绿色荧光标记重组人偏肺病毒空斑形成滴度测定方法的建立

目的 建立用于绿色荧光标记的重组人偏肺病毒(GFP-rhMPV)空斑形成滴度测定方法.方法 基因组中插入绿色荧光蛋白基因的hMPV全序列cDNA质粒和主要蛋白质表达质粒转入细胞293T后获得感染性重组hMPV.GFP-rhMPV在Vero-E6细胞中连续传代提升病毒滴度并保存.将等倍稀释的重组病毒液接种常规制备的Vero-E6细胞单层,用含或不含胰酶的低熔点琼脂精凝胶覆盖细胞,孵育一定时间后,采用荧光显微镜下计数荧光空斑数和抗原抗体蓝斑形成法计算病毒滴度.结果 感染后3 d,荧光显微镜下GFP-rhMPV可在低熔点琼脂糖凝胶覆盖层下形成分界较为清晰的绿色荧光集落,接种后3 d荧光空斑相对独立,便于计数.蓝斑形成法在感染后第5天蓝斑较大,易观察.此前拯救获得的GFP-rhMPV在宿主细胞Vero-E6中的复制滴度可达1×106 PFU以上.结论 成功建立了GFP-rhMPV的空斑形成实验滴度定量检测方法,为hMPV的致病机制、防治手段研究奠定了基础.     

小鼠人偏肺病毒感染模型的建立

目的 建立人偏肺病毒(hMPV)感染小鼠模型,了解病毒肺内复制规律及所致病理改变,为hMPV感染免疫病理机制研究及新型防治手段开发奠定基础.方法 BALB/c小鼠经滴鼻感染荧光标记的重组hMPV,于感染后1、3、5、7、9、16 d处死小鼠并无菌获取肺组织用于病毒分离和病理检查,改良噬斑形成法检测hMPV滴度,RT-PCR法检测hMPV mRNA表达.结果 小鼠滴鼻感染hMPV后肺组织分离到病毒;肺组织病毒滴度在感染后5 d达到高峰(5.16±1.09)×105PFU/g,感染后第9大仍能检测到病毒(2.79±1.22)×102PFU/g;感染后16 d肺组织仍可检测到hMPV mRNA;病理改变在感染后3～7 d最明显,为典型的间质性肺炎改变.结论 hMPV感染BALB/c小鼠模型建立成功,可用于hMPV感染的免疫病理机制研究.     

携带野生型PTEN基因的腺病毒载体的构建

目的 构建携带野生型PFEN(Phosphatase and tensinhomolog deleted on chromosome ten)基因的腺病毒载体,为研究PFEN功能和作用机制提供手段。方法将野生型PFEN基因克隆入含有绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)基因的pAdTrack-CMV质粒,在含有pAdEasy-1病毒骨架的BJ5183大肠杆菌内进行同源重组;重组子通过脂质体介导转染AD293细胞,并在AD293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒;通过反复感染扩增病毒以达到感染靶细胞的适当滴度,通过GFP表达来监控腺病毒扩增;Western blot检测靶细胞内PFEN蛋白的表达。结果感染腺病毒载体的AD293细胞表达GFP,随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),经过3轮扩增,病毒达到合适的滴度。受腺病毒感染心肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高。结论成功构建了携带PFEN基因的腺病毒载体。     

重组慢病毒表达载体介导HIV-1 Vpr蛋白调控KSHV潜伏感染的初探

目的 利用慢病毒载体系统包装含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒蛋白R(Vpr)的重组慢病毒,使之感染原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1,并检测Vpr蛋白对细胞中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏感染与裂解性复制的影响.方法 从实验室先前构建的重组真核表达质粒pCI-neo-Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen载体中构建成重组慢病毒质粒pHAGE-Vpr,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2及包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,293T细胞培养上清经0.45 μm滤器过滤后即获得重组病毒悬液.慢病毒系列稀释后感染293T细胞,荧光计数法测定病毒滴度,逆转录PCR(RT-PCR)检测Vpr基因在293T细胞中的转录.以感染复数(MOI)为1的病毒量感染靶细胞BCBL-1,荧光显微镜观察靶细胞中GFP的表达,并利用RT-PCR和和免疫印迹(Western blot)技术分别检测Vpr基因在靶细胞中的转录和表达情况,同时检测KSHV裂解期基因复制与转录激活子(Rta)mRNA转录及蛋白表达.结果 经酶切鉴定、核酸序列测定和293T细胞中GFP表达证实成功包装了携带HIV-1Vpr基因的重组慢病毒,滴度为4×107TU/ml.重组慢病毒感染BCBL-1细胞后,细胞中有GFP表达,RT-PCR和Western blot均能够在相应位置检测到目的 基因Vpr的条带,并且Vpr降低了KSHV RtamRNA转录及蛋白表达水平.结论 重组慢病毒介导的HIV-1 Vpr蛋白过表达能够抑制KSHV裂解性复制、增强病毒的潜伏感染.     

