、0.564,均高于相同条件下未分选细胞和CD133阴性细胞;CD133阳性细胞亚群成瘤能力明显强于阴性细胞亚群;CD133阳性细胞亚群在培养体系中的比例逐日下降,至培养的第8天,由第1天的92.3%下降至61.4%.结论:肝癌细胞系Huh-7中CD133阳性细胞亚群比其它细胞亚群具有较强增殖、成瘤和分化能力,是具有肝癌干细胞特性的细胞亚群.     

BRD蛋白家族在肝细胞癌中的临床意义

目的：通过检索挖掘多个肿瘤公共数据库中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的相关数据,从转录本、蛋白质、基因突变、蛋白相互作用及相应的信号通路和功能富集等不同层面,揭示BRD（bromodomain）蛋白家族与HCC的相关性,探索BRD蛋白家族作为HCC的肿瘤进展及预后判断的潜在生物标志物价值。方法：从UALCAN数据库中获取BRD蛋白家族所有成员在HCC患者组织样本中的mRNA表达数据和患者临床信息并进行相关性分析。从TCGA数据库中获取BRD蛋白家族mRNA表达水平与HCC患者预后的数据并进行相关性分析。从The Human Protein Atlas数据库中获取BRD蛋白家族在HCC组织和正常肝组织中的免疫组化结果并进行对比分析。使用 STRING 数据库获取 BRD 蛋白家族的相互作用蛋白网络,并利用CYTOSCAPE软件对获取的相互作用蛋白进行KEGG和GO分析。结果：BRD家族7个成员均在HCC组织中高表达（P<0.01）,并且与HCC患者肿瘤分级和临床分期正相关（P<0.01）,同时BRD8和BRD9的低表达提示HCC患者预后较好（P<0.05）。BRD相互作用蛋白主要参与组蛋白乙酰化修饰,并高度富集于HCC相关的信号通路。TP53基因突变HCC患者的BRD1、BRD3、BRD4、BRD7、BRD8和BRD9表达水平显著高于非突变患者（P<0.05）。结论：BRD蛋白家族分子能够作为HCC患者肿瘤分级、临床分期和预后判断的潜在靶标。     

siRNA沉默RhoC表达诱导人肝癌BEL7402细胞凋亡

目的:研究siRNA沉默RhoC基因表达对人肝癌细胞BEL7402凋亡的影响及其机制,为肝癌的基因治疗提供实验依据。方法:构建RhoC-siRNA真核表达载体pU6mRFPRhoC-siRNA,转染BEL7402细胞,激光共聚焦显微镜检测转染效率,RT-PCR和Western blotting鉴定RhoC基因沉默效果;流式细胞术、琼脂糖凝胶电泳和瑞氏染色检测BEL7402细胞凋亡,RT-PCR检测细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达。结果:成功构建pU6mRFPRhoC-siRNA重组载体,转染BEL7402细胞的效率为70%,RT-PCR和Western blotting检测RhoC基因沉默效率分别为85%和82%。pU6mRFPRhoC-siRNA转染组BEL7402细胞凋亡显著高于未转染BEL7402细胞和pU6mRFP Scramble-siRNA转染组BEL7402细胞[(21.00±2.23)%vs(6.47±1.64)%、(4.63±0.47)%,P<0.01)],pU6mRFPRhoC-siRNA转染组BEL7402细胞DNA呈典型的梯状条带,瑞氏染色见转染组BEL7402细胞中有大量凋亡...     

原发性肝癌蛋白质组学研究进展

继人类基因组研究之后,蛋白质组学成为当前生物医学研究的热点。蛋白质组学的不断发展,使我们可以深入理解基因级研究不能明确的细胞和分子机制,促进了肝癌在分子机制上更全面的研究,为了解原发性肝癌的发病机制、早期诊断和预防及治疗提供重要的理论基础。