刚地弓形虫P30（SAGl）基因的克隆与表达

目的 构建弓形虫P30基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法 将弓形虫P30基因的开读框用PCR扩增，NcoⅠ和Hind Ⅲ酶切后，与同样酶切的表达质粒pET-30a( )经T4连接酶连接，然后转化到DH5a中。菌液经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后，将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导，表达产物用SDSPAGE和Western blot进行鉴定。结果 扩增的P30基因片段为750bp，重组质粒诱导表达产物分子质量单位为30ku，与理论值相符。Western blot确认重组质粒表达蛋白与小鼠抗弓形虫单克隆抗体(P30McAb)发生特异性反应。结论 成功构建重组体并获得弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

刚地弓形虫P30(SAG1)重组抗原的高效表达和体外纯化(英文)

目的表达和纯化弓形虫P30(SAG1)蛋白,为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制奠定基础。方法PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增P30基因片段,P30产物克隆到表达质粒pET-30a(+)构建重组载体,将其转化到DH5α中。经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。大量的诱导表达产物用SNBC3S NTA Resin方法纯化并进行复性。结果扩增的P30基因片段为750bp,重组表达融合蛋白量单位为30ku,与理论值相符。结论成功构建重组体,获得纯化和复性的弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

编码刚地弓形虫棒状体蛋白2与主要表面抗原1基因的克隆和表达

目的 构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2（ROP2）和主要表面抗原1的重组表达质粒，纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段，分别克隆人pMDl8-T载体，并对重组人外源基因的质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定，将pMD-ROP2中RoP2基因片段经EcoRI和HindⅢ酶切、连接等反应，亚克隆入pET-30a（＋）原核表达载体，构建pET-ROP2载体，然后再将pMD-P30中的P30基因片段与经同样NcoI和EcoRI酶切的pET-30a（＋）载体连接，经含卡那霉素的LB平板筛选，酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后，用Westernblot分析。结果 从弓形虫RH株DNA中扩增出特异的RoP2和P30基因片段，成功克隆出pET-ROP2和pET-P30载体。结论 成功构建了pET-ROP2和pET-P30重组体，获得纯化和复性的弓形虫ROP2和P30的高效表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

刚地弓形虫ROP2-P30复合基因在E.coliBL21中的表达和鉴定(英文)

目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR.,双酶切和测序鉴定,将pMD ROP2中的ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切,连接等反应,亚克隆入pET30a(+)原核表达载体构建pET ROP2载体,然后再将pMD P30中的P30基因片段与经BglⅡandEcoRⅠ酶切的pET ROP2载体连接,构建pET ROP2P30载体,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Westernblot分析。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功构建成pET ROP2和pET ROP2P30载体,成功表达了弓形虫棒状体蛋白2和弓形虫棒状体蛋白与主要表面抗原1的融合复合蛋白,表达出的蛋白经纯化复性后具有免疫反应性。结论ROP2和P30基因重组后,在原核表达载体中表达出的蛋白经纯化复性后具有活性,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和ROP2P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

编码弓形虫表面抗原P30基因的克隆及在E.coli中的表达

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因重组表达质粒 ,初步观察P30基因在E coli表达。方法　将P30基因定向克隆到分支杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒热休克蛋白 70 (hsp70 )起动基因的下游的多克隆位点 ,构建重组表达质粒pBCG -P30 ;采用亚克隆技术 ,将含P30和hsp70起动基因的复合片段 ,插入表达载体 pBK -CMV质粒 ,转化大肠杆菌DH5α ,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒 pBK -P30转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SDS -PAGE和Westernboltting分析。 结果　 1)阳性重组质粒 pBCG -P30、pBK -P30经酶切和PCR鉴定 ,与预期的结果相符合。 2 )序列测定证实克隆的基因为编码P30抗原的基因。 3)P30基因在大肠杆菌诱导表达后获得4 5kDa融合蛋白 ,此抗原未被弓形虫高免兔血清识别。结论　成功构建编码弓形虫表面抗原P30重组表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得表达 ,为弓形虫DNA疫苗的研制奠定基础     

弓形虫ZS2株抗原基因的扩增及克隆

扩增弓形虫ZS2株P30抗原基因,构建PcDNA3—P30真核表达重组质粒。方法本文采用PCR技术,自行设计一对寡核苷酸引物（P1,P2）,从弓形虫ZS2基因组DNA中特异扩增出编码P30抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用EcoRI和Hind双酶切后,克隆到真核表达质粒pcDNA3中,转化入大肠杆菌TG1,用氨共青霉素和PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子用EcoRI和Kind双酶切鉴定。结果从弓形虫ZS2株DNA中扩增出1025bP的P30基因,构建重组质粒PcDNA3—P30,酶切产物的大小分别与预期相符。结论成功地对弓形虫ZS2株P30基因进行体外扩增及构建真核表达重组质粒PcDNA3—P30,为重组P30抗原及核酸疫苗研究做好准备。     

