不同信号肽对嵌合抗原受体T细胞杀伤作用的影响研究

背景与目的:信号肽(signal peptide,SP)是一段存在于前体蛋白N-端的短肽链,能够调节前体蛋白的折叠和转移,在蛋白质的分泌过程中扮演着极其重要的角色.近年来,靶向CD19的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞在白血病治疗中取得了重大突破,关于CAR结构的胞内域改...     

靶向CD70的CAR-T细胞联合疗法的研究进展

CAR-T细胞疗法是一种新兴的抗肿瘤免疫细胞疗法,在某些血液系统恶性肿瘤的治疗中取得进展。由于CAR-T细 胞自身存在靶抗原的异质性、自发功能耗竭等问题,同时实体瘤有较强的逃避机体免疫系统的能力,导致单一CAR-T细胞应用于 实体瘤中鲜有成效。CD70是一种Ⅱ型穿膜糖蛋白,在正常人体组织中表达较少或不表达,在多种肿瘤组织中高表达,因此,成为 CAR-T细胞疗法的有效靶点之一。近年来,研究聚焦于靶向CD70的嵌合抗原受体基因修饰T（CD70 CAR-T）细胞在CAR结构 上的不断优化、与其他靶点联合构建双特异性CAR-T细胞（B7H3、CD19等）及联合治疗（PARP抑制剂、溶瘤病毒、表观遗传学调 节剂等）,探索增强疗效的新策略。本文论述了CD70 CAR-T细胞疗法的研究进展,分析联合疗法提高疗效的分子机制,为其早 日应用于临床治疗提供了新思路。     

CD70／CD27通路参与的免疫调节及CD70在肿瘤中的表达

CD70／CD27通路在人类免疫调节中扮演着重要的角色,其在免疫调节中的作用主要表现在促进T细胞的活化与增殖,诱导效应T细胞和记忆T细胞的分化与形成以及对调节性T细胞的干预上。另外在某些肿瘤细胞中,CD70高水平表达为肿瘤的免疫治疗提供了新的思路。     

靶向FRα嵌合抗原受体T淋巴细胞杀伤结直肠癌细胞的研究

目的 探究叶酸受体α抗原(FRα)在结直肠癌中的表达情况,通过构建靶向FRα抗原的嵌合抗原受体(CAR)T淋巴细胞(FRα-CAR T),评估使用FRα-CAR T治疗结直肠癌的可行性。方法 应用生物信息学数据库(TIMER2.0)分析FRα抗原在结直肠癌组织中的表达情况及其与免疫细胞浸润的关系。使用慢病毒载体将编码靶向FRα抗原的二代CAR结构的基因转导入CD8⁺ T淋巴细胞,制备FRα-CAR T,流式细胞术分析转染效率。体外培养CACO-2和HCT-116细胞,采用流式细胞术分析FRα在肿瘤细胞表面的表达情况,将FRα-CAR T和CD19-CAR T及空载体转导的T细胞(mock T)作为效应细胞,CACO-2和HCT-116做为靶细胞,细胞计数试剂盒(CCK8)检测不同效靶比(1∶1、5∶1、10∶1和20∶1)对靶细胞的杀伤率;采用流式细胞术和ELISA法分别检测CAR T细胞杀伤CACO-2和HCT-116后细胞中干扰素γ(IFN-γ)和白介素-2(IL-2)的分泌情况。结果 生物信息学分析显示FRα抗原在结直肠癌组织中表达水平高于正常组织(P=0....     

