神经干细胞移植在脑出血治疗中的应用

目的：根据近年神经干细胞移植治疗神经系统疾病的近况，认识神经干细胞移植在脑出血治疗中的最新研究与应用情况。资料来源：应用计算机检索PubMed2000-01／2005-01相关神经干细胞移植的文献，检索词“neural stem cells transplantation，cerebral hemorrhage”，并限定文献语言种类为English。资料选择：对资料进行初审，选取包括神经干细胞的相关文献，开始查找全文。纳入标准：①神经干细胞移植与神经功能的恢复。②神经干细胞移植与脑出血。排除标准：①综述文献、重复研究、Meta分析类文章。资料提炼：共收集到30篇关于神经干细胞移植的文献，纳入18篇符合标准的文献进行探讨。资料综合：神经干细胞具有分裂增殖能力和多项分化潜能，其来源不再局限于胚胎干细胞，还可以来源于成体神经干细胞，永生性神经干细胞系、骨髓间质干细胞、骨骼肌以及皮肤干细胞等。神经干细胞的分离、培养、鉴别、及分化调控技术已日趋成熟，所以利用神经干细胞移植治疗神经系统疾病的研究受到广泛的关注。神经干细胞移植对Parkinson病、脑肿瘤、缺血性脑血管意外的神经功能恢复有积极的促进作用，而对于脑出血作用的研究较少，通过神经干细胞移植对脑出血动物模型的研究来说明治疗的可行性和可能的作用机制。结论：神经干细胞移植对脑出血实验模型的神经功能恢复有积极的促进作用。     

神经干细胞移植的临床问答

1 您认为目前神经干细胞移植临床应用的现状是什么样的?存在哪些问题?您有何建议? 目前,很多医院和科研单位甚至一些急于获利的公司都在积极开展这项工作,但突破性的、令人耳目一新的成果几乎没有.     

神经干细胞移植研究概况

神经干细胞 (neuralstemcells,NSCs)在神经系统损伤后具有巨大的再生潜能。NSCs可在多种哺乳动物的胎脑或成年动物和成人的脑组织中分离获得 ,也可从小鼠或人的胚胎干细胞中获得 ,甚至可由骨髓细胞等非神经系统细胞诱导产生。NSCs可在体外长期分化、增殖 ,并保持多向分化潜能。NSCs被移植入成年动物神经系统后 ,在神经损伤处可分化成神经细胞并恢复其功能 ,而在无神经细胞区域则分化成胶质细胞。目前NSCs移植已在临床研究治疗帕金森病、脑卒中和脊髓损伤的病例中获得成功。NSCs的研究进展 ,为治疗神经系统疾病 ,展示出光明的前景     

神经干细胞移植治疗研究进展

神经系统起源于胚胎神经管多能干细胞,而成人中枢神经系统内干细胞样前体细胞的发现为应用神经干细胞(NSCs)治疗各种神经系统疾病提供了前提条件。通过内源性NSCs增殖与迁移治疗各种神经元缺失疾病能力有限,而应用NSCs移植或有特定分化潜能的神经前体细胞移植治疗中枢神经系统损伤以及各种神经退行性疾病则可以促进患者神经功能恢复。目前,NSCs疗法所面临的主要问题是如何使NSCs定向分化替代特定功能的神经元,而NSCs疗法研究的热点是如何在分子水平调控NSCs的分化以及损伤区域NSCs的命运。     