弓形虫表面抗原SAG2基因的克隆表达纯化及鉴定

目的构建弓形虫表面抗原2(SAG2)基因重组质粒并在大肠埃希菌中表达。方法根据SAG2基因序列设计并合成引物,用PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因片段,再克隆到p GEX-4T载体中,构建重组质粒。重组质粒经酶切鉴定并测序后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blotting分析其反应原性。结果 SAG2基因PCR产物大小约为561 bp,与预期相符。重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的SAG2融合蛋白分子量约为47 ku,该蛋白可被GST标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫SAG2基因,表达蛋白具有反应原性。     

弓形虫蛋白激酶C受体1蛋白的表达与抗原性分析

目的构建弓形虫蛋白激酶C受体1基因的pET-30a（＋）-RACK1重组质粒,表达、纯化RACK1蛋白。方法PCR扩增RACK1基因的cDNA序列,用SacI、NcoI限制性内切酶对RACK1基因的PCR产物及pET-30a（＋）质粒进行双酶切,连接,转化大肠杆菌BL21,构建重组质粒。IPTG诱导表达,亲和层析柱纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析鉴定。结果PCR扩增出 966 bp的RACK1完整基因序列,成功构建RACK1基因的pET-30a（＋）-RACK1重组质粒,表达出约36kDa的RACK1蛋白,蛋白具有抗原性。结论成功构建弓形虫RACK1基因的pET-30a（＋）-RACK1重组质粒,纯化出RACK1蛋白,为进一步进行RACK1蛋白在弓形虫入侵分子机制中的作用研究奠定基础。     

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA7基因的重组、表达及鉴定

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达。方法根据GRA7基因序列设计合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因片段,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经酶切、PCR鉴定并测序;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析并纯化,Western blot分析其反应原性。结果 GRA7基因PCR产物大小约为714bp,与预期相符;重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA7融合蛋白分子质量单位约为53ku,该蛋白可被His标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫GRA7基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础。     

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1融合基因的克隆与表达

目的 进行弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（P30）融合基因的克隆与表达，为弓形虫ROP2?鄄P30基因工程复合抗原的制备做准备。 方法 半套式PCR扩增编码弓形虫P30的基因片段，克隆至已构建成功的重组质粒pUC119/ROP2中，经PCR和酶切鉴定正确的重组质粒pUC119/ROP2-P30再以SacⅠ/HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET28b上，鉴定正确的重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠埃希菌表达菌株BL21-Codon Plus（DE3）-RIL，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。 结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出700 bp P30基因片段，成功构建重组质粒pET28b/ROP2-P30，该质粒经PCR和酶切鉴定，与预期结果一致，并在大肠埃希菌中高效表达，产生相对分子质量（Mr）约为 69 000的重组目的蛋白。 结论 弓形虫ROP2和P301融合基因克隆成功，并表达出预期的复合重组蛋白ROP2-P30。     

模拟抗原表位基因测定及合成多肽的血吸虫病诊断价值的研究

目的测定能用于血吸虫病诊断及疗效考核的噬菌体展示肽基因序列,研究合成多肽抗原的血吸虫病诊断价值.方法扩增目的噬菌体,制备和纯化噬菌体DNA,对目的噬菌体中外源性肽的基因序列进行测定和演绎氨基酸序列分析.根据血清反应强度和演绎氨基酸序列选择2个噬菌体的展示肽段进行人工多肽合成.以合成的多肽为抗原,建立血吸虫病诊断方法,检测急、慢性血吸虫病人血清,观察方法的敏感性及特异性;同时检测治疗前及治愈后的血吸虫病人血清,观察该合成抗原的血吸虫病疗效考核价值.结果测定了14个噬菌体展示外源肽的基因序列,序列分析表明,其中有6个噬茵体的外源肽基因序列完全相同,其余8个噬菌体展示肽的基因序列不相同.分析演绎氨基酸序列,发现1个噬菌体展示肽中的3个连续的氨基酸(GVK)残基与血吸虫23 kDa分子氨基酸残基相同.合成多肽抗原检测急、慢性血吸虫病人血清,敏感性分别为92.3%和91.1%,与华支睾吸虫病人血清的交叉反应率为7.5%,检测健康人血清,特异性为95.5%.检测治愈后0.5年的同一病人血清,阴转率为55.3%,治愈后1年的病人血清中IgG抗体的阴转率为63.2%.结论 9个具有血吸虫病诊断价值的噬菌体展示表位的基因序列被确定,并证明了合成多肽抗原有较好的血吸虫病诊断及疗效考核价值.     

