TAP1真核表达载体的构建及其对GES-1细胞HLA-I分子表达的影响

目的:构建抗原加工相关转运蛋白TAP1真核表达载体,并观察其对HLA-I分子表达的影响。方法:采用基因重组技术,构建含人TAP1基因全长的pcDNA3.1/V5-His-TAP1真核表达质粒,并采用细胞转染、RT-PCR、Western blot以及流式细胞术(FCM)观察TAP1转染对胃黏膜上皮(GES-1)细胞HLA-I分子表达的影响。结果:以人外周血单个核细胞总RNA为模板,经RT-PCR反应获得人全长TAP1基因,以pcDNA3.1/V5-HisB为载体,经酶切、连接、转化等基因重组技术,构建了含人TAP1基因全长的pcDNA3.1/V5-His-TAP1质粒,并经测序结果证实。以GES-1作为靶细胞进行转染,经RT-PCR和Westernblot证实,转染后TAP1基因表达明显增加,细胞适于所构建的TAP1质粒的转染。进一步检测了TAP1转染对GES-1细胞HLA-I类分子表达的影响。结果发现,TAP1转染组HLA-A、HLA-B、HLA-C(重链)在mR-NA水平表达明显增加,β2m(轻链)mRNA水平无明显影响。FCM及Western blot检测结果表明,TAP1转染可以上调HLA-I蛋白的表达。结论:成功构建了TAP1真核表达质粒,细胞转染后TAP1表达的增加,可引起细胞表面HLA-I分子表达的相应增加,从而证实了TAP1在HLA-I抗原表达以及抗原递呈途径中的重要作用。     

NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用

目的 探讨NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列,以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构,将这段序列进行酶切并定向克隆入表达载体pEGFP-N3中,构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)载体,将构建的重组质粒经脂质体LipofectAMINETM2000介导瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因GFP.用突变试剂盒将重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt中的NF-κB结合位点缺失突变,将构建的突变重组质粒mpEGFP-N3-NOD2瞬时转染HeLa细胞,观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果 pEGFP-N3-NOD2wt和mpEGFP-N3-NOD2经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功,并且NF-κB结合位点突变成功.细胞转染结果表明,构建的重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下能看到绿色荧光,而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱,与未转染质粒相近.结论 成功构建了含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子的重组质粒和含有NF-κB结合位点缺失突变的重组质粒;NF-κB结合位点突变重组质粒在HeLa细胞巾绿色荧光表达明显减弱,说明NF-κB结合位点在NOD2基因调控中发挥了正调节作用;为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础.     

抗人精浆蛋白单抗κ链基因的克隆及其在HeLa细胞的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白单抗（mAb)κ链基因，并将其转染到HeLa细胞进行表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白mAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA，用RT－PCR法获取κ链cDNA。将其克隆入真核表达载体pcDNA3，用脂质体转染法转染HeLa细胞，并用免疫荧光染色法检测κ链的表达。结果从分泌抗人精浆蛋白的鼠mAb杂交瘤细胞系E4B7中克隆了κ链基因。序列测定表明，Vκ属于鼠免疫球蛋白XⅢ家族。以含κ链基因的真核表达载体pcDNA3-E4B7κ转染HeLa细胞后，在HeLa细胞中检测到了κ链的表达。结论 获得了序列正确的κ链基因，并在HeLa细胞中成功地表达，为进一步构建和表达Fab段打下了良好基础。     

Trim5α对TAB2诱导的NFκB启动子荧光素酶报告基因活性的影响

目的构建人Trim5α的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Trim5α,观察其对TAB2诱导的NFκB启动子荧光素酶报告基因活性的影响。方法提取Hela细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出Trim5α基因编码区全长片段,克隆到5`-Flag-pcDNA3.1(+),经酶切、菌落PCR及测序进行鉴定。转染HEK293T细胞,Western blot检测Trim5α蛋白的表达,双萤光素酶报告基因系统检测Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化的影响。结果经鉴定,成功构建Trim5α表达载体,该载体可在HEK293T细胞中表达Trim5α,Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化无显著影响。结论 Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化未见显著影响,初步建立了Trim蛋白对NFκB报告基因影响的功能筛选平台。     