三氧化二砷对人肾癌RCC-WCS细胞的作用及其机制研究

目的 :观察三氧化二砷 (Arsenictrioxide ,As2 O3 )对人肾癌细胞系RCC WCS细胞生长的抑制作用 ,并初步探讨其作用机制。方法 :采用MTT法检测As2 O3 对肾癌细胞生长的抑制作用 ,用流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡 ,用RT PCR法检测c myc和bc1 2mRNA表达的变化。结果 :As2 O3 以浓度依赖方式抑制RCC WCS细胞的体外生长 ,在浓度为 0 5、1 0、2 0和 4 0 μmol/L作用 96h时 ,As2 O3 对RCC WCS细胞的抑制率分别为 2 7 6 0 %、30 0 9%、4 1 0 3%和 5 0 77% ;与未经As2 O3 处理的RCC WCS细胞相比 ,均有显著性差异 (P <0 0 1)。As2 O3 作用后的RCC WCS细胞 ,G2 /M期细胞从 7 3%上升到 16 6 % ,同时出现 13 7%的凋亡峰。As2 O3 可以诱导c mycmRNA表达水平的下降 ,但bc1 2的表达无明显变化。结论 :As2 O3 在相当于临床应用的浓度可抑制RCC WCS细胞生长 ,使细胞阻滞在G2 /M期 ,并诱导细胞凋亡。这种抑制作用机制之一可能是诱导c myc基因表达水平的下降。     

融合PE38 的抗CD70 纳米抗体免疫毒素的制备及其对肾透明细胞癌786-O细胞的杀伤作用

目的：构建靶向CD70 分子的重组免疫毒素,通过表达、纯化制备PE38 与抗CD70 纳米抗体重组蛋白,体外抗肿瘤实验探究重组蛋白是否对高表达CD70 分子的阳性肿瘤细胞具有杀伤活性。方法：通过基因工程手段,将CD70 纳米抗体Nb 2B3基因片段通过一个连接子与pET21a-PE38 基因片段相连,获得重组表达载体pET21a-Nb 2B3-PE38 并转入BL21（DE3）感受态细胞中进行表达、纯化与鉴定。用间接ELISA 及FACS法检测Nb 2B3-PE38 与CD70 分子的结合活性,MTT法检测Nb 2B3-PE38 对高表达CD70 分子的肾透明细胞癌786-O 细胞的体外杀伤活性,Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染法检测Nb 2B3-PE38 对786-O 细胞凋亡的影响。结果：成功构建抗CD70纳米抗体重组免疫毒素Nb 2B3-PE38,纯化获得纯度>90%的重组蛋白,SDS-PAGE及WB检测结果表明目的蛋白正确表达,分子量为56 000。纯化后的Nb 2B3-PE38 能与重组CD70 抗原及786-O细胞表面的CD70 分子特异性结合;25 μg/mL Nb 2B3-PE38即对786-O细胞产生极显著的杀伤作用（P<0.001）,并且促进786-O细胞的细胞凋亡（P<0.01）,其杀伤效应强于阳性对照顺铂（P<0.01）。结论：成功制备了特异性靶向CD70 分子的免疫毒素Nb 2B3-PE38,其能够有效杀伤786-O细胞并诱导细胞凋亡且效果强于顺铂。     

靶向B细胞成熟抗原的嵌合抗原受体T细胞的构建及其对肿瘤细胞的杀伤

[摘要] 目的：探索通过嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）-T 细胞靶向B 细胞成熟抗原（B cell maturation antigen,BCMA）以治疗多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）的方法。方法：构建基于鼠源BCMA scFv 的CAR-BCMA分子,包装为慢病毒载体并感染健康人T 细胞构建CAR-BCMA-T 细胞;构建BCMA阳性细胞系A549-BCMA、A549-BCMAOFP和K562-BCMA作为靶细胞。将CAR-BCMA-T细胞与构建的靶细胞和人骨髓瘤细胞U266 共孵育,CCK-8 法和流式细胞术检测其对BCMA阳性肿瘤细胞的杀伤能力。构建MM患者来源CAR-BCMA-T细胞并检测其杀伤靶细胞A549-BCMA的能力,并采用ELISA和流式细胞术检测CAR-BCMA-T细胞IFN-γ 的释放水平。结果：健康人来源的CAR-BCMA-T经过11 d 培养扩增300 倍,阳性率达到43%;成功构建BCMA阳性靶细胞。在5:1 效靶比下,CAR-BCMA-T对A549-BCMA、K562-BCMA和U266 细胞的杀伤率分别在80%、60%和80%左右,显著高于对BCMA阴性细胞的杀伤率,且杀伤力与靶细胞的BCMA表达强度相关。在效靶比20:1 时,MM患者来源CAR-BCMA-T细胞对靶细胞A549-BCMA的杀伤率达到95%以上,并且大量分泌IFN-γ。结论：本研究成功构建了健康人及MM患者来源的靶向BCMA的CAR-T细胞,其能够有效特异杀伤BCMA阳性的肿瘤细胞。     