钉螺3种酶的酶谱分析

本研究用淀粉凝胶同工酶电泳法比较了安徽及云南两省的钉螺的酸性磷酸酶（ＡｃＰ，ＥＣ３．１．３．２）、过氧化物酶（Ｐｏ，ＥＣ１．１１．１．７）及酯酶（Ｅｓｔ，ＥＣ３．１．１．１）的电泳带型。ＡｃＰ及Ｐｏ的同工酶中ＡｃＰ１、ＡｃＰ２及Ｐｏ１、Ｐｏ２由单态位点编码。Ｅｓｔ的同工酶由４个位点编码，其中Ｅｓｔ３在安徽的钉螺中为１条电泳快带，相对迁移率（Ｒｆ）为０．３６２±０．０２７；在云南的钉螺中为１条电泳慢带，Ｒｆ为０．３４０±０．０３６。     

骨代谢指标测定在骨质疏松诊治中的应用价值

目的 比较妇女绝经前后骨代谢指标的变化，研究各指标在骨质疏松症治疗后的变化率，对各指标在骨质疏松症诊治中的应用作出初步评价。方法 48例绝经前妇女、48例绝经后妇女测定10项骨代谢指标．45例绝经后骨质疏松症患者．治疗前、治疗6个月后分别测定10项骨代谢指标，观察其变化率。12名绝经后妇女，每两个月测定10项骨代谢指标。共观察一年。结果 绝经后妇女骨代谢指标明显升高，绝经后骨质疏松症患者经抗吸收治疗后．大部分骨代谢指标明显降低，血清骨形成指标比尿骨吸收指标长期个体内的变异要小。结论 绝经后骨质疏松症患者骨转换加快，部分血清骨代谢指标优于尿骨代谢指标，尤以血清骨形成指标N—mid骨钙素和血清骨吸收指标CTX为优。     

EVOLUTION OF FITNESS, V. RATE OF EVOLUTION OF IRRADIATED POPULATIONS OF Drosophila

Measurable evolution occurs in laboratory populations of Drosophila under strong natural selection. The rate of adaptation to the experimental environment is significantly greater in populations with genetic variability increased by radiation than in the control, nonirradiated populations.     

内镜下Oddi括约肌测压的临床意义

为观察胆石症、胆囊切除术后等胆系疾病及功能性消化不良（ＦＤ）、糖尿病胃轻瘫（ＤＧＰ）等非胆系疾病Ｏｄｄｉ括约肌（ＳＯ）功能变化，通过内镜采用灌注式高分辨多道胃肠功能测定仪，对１５例胆系疾病患者、１３例非胆系疾病患者进行Ｏｄｄｉ括约肌测压。结果显示，胆系疾病组的胆总管压力、ＳＯ基础压及蠕动波振幅明显高于非胆系疾病组（６．８６±０．６３ｋＰａ与１．２７±０．１０ｋＰａ，Ｐ＜０．０１；７．３１±０．９５ｋＰａ与１．８７±０．１６ｋＰａ，Ｐ＜０．０１；３２．００±１．２ｋＰａ与２４．１４±１．５ｋＰａ，Ｐ＜０．０５）；同时，非胆系疾病组的十二指肠压、ＳＯ蠕动频率及间期较胆系疾病组明显降低、减慢及延长（１．４２±０．２６ｋＰａ与０．３０±０．１０ｋＰａ，Ｐ＜０．０１；３．６±１．２次／分与２．２±０．４次／分，Ｐ＜０．０５；７．４±１．２秒与１１．０±１．８秒，Ｐ＜０．０５）。结果显示，无论是胆系疾病还是ＦＤ及ＤＧＰ等非胆系疾病均有ＳＯ功能紊乱，但表现形式相反，对指导临床诊断与治疗有一定价值。     

法乐氏四联症右室流出道心肌细胞超微结构立体定量学研究

本文对法乐氏四联症右室流出道心肌细胞进行形态立体定量学研究。结果表明,法乐氏四联症组右室心肌细胞呈肥大及退行性改变,细胞横径大于20μm,肌原纤维体密度小于对照组(P<0.001),线粒体散密度增加(P<0.001)。但体积缩小,肌浆网体密度及表面密度显著增加(P<0.01)。法乐氏四联症右室心肌细胞功能异常可能与其收缩单元的减少、细胞能量代谢失调及兴奋—收缩耦联障碍有关。