电刺激小脑顶核联合神经干细胞共移植体治疗大鼠局灶性脑缺血

目的:观察局灶性脑缺血大鼠植入神经干细胞共移植体联合电刺激小脑顶核对新生血管密度的影响。方法:实验于2005-08/2006-11在佳木斯大学神经科学研究所完成。①实验分组:选取同一基因背景大鼠96只,随机数字表法分成4组:神经干细胞组、电刺激 神经干细胞组、神经干细胞共移植体组、电刺激 神经干细胞共移植体组,24只/组,移植后3,7,14,60d每个时间点各6只;另取新生24h内Wistar鼠1只用于神经干细胞的培养。共移植体由神经干细胞、层粘连蛋白和血管内皮细胞构成,由本实验室提供并鉴定。②实验方法:各组大鼠均采用线栓法建立大脑中动脉缺血模型,其中电刺激 神经干细胞组、电刺激 神经干细胞共移植体组于造模前1d行小脑顶核电刺激。以前囟为零点、正中线向后11.6mm、正中线向右1.2mm钻开颅骨后,用电针刺入脑内深5.6mm,给予直角方波脉冲刺激,电流强度为50μA,频率为0～100Hz,时程为0.5ms,连续刺激1h。各组均在造模后3d进行移植,移植部位为右侧纹状体缺血半暗带区。移植前分别将培养的神经细胞、神经细胞共移植体溶解于磷酸盐缓冲液中,细胞浓度调整为2×1010L-1。单纯神经干细胞组、电刺激 神经干细胞组植入神经干细胞悬液10μL,神经干细胞共移植体组、电刺激 神经干细胞共移植体组植入神经干细胞共移植体悬液10μL。③实验评估:各组分别于移植后3,7,14,60d腹腔麻醉取脑,制作石蜡切片,免疫组织化学法检测新生血管生成情况。结果:①新生血管免疫组织化学检测结果:新生血管是由单层扁平上皮细胞构成的,经免疫组化DAB显色后,新生血管内皮细胞的胞浆呈棕黄色,存在基底膜完整、不完整或无基底膜3种情况。②各种干预因素在不同时间点对新生血管生成的影响:各组在移植后3d均有新生血管生成,7d生成数量达到高峰,14d生成数量开始减少,至60d有较少的新生血管生成。以上各时间点电刺激 神经干细胞共移植体组新生血管密度均显著高于另外3组(F=7.12～15.86,P均<0.05)。结论:电刺激小脑顶核与神经干细胞共移植体移植能够促进大鼠局灶性脑缺血区新生血管的生成。     

神经干细胞移植途径的理论研究进展

神经干细胞是指来源于神经组织或能分化为神经组织、具有自我更新能力和多向分化潜能的一类细胞,近年来神经干细胞研究成为治疗神经退行性疾病和中枢神经系统损伤的热点.移植入宿主体内的神经干细胞能够向神经系统病变部位趋行、聚集,并能够存活、增殖、分化为神经元和/或胶质细胞,从而促进宿主缺失功能的部分恢复.如何将神经干细胞准确、安全移植到宿主体内,并最终迁移、聚集到脑内功能缺失部位成为该技术发展的一个重要环节.文章就目前神经干细胞动物实验和临床研究中较多采取的移植途径,包括局部注射移植、经脑脊液注射移植、经血液循环注射移植的研究进展加以概述,比较这3种方法各自的优缺点,分析神经干细胞移植的安全性和有效性,探讨哪种移植途径才是神经干细胞最适合的移植方法.     