靶向CD33 的CAR修饰的NK92 细胞对CD33+急性髓系白血病细胞的杀伤作用

[摘要] 目的：根据抗CD33-scFv 序列构建CD33-CAR 修饰的NK92 细胞,探讨其对CD33+ 急性髓系白血病（acute myeloidleukemia,AML）细胞的杀伤作用。方法：通过基因合成以及分子克隆技术获得抗CD33-CAR片段,然后将其构建到慢病毒载体上,进行慢病毒包装,将得到的慢病毒转染NK92 细胞,用流式细胞术检测细胞转染效率并通过嘌呤霉素筛选得到稳定表达抗CD33-CAR的细胞系CD33-CAR-NK92,利用钙黄绿素释放法检测该细胞的杀伤作用,ELISA法检测细胞因子IFN-γ 分泌的变化。结果：成功构建pCDH-CD33-CAR 重组慢病毒质粒,慢病毒转导后约18.7%的NK92 细胞表达CD33-CAR（命名为CD33-CARNK92细胞）,嘌呤霉素筛选后表达CD33-CAR的NK92 细胞比例约86.3%。CD33-CAR-NK92 细胞对CD33+AML细胞MOLM-13的杀伤作用明显高于未被基因修饰的NK92 细胞（P<0.01）,而两者对CD33-肿瘤细胞JURKAT 的杀伤作用没有明显差异（P>0.05）。效靶比为2∶1 共培养6 h 后,经CD33-CAR修饰的NK92 细胞相比未被基因修饰的NK92 细胞IFN-γ 的分泌水平明显升高[ （190.97±11.52）vs（88.41±2.75）pg/ml, P<0.01]。结论：CD33-CAR-NK92 细胞能特异性识别CD33 抗原并杀伤CD33+AML细胞,其杀伤作用显著高于未被基因修饰的NK92 细胞,为进一步开展靶向CD33 的CAR-NK92 细胞治疗AML的临床转化奠定了实验基础。     

抗CD19 嵌合受体修饰的NK-92 细胞的构建及其对CD19 阳性非霍奇金淋巴瘤细胞的杀伤作用

目的：构建表达CD19 的二代CAR-NK-92 细胞系,探讨其对CD19 阳性非霍奇金淋巴瘤细胞的特异性杀伤作用。方法：构建表达CD19-CAR基因的载体并包装慢病毒颗粒,感染NK-92 细胞,流式细胞术检测感染率,并进一步分选阳性细胞,Western blotting 检测CD19-CAR 在NK-92 细胞中的表达;以CD19 阴性骨髓瘤细胞U-266、CD19 阳性的非霍奇金淋巴瘤细胞ARH-77 和HS-Sultan 细胞为靶细胞,以CD19CAR-NK-92 为效应细胞,流式细胞术检测细胞杀伤实验中存活肿瘤细胞的绝对数量并计算杀伤率。结果: 成功构建慢病毒载体pLVX-CD19-CAR并包装病毒颗粒,感染NK-92 细胞后CD19CAR-NK-92 细胞纯度高于90%;Western blotting 分析显示CD19-CAR已经成功表达在NK-92 中。CD19CAR-NK-92 对ARH-77[ （70.10±1.86）% vs （1.95±0.63）%,P<0.01]和HS-Sultan[ （74.98±1.60）% vs（0.58±1.49）%,P<0.01]细胞的杀伤率显著高于空载体对照组ZsGreen-NK-92 细胞,对U266 的杀伤率无显著差别（P>0.05）。结论：成功构建了表达CD19CAR的NK-92 细胞系,其对CD19 阳性的非霍奇金淋巴瘤细胞有特异性杀伤作用。     

靶向MUC16的嵌合抗原受体修饰的NK-92细胞对卵巢癌的抗肿瘤活性

目的:探索靶向MUC16的嵌合抗原受体修饰的NK-92(CARNK-92)细胞对卵巢癌的抗肿瘤活性.方法:通过免疫组化法及流式细胞术检测庆阳市中医医院妇产科卵巢癌外科手术15例患者的肿瘤组织及4种卵巢癌细胞系中MUC16的表达情况.通过全基因合成的方法合成MUC CAR序列并构建重组慢病毒表达载体,利用慢病毒感染的方式...     