大鼠微小RNA miR-16的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的 克隆微小RNA rno-miR-16,构建其慢病毒表达载体pLV-miR-16并包装成慢病毒颗粒,为进一步研究miR-16的功能奠定了实验基础.方法 从大鼠细胞基因组中用PCR 的方法扩增miR-16 的前体,构建了miR-16的重组表达载体pLV-miR-16,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物(pPACK-GAG、pPACK-REV和pVSV)共转染包装细胞293TN细胞,包装产生慢病毒,以293TN细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达水平测定病毒滴度.结果 经PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建携带大鼠miR-16基因重组慢病毒载体.倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293TN呈绿色荧光,并测得108＞ifu/ml.结论 成功构建大鼠慢病毒载体pLV-miR-16,为深入研究rno-miR-16的生物学功能奠定了基础.     

带有GFP标签的汉滩病毒糖蛋白表达载体的构建

目的:构建带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的汉滩病毒(HTNV)包膜糖蛋白(GP)真核表达载体,并进行初步表达鉴定.方法:以peGFP-C1质粒为模板扩增GFP片段,将其插人真核表达载体pFLAG-CMV3中,构建成可表达带有GFP标签分泌型蛋白的载体pFLAG-CMV3-GFP.扩增HTNV-G1、HTNV-G2,分别插入上述载体,转染293T细胞,采用检测GFP标签蛋白的夹心ELISA法检测转染细胞培养上清中分泌型重组蛋白的含量.结果:酶切及测序证实带有GFP标签的HTNV-G1、HTNV-G2表达载体构建成功,分别命名为pFLAG-G1-GFP/pFLAG-G2-GFP,转染细胞的培养上清中可以检测出带有GFP标签的融合蛋白.结论:成功构建了带有GFP标签HTNV-GP的重组质粒并成功表达,为深入研究HTNV感染后机体针对HTNV-GP的特异性免疫应答规律奠定了实验基础.     

小鼠次级淋巴组织趋化因子成熟肽基因/腺相关病毒重组载体的构建

目的 构建含小鼠次级淋巴组织趋化因子(SLC)cDNA的重组腺相关病毒载体。方法 以C57BL/6J小鼠的淋巴组织为材料抽提总RNA，用RT-PCR方法克隆小鼠SLC的成熟肽基因。PCR产物回收后经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，插入pAAV-IRES-hrGFP质粒，用磷酸钙法，与pAAV-RC和pHelper三者共同转染HEK293细胞，包装成重组的病毒颗粒，并通过绿色荧光蛋白(GFP)报告基因荧光检测及抽提病毒DNA，进行PCR扩增等进一步证实重组病毒的形成。结果 约500bp的小鼠SLC成熟肽基因被成功克隆，序列分析表明，所克隆的SLC基因与基因库注册的相同，重组载体的酶切及测序鉴定表明SLC基因被定向插入。重组载体转染HEK293细胞，经荧光显微镜和病毒。DNA的PCR检测，证实已完成对重组病毒的包装，并表达GFP。结论 成功构建了SLC成熟肽基因重组腺相关病毒载体。     

前凋亡因子bimS基因的重组腺病毒载体构建

为探讨前凋亡因子bimS用于肿瘤基因治疗奠定基础,拟构建bimS的重组腺病毒载体。采用RT-PCR方法从人HL-60细胞扩增目的基因bimS;克隆至T载体测序正确。亚克隆bimS基因到腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,形成含目的基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的穿梭载体。穿梭载体pAdtrack-CMV-bimS和病毒骨架载体pAdEasy-1经电穿孔法转入BJ5183大肠杆菌中行同源重组,获得重组pAdEasy-CMV-bimS,线性化后脂质体法转染人胚肾(HEK)293细胞进行病毒的包装、扩增、病毒滴度测定以及瞬时表达的观察;将病毒以MOI=100感染HEK293细胞,western blot检测bimS蛋白表达。结果显示病毒感染293细胞48~72h观察到GFP表达,7d出现典型细胞病变症状(CPE);提取培养上清中病毒DNA,以PCR法可检测到bimS的扩增产物;western blot检测病毒感染的293细胞总蛋白,与未感染的阴性对照细胞相比,bimS蛋白表达明显高于阴性对照细胞。表明重组bimS腺病毒构建成功;为进一步进行肿瘤基因治疗的体内外试验奠定基础。     

趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达**

背景：趋化因子受体7(chemokine receptor-7, CCR7)是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。 目的：构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。 方法：采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7 DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒(重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒     ΔNRF及包膜质粒pVSVG)共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。 结果与结论：实验成功扩增出小鼠CCR7 DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293 FT细胞后,24 h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108 U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。 关键词：趋化因子受体7;未成熟树突状细胞;慢病毒载体;真核表达;组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.01.029     

小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒载体的构建及其沉默效应研究

目的:构建介导小鼠B7-1 基因RNAi 的慢病毒载体,研究其对L929 细胞表面B7-1 分子表达的沉默效应。方法:从小鼠B7-1 基因编码区选择3 段RNA 干扰靶序列,制备转录双发夹RNA 的前体DNA,并克隆至慢病毒穿梭质粒,构建B7-1 的RNAi 慢病毒穿梭载体,测序鉴定。将重组质粒及辅助质粒共转染293T 细胞产生慢病毒,经超速离心获得浓缩慢病毒颗粒。通过测定293T 细胞GFP 表达水平确定病毒滴度,流式细胞术检测感染效率以及对细胞表面B7-1 的干扰效率。病毒感染细胞经嘌呤霉素筛选及克隆培养获得小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒稳定感染的L929 细胞,流式细胞术分析细胞中GFP 及B7-1 分子表达的状况;将感染细胞与分离的小鼠脾脏T 细胞混合培养,分析B7-1 稳定沉默细胞刺激T 细胞增殖的能力。结果:成功了构建小鼠B7-1 基因RNA 干扰的重组慢病毒载体;获得了滴度达(3 ~ 5) 108 TU/ ml 的浓缩重组慢病毒,重组慢病毒可有效感染L929 细胞介导GFP 表达以及沉默其表面的B7-1。经筛选获得慢病毒稳定感染的L929 细胞,该细胞表面B7-1分子表达受到抑制,刺激T 细胞增殖的能力显著下降(P<0.05)。结论:构建了能够高效感染及沉默小鼠B7-1 分子的RNAi 慢病毒载体,该载体可稳定沉默L929 细胞表面B7-1 分子表达,抑制B7-1/ CD28 信号诱导的T 细胞增殖效应。     

Prevalence of human metapneumovirus in hospitalized children with respiratory tract infections in Tianjin,China

Human metapneumovirus (hMPV) has recently been recognized as an important respiratory pathogen, especially in children. At present, our understanding of the characteristics of hMPV from China is very limited. Nasopharyngeal aspirates were taken from 310 hospitalized pediatric patients. Twenty (6.5%) of them were infected with hMPV, and they all developed pneumonia. Sixty five percent (13/20) of the cases were under 12 months. Phylogenetic analysis of F gene fragments indicated that three sub-genotypes of hMPV(A2a/A2b, B1,B2) circulated in Tianjin and A2b was the predominant subtype. The Vero-E6 cell line was better than LLC-MK2 for hMPV isolation. Three hMPV strains were successfully isolated using the Vero-E6 cell line.     

SARS-CoV的培养和灭活条件的研究

目的　研究SARS CoV的大量培养和灭活方法,为制备马抗SARS免疫球蛋白制剂提供安全的病毒。方法　使用SARS CoV感染Vero、Vero E6和2BS细胞株,筛选对SARS CoV较敏感的细胞株和最佳病毒感染量;在2 5℃、33℃和37℃培养条件下,检测SARS CoV的最适培养温度。在室温下,使用1∶2 0 0 0～1∶2 0 0 0 0的β丙内酯浓度灭活SARS CoV ,观察最佳灭活时间和效果。结果　SARS CoV对Vero和Vero E6细胞株比较敏感。在37℃、5 %CO2 孵箱中培养72h ,细胞病变达75 %以上。1∶4 0 0 0的β丙内酯能够完全灭活SARS CoV。将灭活后的病毒液在2℃～8℃作用16h ,37℃水浴2h能够完全使β丙内酯的毒性水解。结论　用Vero或Vero E6细胞培养SARS CoV ,在37℃、5 %CO2 孵箱中培养72h ,病毒滴度最高。用1∶4 0 0 0的β丙内酯浓度加入病毒液中,作用1h能够完全灭活SARS CoV。     

H9N2禽流感病毒反向遗传系统的构建和鉴定

目的 建立H9N2亚型禽流感病毒反向遗传系统,为人禽流感疫苗研制以及传播和致病机制等方面的研究提供技术平台.方法 使用RT-PCR方法获得禽流感H9N2亚型病毒A/Guangzhou/333/99(H9N2)的8条全长基因节段,然后克隆到双表达载体pCI-pol Ⅰ中,获得H9N2禽流感病毒的8个基因节段的8质粒系统.将构建好的8质粒共转染293T细胞后,收获上清接种鸡胚,然后对鸡胚尿囊液进行鉴定;对拯救的病毒进行鉴定.结果 8质粒系统转染293T细胞后可以成功拯救出H9N2禽流感病毒,血凝效价可达到29/50μl,生长特性与野生型病毒类似.结论 成功建立了H9N2禽流感病毒反向遗传系统.     