趋化因子受体CXCR4及CCR5真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的:构建人CXCR4及CCR5真核表达重组质粒,转染人卵巢癌细胞SKOV3,建立稳定转染细胞系并观察其表达效果。方法:从人外周血单个核细胞中提取RNA,采用反转录PCR技术扩增CXCR4及CCR5的基因编码序列,将序列克隆至真核表达载体pEGFP,经酶切和测序鉴定后,应用脂质体转染技术将质粒cancer.pEGFP-CXCR4和pEGFP-CCR5分别导入不表达CXCR4及CCR5蛋白的SKOV3细胞,经G418抗性筛选得到阳性细胞克隆并扩大培养成系。分别采用免疫荧光染色和流式细胞术方法(FCM)检测稳定转染细胞株CXCR4和CCR5的表达。结果:构建了真核表达载体pEG-FP-CXCR4和pEGFP-CCR5;得到了抗G418阳性细胞克隆;免疫荧光染色和FCM检测结果显示,转染质粒的SKOV3细胞表达CXCR4和CCR5。结论:成功建立稳定表达趋化因子受体CXCR4和CCR5的卵巢癌细胞株,为CXCR4和CCR5在卵巢癌中的研究工作提供依据及平台。     

人RUVBL2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建带有绿色荧光蛋白的RUVBL2真核表达载体pEGFP-N1-RUVBL2,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法:以pGADT7-RUVBL2质粒为模板,PCR扩增RUVBL2基因,首先克隆至T载体中,进一步亚克隆至p-EGFP-N1,并对重组表达载体进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒瞬时转染HeLa细胞系,应用荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western blot法检测RUVBL2-GFP融合蛋白的表达。结果:经限制性酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1-RUVBL2载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的HeLa细胞中有绿色荧光蛋白的表达,Western blot法证实转染细胞中能表达RUVBL2-GFP融合蛋白。结论:pEGFP-N1-RU-VBL2表达载体构建成功,并在HeLa细胞内成功表达。     

pcDNA3.1/NF-κB(p65)表达载体的构建及蛋白表达

目的克隆NF-κB(p65)基因,构建真核表达载体pcDNA3.1/NF-κB(p65),并进行体外表达研究。方法提取B16总RNA,RT-PCR扩增出NF-κB(p65)基因片段,并将其克隆到pcDNA3.1载体中进行序列分析,转染到B16细胞中,Real-time PCR和Western-blot检测NF-κB(p65)的抗原性和表达量。结果获得高质量的B16总RNA,RT-PCR扩增出1.65kb的cDNA片段,成功构建了pcDNA3.1/NF-κB(p65)载体,Blast序列分析与GenBank中NM_009045.4完全一致。NF-κB(p65)重组蛋白具有抗原性,其基因和蛋白表达高于B16细胞组和空质粒pcDNA3.1组。结论成功构建pcDNA3.1/NF-κB(p65)表达载体和表达出具有NF-κB(p65)抗原性的重组蛋白。     

CⅡTA基因编码区不同单倍型cDNA的功能研究

目的 研究MHCⅡ类反式激活因子(cⅡTA)基因编码区非同义单核苷酸多态性(SNP)位点C19170G(Leu45Val)和C30799G(Ala500Gly)构成的4种不同单倍型cDNA的功能.方法 将4种不同单倍型的真核表达载体和卒载体分别转染至HeLa细胞.用RT-PCR和间接细胞免疫荧光技术检测未经转染的HeLa细胞、转染4种真核表达载体及卒载体的HeLa细胞cⅡTA mRNA与3种HLAⅡ类分子(HLA-DR、DP、DQ)的表达,并用流式细胞技术对其表达的3种HLAⅡ类蛋白进行定量分析.结果 未经转染和转染空载体的HeLa细胞均尤CⅡTA mRNA和3种HLAⅡ类分子的表达,而转染4种不同单倍型真核表达载体的HeLa细胞均出现CⅡTA mRNA表达,并表达3种HLAⅡ类分子.证实了转染4种不同单倍型真核表达载体后的HeLa细胞3种HLAⅡ类分子表达水平差异无统计学意义(P均>0.05).结论 中国人CⅡTA基因编码区这两个SNP位点的多态性(2个位点氨基酸的改变)不影响CⅡTA反式激活HLAⅡ类基因表达的能力.     