CD19和CD22双靶点CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用

目的：设计并制备一种分别靶向B细胞表面抗原CD19和CD22的CAR-T细胞,检测其对肿瘤细胞的体内外杀伤效果。方法：将含有人源化CD19 Sc Fv的二代CAR分子和带有CD3ε链作为共刺激结构域的CD22 Sc Fv CAR分子以P2A自剪切肽连接,序列连接于慢病毒载体p LTR-CMV-MCS中,以HEK-293T细胞包装相应的慢病毒载体,感染健康志愿者提供的T细胞制备CAR-19-22-T细胞,同时以相同二代结构分别构建单靶向CAR-T细胞作为参照。构建表达荧光素酶、CD19和/或CD22的前列腺癌3M细胞（靶细胞）。将各种CAR-T细胞与靶细胞共同培养,采用荧光素酶化学发光法和ELISA法检测其对靶细胞的杀伤能力和细胞因子的分泌水平。通过尾静脉注射Raji-Luc细胞构建NOD-SCID免疫缺陷小鼠白血病模型,分别注射各组CAR-T细胞进行治疗并评估其疗效。结果：培养7 d的CAR-19-22-T细胞的CAR-19表达率为13.7%,CAR-22表达率为14.3%。CAR-19-22-T细胞在10∶1效靶比时,对3M-CD19-Luc、3M-CD22-Luc和3M-CD19-...     

嵌合抗原受体修饰的CD19-CAR-T的体外构建、扩增及初步功能鉴定

目的： 探索一种特异性靶向 CD19 分子的嵌合抗原受体修饰的 CD19-CAR-T 的构建方法,并明确其体外杀伤 靶细胞的效果。 方法： 运用分子克隆技术,将 PCR 获得的 CD19-CAR 片段构建到 pCDH-GFP 慢病毒载体上,利用包装 的慢病毒颗粒转染供者 CD3 + T 细胞,通过流式细胞术及 PCR鉴定转染效率,并通过 7-AAD染色鉴定扩增得到的CD19- CAR-T细胞体外杀伤CD19 + Ramos靶细胞的效果。 结果： 经慢病毒转染T细胞在体外培养 10 d 后,CD3 + T 扩增达（78.8± 23.2）倍, （58.3±5.4）%的 CD3 + T 细胞表达 GFP,CD19-CAR-T 体外杀伤 CD19 + Ramos 靶细胞在效靶比5∶1时效率为（57.4± 9.3）%。 结论： 本实验成功建立了一种有效的体外构建及扩增CD19-CAR-T的方法,且具有明显靶向性,为CD19 + B细胞肿瘤临 床治疗提供实验依据。     

靶向CD19的CAR修饰的NK细胞对B细胞淋巴瘤的杀伤

目的:利用鼠杂交瘤技术筛选和制备治疗性CD19单克隆抗体,探讨以CD19 scFv序列构建CD19-CAR(pCD19-CAR)修饰的NK细胞对CD19+B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用.方法:用偶联多肽免疫小鼠制备CD19单克隆抗体,然后用基因测序法获得抗体的序列.分析抗体序列,并通过基因合成和分子克隆技术构建pCD19-CAR片段,然后将其克隆到慢病毒载体上,病毒包装制备后,转染NK-92MI细胞.最后,用流式细胞术检测不同的pCD9-CAR-NK-92MI细胞对CD19+细胞的杀伤率.结果:(1)成功筛出特异性强的CD19单克隆抗体-pCD19;(2)抗体检测结果显示CD19+的Ramos细胞的阳性率为84.3％,Raji为85.6％,与商业化抗体结果相似;(3)被pCD19-CAR修饰的CD19-CAR阳性率为28.72％的NK-92MI细胞对CD19+的Ramos和Raji细胞的杀伤效率明显高于未被修饰的NK-92MI细胞株对Ramos和Raji细胞的杀伤率[(47.1±1.7)％vs(24.7±6.2)％和(51.8±7.9)％vs(27.6±9.6)％,均P＜0.05];对CD19-细胞Jurkat,不论是未被pCD19-CAR修饰的NK-92MI或是被修饰的NK-92MI细胞,几乎都不存在特异性杀伤作用[(16.1±0.7)％vs(17.7±2.9)％,P＞0.05].结论:成功构建pCD19-CAR,被pCD19-CAR修饰的NK-92MI细胞能特异性的识别CD19抗原并杀伤CD19+B细胞淋巴瘤细胞.     