电刺激小脑顶核促进大脑中动脉缺血鼠共移植体中神经干细胞向神经元的分化

目的:向大脑中动脉缺血大鼠植入神经干细胞,探讨电刺激小脑顶核与神经干细胞共移植体对其向神经元分化的影响。方法:实验于2005-08/2006-11在佳木斯大学神经科学研究所完成。①选取同一基因背景大鼠72只,随机数字表法分成3组:神经干细胞移植组、电刺激 神经干细胞组、电刺激 神经干细胞共移植体组,24只/组。②另选取出生24h内的Wistar鼠1只用于神经干细胞的分离,制备单细胞悬液,调整细胞密度为5×108L-1,置于10mg/L的Brdu完全培养液中孵育72h。神经干细胞共移植体由神经干细胞、层粘连蛋白和血管内皮细胞构成,由本实验室提供并鉴定。③各组大鼠于造模前1d麻醉后行小脑顶核刺激,以前囟为零点、正中线向后11.6mm、正中线向右1.2mm。给予直角方波脉冲刺激,电流强度为50μA,频率80Hz,时程1h。④各组大鼠均采用线栓法建立局灶性脑缺血动物模型。造模1d后,分别将培养的神经干细胞及共移植体细胞浓度调整为2×1010 L-1,于缺血纹状体侧缺血半暗带区垂直进针,进入5.0mm后缓慢推入细胞悬液,神经干细胞移植组、电刺激 神经干细胞组移植神经干细胞悬液10μL,电刺激 神经干细胞共移植体组移植神经干细胞共移植体悬液10μL,移植速度为0.5μL/min,留针10min后缓慢拔针。⑤各组分别于移植后3,7,14,60d观察神经干细胞移入脑内后分化成神经元的情况。胞核呈绿色荧光、胞质呈红色荧光的为Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞,代表移植入的神经干细胞所分化的神经元。结果:72只同一基因背景大鼠均进入结果分析。①与神经干细胞移植组比较,移植后7,14,60d电刺激 神经干细胞组、电刺激 神经干细胞共移植体组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞百分率均明显升高(F=12.44～25.18,P均<0.05)。移植后3,7,14,60d电刺激 神经干细胞共移植体组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞百分率均明显高于电刺激 神经干细胞组(F=8.19～25.18,P均<0.05)。②随移植时间的延长,各组Brdu-神经元特异性烯醇化酶双阳性细胞形态均逐渐增大,至移植后60d时细胞周边可见突起。结论:大脑中动脉缺血模型鼠移植入神经干细胞后,电刺激小脑顶核能够对神经干细胞向神经元的分化产生促进作用,且共移植体与电刺激小脑顶核具有协同效应。     

神经干细胞移植治疗脊髓损伤

近 2 0年来 ,随着神经生物学的飞速发展 ,尤其是在细胞和分子水平上对脊髓外伤后继发性损伤的病理机制和神经干细胞的研究不断深入 ,使得人们对攻克脊髓损伤越来越充满信心。在治疗脊髓损伤的实验和临床研究中 ,研究者采取了一系列干预措施。它们主要针对以下 3个阶段[1] :①早期减轻继发性损伤造成的损害 :急性脊髓损伤发生后 ,由于损伤局部缺血、炎症反应、离子平衡紊乱、氧自由基过量产生等一系列因素造成原发损伤发展、恶化 ;通过采用离子通道阻滞剂、氧自由基清除剂等治疗措施可以减轻神经元和胶质细胞的继发性损伤 ;②中期采取多种手…     

干细胞移植与神经修复

背景：随着生命科学发展,利用干细胞来源的组织工程技术,有可能使受损的神经组织恢复再生能力。目的：针对较为重要的几种干细胞在神经系统修复中的临床应用做一综述,以期阐明各自适用范围和临床效度,为临床医师按需选择提供参考。方法：应用计算机检索PubMed数据库中1998至2011年期间的关于干细胞移植在神经修复方面研究的文章,检索词为“Stemcells,Transplantation,Newerepair”,限定语种为“English”。同时,检索万方数据库中2006至2011年期间的相关文章,检索词为“干细胞,移植,神经修复”,限定语种为中文。结果与结论：初次检索得到288篇文章,选择与移植干细胞的来源、分化、特征及其在神经修复方面相关的文章,包括基础研究和临床研究,观察对象无论为人或动物,均进行审校。根据纳入标准,在排除重复和个案报道类文章之后,重点选择32篇文章进行综述。说明干细胞移植为神经系统疾病的治疗提供了一条新途径,使传统认为的不可修复、不可再生的神经组织的结构修复和功能重建成为可能。干细胞移植是一个全新的领域,还有许多问题亟待解决。     