小鼠Trim30α人同源基因的生物信息学筛选及初步鉴定

目的 通过生物信息学方法寻找Trim30α的人同源基因,观察候选Trim蛋白对TAB2诱导的NF-κB荧光素酶报告基因活性的影响.方法 经MEGA4软件对具有RBCC和SPRY结构域的Trim分子行进化树分析,用DNAMAN 6.0软件对候选Trim与Trim30α进行氨基酸序列比对,比较Trim30α相毗邻基因在小鼠和人染色体上的排列分布规律.构建Trim22的真核表达载体,用双萤光素酶报告基因系统检测Trim22对TAB2诱导的NF- κB报告基因活化的影响.结果 Trim30α与人Trim5α.、Trim6、Trim22、Trim34α来自进化树的同一分支节点;Trim22、Trim5α与Trim30α的氨基酸序列同源性分别为42.51％、45.47％;Trim22可以抑制TAB2诱导的NF-κB报告基因的活化,而Trim5α无显著抑制作用.结论 Trim22对TAB2诱导的NF-κB报告基因活化有负向调节作用,可能与Trim30α具有相类似的生物学功能.     

HLA—I分子对B7.1共刺激作用的影响

目的研究HLA-I 分子表达与B7.1分子的共刺激作用的相互关系,以探讨在肿瘤细胞所诱发的免疫排斥反应中共刺激分子对抗原递呈机制的影响.方法通过流式细胞仪(FCM)检测转染共刺激分子B7.1编码基因前后其表面HLA-I分子的表达情况.利用单克隆抗体阻断细胞表面HLA-I分子,以外周血混合淋巴细胞对阻断前后的细胞行杀伤实验.结果表达B7.1的肝癌细胞其表面HLA-I分子表达明显增高(P<0.01),而γ-INF刺激对细胞表面HLA-I分子的表达情况并无影响(P>0.05).T淋巴细胞对转染后细胞的杀伤作用远远大于未转染组(P<0.01),当表面HLA-I分子被阻断后,T淋巴细胞的杀伤效应几乎降至零点.结论转染B7.1后肝癌细胞高表达HLA-I分子,增强抗原提呈作用的同时又表达第二信号-共刺激分子B7.1,从而可诱发更强的免疫排斥反应.     

JNK3抑制NF-κB转录活性的研究

目的研究人c-Jun氨基末端激酶3(c-Jun N-terminal kinases3,JNK3)对核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)转录活性的影响。方法构建人JNK3真核表达载体pcDNA3.1-JNK3,与3×κB-luc报告基因质粒共转染人胚胎肾细胞293(HEK293),分别进行如下处理:共转染50ngpCMV-Myc-p65质粒;转染24h后,加入浓度为10ng/ml的TNF-α或IL-1β刺激6h,收集细胞,检测荧光素酶活性。结果成功构建了pcDNA3.1-JNK3真核表达载体;提高细胞内p65水平,加入TNF-α或IL-1β刺激均可明显激活NF-κB的转录,JNK3对NF-κB的转录活性有明显抑制作用,且随着JNK3转染剂量的增加,抑制作用增强。结论JNK3能明显抑制NF-κB的转录活性。     

rhGH对Jurkat细胞中NF-κB活性的影响

目的:探讨重组人生长激素(rhGH)对Jurkat细胞核因子-κB(NF-κB)信号通路活化的影响.方法:(1)将含荧光素酶报告基因的质粒pNF-κB-luc转染入T淋巴细胞系-Jurkat E6-1细胞中,在培养液中加入梯度浓度rhGH.(2)用梯度浓度rhGH直接刺激Jurkat细胞,然后用RT-PCR方法检测IκBα、IKK1 mRNA表达情况.结果:各浓度rhGH对转染pNF-κB-luc的Jurkat细胞中荧光素酶表达有促进作用,而对IκBα、IKK1 mRNA表达无显著影响.结论:rhGH对PHA活化的T细胞NF-κB的活化有促进作用,而对与NF-κB活化相关的IκBα和IKK1的mRNA表达无显著影响.     