肿瘤坏死因子CD70在肿瘤发生与治疗中的研究进展

CD70是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员之一,是一种Ⅱ型跨膜蛋白,在调控免疫应答过程中发挥重要的作用。CD70的高表达常见于多种肿瘤组织中,目前以CD70为靶点的免疫治疗药物已经在临床前期研究中应用。CD70在肿瘤细胞表面的表达,不仅可使肿瘤细胞逃避免疫监视、诱导免疫细胞凋亡,同时也可以激活部分免疫细胞杀伤肿瘤细胞,这些作用给恶性肿瘤的免疫治疗带来了新的方向。本文就近年来CD70在肿瘤研究中的进展作一综述。     

人CD3AK细胞杀伤人肺腺癌细胞的形态学观察

抗CD3抗体激活的杀伤细胞(CD3AK细胞)是一种新型的免疫效应细胞，与LAK细胞相比具有广谱、较高的杀伤活性及低IL-2依赖性的特点，因而受到重视。关于其杀伤机制的研究目前尚无明确报道。本研究把体外培养中贴壁状态的人肺腺癌细胞与用抗CD3单克隆抗体激活的人外周血来源的CD3AK细胞共同培养，电镜下观察了两种细胞的相互作用和靶细胞被杀伤的过程．藉此对CD3AK细胞杀伤肿瘤细胞的机制作一探讨。     

表达PD-1 shRNA增强靶向CD19 CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力

目的：设计和构建表达PD-1 shRNA的靶向CD19 CAR-T细胞并验证其体外肿瘤细胞杀伤能力。方法：设计并构建 表达PD-1 shRNA的CD19 CAR分子基因,将其包装成逆转录病毒载体,通过qPCR法检测病毒载体拷贝数。将慢病毒转导人原 代T细胞,获得三种CAR-T细胞,分别为RNAU6-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞。 采用qPCR法检测三种CAR-T细胞中PD-1 mRNA的表达水平,流式细胞术检测三种CAR-T细胞中PD-1表达水平,萤光素酶报 告基因实验、流式细胞术检测在不同效靶比时 CAR-T 细胞对 CD19 阳性靶细胞（人淋巴瘤 daudi 细胞）的杀伤功能。结果： RNAU6-CD19 CAR、PD-1 shRNA1-CD19 CAR、PD-1 shRNA2-CD19 CAR 三种 CAR 分子成功包装成逆转录病毒载体,病毒载 体拷贝数均高于 1×107 拷贝/mL,转导人原代 T 细胞获得 CAR-T 细胞,RNAU6-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞转导效率分别为43.1%、55.1%、41.7%。与RNAU6-CD19 CAR-T细胞相比,PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、 PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞中PD-1 mRNA表达水平均显著降低（均P<0.01）、细胞表面PD-1表达水平更低（均P<0.01）、体 外对daudi细胞的杀伤率更高（P<0.05或P<0.01）。结论：成功构建表达PD-1 shRNA的靶向CD19 CAR-T细胞,其对CD19阳性 靶细胞的杀伤率显著提高,PD-1 mRNA及其翻译产物PD-1的表达减少,CAR-T细胞的耗竭减缓。     