神经营养因子3基因修饰神经干细胞移植脊髓损伤的相关蛋白表达

背景:研究表明神经干细胞和神经营养因子3基因修饰的神经细胞联合移植能够在移植后存活并有效促进脊髓横断后脊髓的功能恢复,但神经营养因子3基因修饰的神经干细胞能否在脊髓受损部位发挥功能并促进脊髓损伤大鼠的功能恢复?目的:观察神经营养因子3基因修饰胚胎脊髓神经干细胞移植后脊髓损伤大鼠的功能恢复情况及损伤局部的基因表达.方法:将30只SD大鼠存T9水平进行脊髓半切后,随机分为3组,分别在受损脊髓内植入细胞培养液、神经干细胞及神经营养因了3基因修饰神经干细胞.另取10只仅行椎扳切除设置为空白对照.移植后通过行为学测试评价脊髓功能的恢复,RT-PCR和Western blot检测脊髓损伤部位神经营养因子3和髓鞘碱性蛋白的表达.结果与结论:移植神经营养因子3基因修饰神经干细胞组行为学测试结果最好,移植细胞培养液组行为学测试最差.与移植细胞培养液组相比,移植神经干细胞及神经营养因子3基因修饰神经干细胞组大鼠脊髓组织中神经营养因子3基因和髓鞘碱性蛋白基因的mRNA水平明显上调,在蛋白水平也有类似的结果,且神经营养因子3基因修饰神经干细胞组效果更明显.提示移植神经营养因子3基因修饰神经干细胞能促进脊髓受损部位出现史多向少突胶质细胞分化的细胞,并能更强的表达神经营养因子3.     

蛇床子素可促进体外培养神经干细胞的增殖

背景：神经干细胞具有自我更新和多向分化潜能,但正常情况下,神经干细胞数目太少,且大部分处于静息状态,促进其增殖是神经干细胞治疗神经退行性疾病的关键。目的：观察蛇床子素对体外培养的神经干细胞增殖作用的影响,分析其促进增殖能力的作用机制。方法：体外培养神经干细胞,在增殖培养基中培养至第3代,加入不同浓度的蛇床子素（10,50和100μmol/L）作用24 h用CCK-8法检测细胞活力,再培养3,5,7 d后测量神经球半径,用免疫荧光组化法计数Ki67阳性细胞数目;再培养3 d后利用RT-PCR技术检测神经干细胞中Notch 1、Hes 1和Mash 1基因表达的情况。结果与结论：与正常组比较,50,100μmol/L的蛇床子素具有明显促进神经干细胞增殖能力的作用,100μmol/L作用最为显著,可引起Notch 1基因、Hes 1基因上调表达,对Mash 1基因基本无影响,说明蛇床子素对体外培养的神经干细胞具有促进增殖作用,其作用机制可能与激活Notch信号通路上的Notch 1、Hes 1基因有关。     

体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化

背景：人脐带间充质干细胞较骨髓、脂肪等来源的间充质干细胞易取材、更为原始,并不受伦理、法律的限制,是中枢神经系统损伤修复最具治疗潜力的细胞来源之一。 目的：探讨重组人碱性成纤维生长因子、重组人表皮生长因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的潜能。 方法：采用碱性成纤维生长因子、表皮生长因子作为诱导剂,体外诱导人脐带间充质干细胞;在倒置显微镜下动态观察细胞形态学变化,并用免疫荧光法检测人脐带间充质干细胞向神经干细胞分化的情况,实时荧光定量PCR技术检测诱导前后神经干细胞标记蛋白巢蛋白在mRNA水平的相对表达量。 结果与结论：形态学观察经诱导后的人脐带间充质干细胞呈神经干细胞球改变;免疫荧光法及实时荧光定量PCR技术均可检测到神经干细胞标记物巢蛋白,并可进一步分化表达神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2以及神经胶质细胞蛋白、神经胶质原纤维酸性蛋白。碱性成纤维生长因子、表皮生长因子可定向诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞及神经元、神经胶质细胞分化。     