截短型人凋亡诱导因子AIF△1-400对HeLa细胞的促凋亡作用

目的：观察人截短型AIF（AIF△l-400）对HeLa细胞的促凋亡作用。方法：在AIF△l-120基因克隆成功的基础上进一步改造，构建截去AIF基因线粒体定位信号、FAD结合结构域和NADH结合结构域（1～400位氨基酸）编码序列的AIF△l-400基因，将其克隆人pcDNA3真核表达载体，用脂质体法转染HeLa细胞，通过Western blot检测该基因在转染细胞中的表达通过电镜观察截短型分子对肿瘤细胞的具有促凋亡活性。结果：经酶切鉴定与测序证实，AIFAl-400的真核表达载体构建成功。通过Western blot证实截短型基因在HeLa细胞中表达，电镜观察可见转染细胞骨架的破坏和细胞核固缩等凋亡特征。结论：人截短型AIF（AIF△l-400）基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡。     

EGFP-Sam68融合蛋白在HeLa细胞的表达和定位

目的克隆有丝分裂Src相关蛋白p68(Sam68)基因cDNA全长,构建Sam68真核绿色荧光蛋白表达载体,并确定其在HeLa中的表达和定位。方法提取HeLa细胞总RNA,RT-PCR扩增Sam68基因片段,经酶切鉴定及测序正确后,克隆到真核绿色荧光蛋白表达载体(pcDNA3.0-EGFP)上,并转染HeLa细胞,Western blot法检测Sam68表达,免疫荧光细胞化学染色观察其细胞定位。结果酶切和测序证实Sam68正确插入pcDNA3.0-EGFP载体中,且载体正确表达了EGFP-Sam68融合蛋白,该蛋白定位在HeLa细胞核内。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-EGFP-Sam68。     

以HBc颗粒为载体的真核表达载体pcDNA3.1-HBcNheⅠSpeⅠ的构建

目的构建含乙肝核心C基因的真核表达载体pcDNA3.1-HBc^NheⅠSpeⅠ,为预防性及治疗性表位疫苗的研制打下基础.方法采用分子克隆技术在原核表达质粒pTrc-core的HBcAg e1-loop及e2-loop内分别添加NheⅠ及SpeⅠ酶切位点,双酶切此重组载体pTrc-core ^NheⅠSpeⅠ及真核表达载体pcDNA3.1,产物经纯化、连接,构建成真核表达质粒pcDNA3.1-HBc^ NheⅠSpeⅠ,并通过酶切、PCR及测序对该质粒加以鉴定.为了证实质粒pcDNA3.1-HBc^NheⅠSpeⅠ作为表达载体的可行性,实验中以GFP为报告基因,利用基因重组技术在该质粒的基础上构建了真核表达质粒pcDNA3.1-HBc-GFP,并将其转染HeLa细胞,共聚焦显微镜观察HeLa细胞内绿色荧光蛋白的表达情况.同时将质粒pcDNA3.1-HBc-GFP转化大肠杆菌JM109,密度梯度离心回收并纯化其表达产物HBcAg-GFP,电镜下观察其成颗粒性.结果酶切、PCR及测序结果均与预期结果相符,共聚焦显微镜下观察到HeLa细胞内绿色荧光蛋白的成功表达.电镜下观察到重组蛋白HBcAg-GFP为颗粒性蛋白.结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-HBc ^NheⅠ SpeⅠ,该载体可作为治疗性及预防性DNA疫苗的候选载体,为深入研究预防性及治疗性表位疫苗提供了资料.     