抗CD47单克隆抗体制备及其促巨噬细胞吞噬作用鉴定

目的:制备可识别肿瘤细胞表达CD47蛋白的抗CD47单克隆抗体,并鉴定其抗肿瘤作用。方法:利用BL21(DE3)原核表达系统表达CD47胞外段蛋白,利用Ni-NTA层析纯化表达蛋白。免疫BALB/c小鼠,制备并筛选分泌抗CD47单克隆抗体的杂交瘤细胞株。利用正辛酸-硫酸铵沉淀方法纯化抗CD47单抗。利用流式细胞术检测纯化抗体的活性。利用巨噬细胞与肿瘤细胞共培养试验,检测抗CD47单抗的抗肿瘤作用。结果:表达并纯化了CD47胞外段蛋白,筛选到了分泌抗CD47单克隆抗体的杂交瘤细胞株—7D4,流式细胞术检测结果显示,抗体具有结合肿瘤细胞的活性,但是对不同肿瘤类型细胞的结合效率存在差异。巨噬细胞与肿瘤细胞共培养试验发现,利用抗体封闭肿瘤细胞CD47信号后,可以增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。结论:抗CD47单抗—7D4可以促进巨噬细胞的吞噬作用,具有潜在应用价值。     

靶向CD70抗肿瘤药物的研究进展

分化抗原簇70（CD70）是肿瘤坏死因子受体超家族的成员之一,属于Ⅱ型穿膜糖蛋白。正常组织中CD70仅短暂地表 达在活化的T细胞、B细胞及成熟的树突状细胞中。CD70在多种肿瘤细胞表面高表达,不仅可使肿瘤细胞逃避免疫监视、诱导免 疫细胞凋亡,同时也可以激活部分免疫细胞杀伤肿瘤细胞,这给恶性肿瘤的免疫治疗带来了新的方向。靶向CD70的单克隆抗体 （mAb）、抗体药物偶联物（ADC）以及CAR-T细胞免疫疗法在临床试验中显示出巨大的潜力。对于靶向CD70抗肿瘤药物的认 识,可为其临床应用提供参考和研究依据。     

Lenti-TK介导间充质干细胞对鼻咽癌CD133+干细胞的靶向迁移及杀伤作用

目的： 观察慢病毒-胸苷激酶（lentivirus-thymidine kinase,Lenti-TK)/间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC）对鼻咽癌CD133+干细胞的靶向迁移及杀伤作用。 方法： 构建包含TK基因的重组慢病毒表达载体Lenti-TK,感染MSC后得到Lenti-TK-MSC,RT-PCR及Western blotting检测Lenti-TK-MSC中HA-TK的表达。免疫磁珠法从鼻咽癌5-8F细胞中分选CD133+细胞;Transwell小室迁移实验检测Lenti-TK-MSC对CD133+5-8F细胞的趋向性;Lenti-TK-MSC联合更昔洛韦（ganciclovir,Lenti-TK-MSC/GCV）与CD133+5-8F细胞共培养,CCK-8试剂盒检测其对细胞的杀伤作用和旁观者效应。 结果： 成功构建重组慢病毒载体Lenti-TK,其滴度为1×108UT/ml,Lenti-TK（MOI=50）感染MSC 72 h时,感染效率达（95.1±01）%。Lenti-TK-MSC迁移至CD133+5-8F细胞组的细胞数明显多于CD133-5-8F细胞组、未分选5-8F细胞组\[（83.0±8.7） vs （29.6±53）、（38.3±5.2）,P=0.000\]。Lenti-TK-MSC/GCV处理组与单独GCV处理组、Lenti-TK-MSC/GCV条件培养液（即Lenti-TK-MSC加入1 mg/L GCV培养48 h的培养上清）处理组相比,CD133+5-8F细胞的存活率明显降低\[（37.2±2.3）% vs （98.5±3.1）%、（83.8±34）%,P=0.000\]。Lenti-TK-MSC数量达到混合细胞总数（Lenti-TK-MSC和CD133+5-8F细胞)的20%时,CD133+5-8F细胞存活率为（68.2±2.3）%,表现出明显的旁观者杀伤效应。 结论： Lenti-TK感染后MSC对鼻咽癌CD133+5-8F细胞具有靶向迁移及杀伤作用。