白血病抑制因子对体外培养神经干细胞影响的试验研究

目的探讨白血病抑制因子对体外培养神经干细胞增殖和分化的影响。方法观察体外培养神经干细胞在添加白血病抑制因子环境下的增殖、分化状况。结果体外培养神经干细胞呈悬浮生长,具有不断增殖的能力。添加白血病抑制因子能加快神经干细胞的增殖速度,提高其长期增殖能力。加血清诱导分化后细胞可分化为不同形态的细胞。添加白血病抑制因子可以抑制神经干细胞的分化,保留其多能型。结论白血病抑制因子对促进神经干细的增殖及维持未分化状态具有重要作用。     

离体培养神经干细胞的超微结构学研究

目的 研究离体培养条件下神经干细胞的超微结构。方法 分离、培养和诱导分化来自孕17-19d wistar大鼠胎鼠大脑皮层的神经干细胞，分别用扫描电镜和透射电镜观察神经干细胞分化前、后的超微结构。结果 未分化的神经干细胞的大小、形态和细胞内结构基本相同。细胞都呈小球形，表面带有微绒毛，细胞以有丝分裂形式进行增殖。透射电镜显示细胞核、浆比例很高，核呈多形性、分叶状；胞浆稀少，无成熟的细胞器。分化后，从球体表面向四周伸出众多突起，胞体也从球形变成扁平形．细胞浆体积明显增多，胞浆内出现多种成熟的细胞器。细胞从具有单一的细胞外部形态和内部结构的干细胞向不同的神经元和神经胶质细胞转变。结论 神经干细胞是保留原始细胞外部形态、内部结构和增殖特性的特殊细胞，在一定条件下可以被诱导分化成具有成熟细胞器的神经元和胶质细胞。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化

目的:已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞,实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性,以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞,为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞.方法:实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行.①动物:选择5只普通级SD大鼠,由泸州医学院实验动物中心提供,实验过程中对动物的处胃符合动物伦理学标准.②实验方法:大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉,取双侧胫骨和股骨,磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔.采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞,胰蛋白酶与EDTA联合消化,传至第4代,用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μ g/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化.③实验评估:观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化,采用SABC法进行免疫细胞化学榆测神经细胞特异性标志的表达.结果:①骨髓基质细胞形态观察:原代细胞接种l d后开始贴壁增殖,3 d后多数贴壁,贴壁细胞呈梭形或扁平形;10 d后90%细胞融合,以长梭形为主,突起粗大,形成网状、片状;传代后细胞贴壁速度加快,增殖能力更强,7 d左右达到融合.②诱导分化后细胞生长情况和形态变化:第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d,成球的细胞脱离瓶底,悬浮在细胞液中.将细胞离心弃上清,换成血清分化液后,细胞球逐渐贴壁,球周围很快发出突起,分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞.③神经细胞特异性标志的表达:骨髓源性细胞球表达巢蛋白,呈棕黄色,为神经干细胞:从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性.结论:骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞,且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞.     