TRBP及其截短体真核表达载体的构建与表达

目的:构建TRBP及其截短体真核表达载体, 并检测其在HeLa细胞中的表达.方法:设计引物扩增TRBP全长及其截短体TAB、 TAC、 TBC基因序列, 然后将各基因片段克隆入真核表达载体pFlag-CMV4.用脂质体法转染HeLa细胞, 经 Western blot方法检测目的基因在转染细胞中的表达.结果:经过酶切鉴定与测序证实, TRBP全长及其截短体TAB、 TBC、 TAC基因真核表达载体构建成功, 经Western blot可检测转染细胞中各基因的表达.结论:成功构建了TRBP全长基因及其截短体TAB、 TAC和TBC基因真核表达载体, 在转染细胞中可以检测到目的基因的表达.     

截短型人凋亡诱导因子AIF1-400对HeLa细胞的促凋亡作用

目的:观察人截短型AIF(AIF△1-400)对HeLa细胞的促凋亡作用。方法:在AIF△1-120基因克隆成功的基础上进一步改造,构建截去AIF基因线粒体定位信号、FAD结合结构域和NADH结合结构域(1～400位氨基酸)编码序列的AIF△1-400基因,将其克隆入pcDNA3真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,通过Western blot检测该基因在转染细胞中的表达通过电镜观察截短型分子对肿瘤细胞的具有促凋亡活性。结果:经酶切鉴定与测序证实,AIF△1-400的真核表达载体构建成功。通过Western blot证实截短型基因在HeLa细胞中表达,电镜观察可见转染细胞骨架的破坏和细胞核固缩等凋亡特征。结论:人截短型AIF(AIF△1-400)基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡。     

靶向hTERT RNA干涉促进人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究

目的：利用RNA干涉技术抑制肿瘤细胞端粒酶表达，探讨其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。方法：将成功构建的针对hTERT的siRNA(small interferencing RNA)表达载体转染HeLa细胞，通过透射电镜、免疫印迹和流式细胞术(FCM)等方法检测人宫颈癌HeLa细胞的凋亡情况。结果：构建的siRNA表达载体可以诱导HeLa细胞发生凋亡。结论：针对人端粒酶逆转录酶的siRNA表达载体稳定转染HeLa细胞，可诱导HeLa细胞发生凋亡。     

p62参与柳氮磺吡啶抑制NF-κB信号途径和诱导人神经胶质瘤U251细胞凋亡机制的研究

<正>目的:以人神经胶质瘤U251细胞为研究对象,从p62参与核转录因子κB(NF-κB)信号途径活化角度,探讨柳氮磺吡啶(SAS)抑制NF-κB信号途径和诱导U251细胞发生凋亡的机制。方法:构建p62 siRNA表达载体,MTT法检测细胞生存率,萤光素酶报告基因分析检测NF-κB转录活性,Western blotting法和间接免疫荧光法检测细胞自噬、凋亡。结果:SAS抑制U251     

跨膜型肿瘤坏死因子-α胞内段基序稳定表达细胞株的建立及功能研究

目的 建立高表达跨膜型肿瘤坏死因子-α胞内段(TNF-intracellular domain,TNF-ICD)基序的人乳腺癌MCF-7细胞株,为研究TM-TNF-α的反向信号提供工具.方法 采用脂质体介入法将含人TNF-ICD的pIRES2-EGFP病毒载体导入MCF-7中,经鉴定、筛选获得能稳定表达TNF-ICD细胞株.采用MTT法检测转染细胞对TNF-α的敏感度,比色法检测NO含量,ELISA方法 检测NF-κB的活性.结果 TNF-ICD基因转染入MCF-7细胞后表达在细胞膜上,并能提高该细胞NF-κB活性,抵抗TNF-α的杀伤,增加其NO产生;应用NF-κB抑制剂PDTC处理后能恢复该细胞对TNF的敏感性.结论 获得稳定表达TNF-ICD的MCF-7细胞株,TNF-ICD可能作为TM-TNF-α细胞内的一段活化基序参与TM-TNF-α的反向信号,并通过活化NF-κB,抵抗可溶性TNF-α介导的细胞毒作用,增加NO的产生.