嵌合人偏肺病毒(hMPV)表位的重组流感病毒免疫保护效果

目的评价重组嵌合表达人偏肺病毒(hMPV)表位的流感病毒的免疫应答及免疫保护效果。方法用8质粒系统拯救出的在NS基因中嵌合hMPV表位的重组流感病毒免疫BALB/c小鼠,检测其刺激机体产生的针对hMPV和流感病毒的抗体滴度,及脾细胞分泌细胞因子含量。免疫后小鼠用hMPV和流感病毒进行攻击,对攻击后小鼠肺组织和鼻甲骨中病毒含量采用数字PCR方法进行测定,同时对肺组织进行HE染色,评价其对肺部损伤的保护作用。结果重组流感病毒株rFLU/hMPV/B(嵌入了hMPV的B细胞表位)免疫小鼠后,产生了针对hMPV和流感病毒的特异性抗体。rFLU/hMPV/CTL+Th(嵌入了CTL表位/Th细胞表位)免疫小鼠后,产生了针对流感病毒的特异性抗体及hMPV特异的细胞毒性T淋巴细胞反应(IFN-γ分泌增多)。rFLU/hMPV/B和rFLU/hMPV/CTL+Th引起了平衡的Th1/Th2免疫应答。用hMPV和流感病毒攻击重组病毒免疫后小鼠,肺组织病理HE染色结果显示重组病毒免疫后小鼠肺病变明显减轻,肺组织和鼻甲骨中hMPV和流感病毒含量也明显减少。结论重组的2株嵌合有hMPV B细胞表位和CTL表位/Th细胞表位的重组流感病毒株,可刺激机体产生针对hMPV和/或流感病毒体液免疫应答,嵌合有hMPV CTL表位/Th细胞表位的重组流感病毒株还可刺激机体产生hMPV特异性的细胞免疫应答,对hMPV和流感病毒攻击也有一定保护作用,该重组病毒株有潜在疫苗应用价值。     

A reverse genetics system for enterovirus D68 using human RNA polymerase I

Human enterovirus D68 (EV-D68) is a highly contagious virus, which causes respiratory tract infections. However, no effective vaccines are currently available for controlling EV-D68 infection. Here, we developed a reverse genetics system to recover EV-D68 minireplicons and infectious EV-D68 from transfected plasmids using the RNA polymerase I (Pol I) promoter. The EV-D68 minireplicons contained the luciferase reporter gene, which flanked by the non-coding regions of the EV-D68 RNA. The luciferase signals could be detected in cells after transfection and Pol I promoter-mediated luciferase signal was significantly stronger than that mediated by the T7 promoter. Furthermore, recombinant viruses were generated by transfecting plasmids that contained the genomic RNA segments of EV-D68, under the control of Pol I promoter into 293T cells or RD cells. On plaque morphology and growth kinetics, the rescued virus and parental virus were indistinguishable. In addition, we showed that the G394C mutation disrupts the viral 5′-UTR structure and suppresses the viral cap-independent translation. This reverse genetics system for EV-D68 recovery can greatly facilitate research into EV-D68 biology. Moreover, this system could accelerate the development of EV-D68 vaccines and anti-EV-D68 drugs.     

利用反向遗传学技术构建H5N9重组流感病毒株

目的 利用反向遗传学技术构建来源人感染禽流感病毒H5N1和H7N9 HA和NA基因的H5N9亚型禽流感病毒.方法 全基因合成A/Beijing/01/2003(H5N1)禽流感病毒HA基因片段和A/Zhejiang/DTID-ZJU10/2013(H7N9)禽流感病毒NA基因片段,插入到pHW2000载体,与携带有A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的6个内部基因的pHW2000重组质粒一起转染293T和MDCK混合细胞,拯救H5N9重组病毒.结果 核酸测序、HA和NA基因转录和表达检测、细胞病变分析确定利用该反向遗传学系统可以成功拯救H5N9病毒.重组H5N9病毒在MDCK细胞上复制增殖能力低于相同方法拯救H1N1病毒.结论 利用反向遗传学技术成功构建一株H5N9重组病毒.