人胚胎神经干细胞体外条件下对胶质瘤细胞的趋向性特点

目的:以Hs683、3T3成纤维细胞作为对照,探讨人胚胎神经干细胞在体外条件下对SHG44、C6胶质瘤细胞的趋向性。方法:①来源于怀孕子宫肌瘤切除术或流产的10～14周胚胎(西安市中心医院妇产科、西安交大二院妇产科、北方医院妇产科提供),产妇及其家属均签署知情同意书。Hs683成纤维细胞系由田晓峰博士馈赠,SHG44胶质瘤细胞系、C6胶质瘤细胞系、3T3成纤维细胞系均为本研究所冻藏。②将原代培养8d的人胚胎神经干细胞悬液离心、收集备用,最终神经球浓度达8×104 L-1。③将预先消毒的盖玻片(24mm×24mm)放置于培养皿内,将SHG44胶质瘤细胞系、C6胶质瘤细胞系、Hs683成纤维细胞系、3T3成纤维细胞系的4组细胞复苏后,加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养基。当各组细胞爬片上的细胞贴壁达75%～85%时,取出盖玻片,与上述制备的人胚神经球悬浮液共同培养。④将预先制备好的SHG44胶质瘤细胞、C6胶质瘤细胞、Hs683成纤维细胞、3T3成纤维细胞爬片(各10张)从培养瓶取出,置于新的培养皿,分别与神经干细胞克隆球在含体积分数为0.01～0.02胎牛血清的DMEM培养液中共培养72h,观察并统计各细胞系每张爬片的克隆球数。上述4种细胞爬片周边3mm以外相同面积、无胶质瘤/成纤维细胞区域作为其各自空白对照。⑤分别将神经干细胞克隆球 C6胶质瘤细胞 3T3成纤维细胞、神经干细胞克隆球 SHG44胶质瘤细胞 Hs683成纤维细胞同法共培养72h,观察人胚神经干细胞在SHG44、Hs683、C6、3T3细胞爬片上的分布情况。结果:①人胚神经干细胞对SHG44、C6胶质瘤细胞的趋向作用:SHG44/C6胶质瘤细胞 人胚神经干细胞克隆球共培养72h后,胶质瘤细胞爬片上的神经克隆球体积均有所增大,且数量均明显高于外周无胶质瘤细胞的空白对照区(P均<0.05)。②人胚神经干细胞对Hs683、3T3成纤维细胞的趋向作用:Hs683/3T3成纤维细胞 人胚神经干细胞克隆球共培养72h后,成纤维细胞爬片上的神经克隆球数量与周围无成纤维细胞区基本相似(P均>0.05)。③人胚神经干细胞 SHG44/C6胶质瘤细胞 Hs683/3T3成纤维细胞共培养下的体外趋向作用:SHG44胶质瘤细胞 Hs683成纤维细胞 人胚神经干细胞共培养72h后,SHG44胶质瘤细胞爬片上的神经球数量明显多于Hs683成纤维细胞爬片(P<0.05)。C6胶质瘤细胞 3T3成纤维细胞 人胚神经干细胞共培养72h后,C6胶质瘤细胞爬片上的神经球数量明显多于3T3成纤维细胞爬片(P<0.05)。结论:人胚胎神经干细胞与胶质瘤细胞体外共培养后,神经球出现向胶质瘤细胞周围集聚的趋势,提示胶质瘤细胞可能分泌某种对神经干细胞有一定作用的活性因子。     

神经干细胞体外培养方法及影响因素研究进展

神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群。神经干细胞的发现对患有神经系统难治性疾病患者的治疗带来了福音,但体内内源性神经干细胞的数量极少,限制了其在治疗疾病中的应用,所以如何有效提高神经干细胞培养存活率、克隆形成率将是其在临床应用的重要基础和前提。本文就目前对神经干细胞体外培养方法及影响因素的研究进展做如下综述。     

鼠胚神经干细胞体外培养方法的优化

目的:神经干细胞能够分化为神经元和神经胶质细胞,但其纯化、培养技术尚不完善通过不同接种密度和传代方法,筛选优化神经干细胞的体外培养技术。方法:实验于2006-05/12在四川大学移植免疫实验室完成。①动物:选取清洁级孕12～16 d雌鼠,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法:取孕鼠胚胎脑皮质,胰蛋白酶 乙二胺四乙酸消化组织,分离神经干细胞,加入含B27、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的DMEM/F12培养基.传至第3代时.调整细胞密度至1×10~7L~(-1),1×10~8L~(-1),1×10~9L~(-1),1×10~(10)L~(-1)进行培养。另取原代培养7～10 d后的神经干细胞,收集形成的细胞球,机械吹打法传代是离心后用由粗到细的吸管轻柔吹打.或用带5号针头的无菌注射器吹打分离细胞.操作中避免产生气泡.使用注射器时吹打的次数保持5次。胰酶消化联合机械吹打法传代是离心后加入胰蛋白酶,37℃水浴10min,用由粗到细且经火焰抛光的吸管轻柔吹打.或用带5号针头的无菌注射器吹打.以胎牛血清终止消化。③实验评估:观察第3代神经干细胞生长状态.MTT法检测各密度下培养1,3,5,7 d时的增殖情况。计数两种传代方法亚代神经干细胞形成的克隆球数目,比较增殖效果。免疫荧光染包检测神经球巢蛋白、BrdU标记、神经元特异性烯醇化酶、胶质细胞原纤维酸性蛋白的表达。结果:①神经干细胞的培养和鉴定:从胚胎大鼠脑皮质分离培养出的细胞可聚集成球状.并在体外大量扩增和长期存活,巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质细胞原纤维酸性蛋白均呈阳性表达,免疫荧光染色可见大量BrdU标记的阳性细胞。②不同接种密度对神经干细胞增殖的影响:按1×10~9L~(-1)密度培养的细胞分裂增殖最为迅速.于第7天达高峰,且克隆球生成数量明显多于1×10~7L~(-1),1×10~8 L~(-1),1×10~(10)L~(-1)密度(P均<0.05)。③不同传代方法对亚代神经干细胞克隆增殖效果的影响:采用机械吹打法传代的神经干细胞所增殖形成的细胞球结合紧密,抛光玻璃管 注射器吹打后细胞球能较好地分开.但不能完全分散成单细胞.传代后细胞能够继续生长,并形成亚代神经干细胞球。经胰酶消化的神经球在机械吹打后也不能完全形成单细胞,且其亚代克隆的形成能力明显低于机械吹打法(P<0.05)。结论:①从胚胎大鼠脑皮质分离培养出的细胞具有神经干细胞特性,可诱导分化为神经元和星形胶质细胞②1×10~9L~(-1)为最佳细胞接种密度,机械吹打法亚代克隆的活性和增殖能力明显优于胰酶消化联合机械吹打法。     

猪骨髓间充质干细胞体外诱导构建组织工程化软骨

目的:如何修复气管缺损是一项医学难题,组织工程技术有望解决这一难题.要构建工程化气管软骨,种子细胞是关键因素之一.探讨利用组织工程方法,将猪骨髓间充质干细胞在体外诱导、培养后,构建软骨组织的可能性.方法:实验于2006-10/2007-05在北京协和医院中心实验室完成.①实验材料:小型猪6只由中国农业大学提供,雌雄不限,体质量15～20 kg;聚羟基乙酸纤维(Equl.com.美国).②实验过程及评估:抽取猪的胸骨骨髓, 经密度梯度离心法在体外进行分离、纯化,得到骨髓间充质干细胞, 并在含有转化生长因子β1的特定培养基内进行培养、诱导,免疫组织化学检测诱导细胞Ⅱ型胶原分泌.将诱导分化的骨髓间充质干细胞接种于聚羟基乙酸支架上,将其作为实验组;对照组为未接种细胞的单纯聚羟基乙酸支架;将两组标本环行包裹于直径为0.4 cm的离心管外表面,植入自体猪皮下,进行体内培养,分别于6,8,10周后取材,进行大体观察和组织学检测,评估工程化软骨的形成.结果:①通过密度梯度离心法可获取骨髓间充质干细胞,对其进行培养扩增后可获得较多的细胞.②猪骨髓间充质干细胞通过特定的诱导后可向软骨细胞分化,诱导细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学检测结果为阳性.③猪骨髓间充质干细胞-聚羟基乙酸复合物经过体内第6,8,10周培养后,标本出现软骨组织外观,进行组织学切片可见软骨陷窝,Ⅱ型胶原蛋白的免疫组织化学检测为阳性.结论:猪骨髓间充质干细胞在成软骨诱导剂作用下,经体外和体内培养后,可生成组织工程化软骨.