结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6-CFP10的融合表达及纯化

目的在原核表达系统融合表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6和培养滤液蛋白CFP10的融合蛋白(rE6C)并纯化,测定抗原性和特异性。方法用将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c(﹢)中,构建pET32c(﹢)-linker。PCR法扩增ESAT-6、CFP10基因。将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c(﹢)的linker前,CFP10克隆入linker后,构建E6C融合基因,转化大肠杆菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠杆菌BL21中表达,纯化rE6C蛋白,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测其抗原性和特异性。结果重组质粒pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。携带重组质粒的菌株经诱导产生高水平的表达产物,纯化的表达产物具备较高的纯度、抗原性和特异性。结论pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达,rE6C融合蛋白具有良好的抗原性和特异性,有望用于结核分枝杆菌感染的临床诊断。     

结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药相关蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段;通过pET28a构建表达载体pET28a-pncA,序列测定证实正确后转化大肠埃希菌DH10b,经IPTG诱导表达His-吡嗪酰胺酶融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白。结果扩增出结核分枝杆菌pncA基因并构建了具有正确基因序列的质粒载体pET28a-pncA,转化大肠埃希菌BL21后经诱导产生了分子质量单位约20ku的表达产物,并得到纯化的带His标签的目的蛋白。结论构建了结核分枝杆菌pncA基因原核表达质粒,并诱导表达了His-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT51在原核表达载体中的克隆、表达、纯化与鉴定

目的对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT51的基因进行克隆,表达,纯化与鉴定,为核酸疫苗的研制与应用打下基础。方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR法对编码MPT51蛋白的抗原基因进行扩增,产物克隆到表达载体pET22b中,构建了含mpt51的重组质粒,将此重组质粒先转化到E.coliXLI-Blue内提取质粒,酶切及测序鉴定,再转化入E.coliBL21(DE3)PLysS菌株内,以IPTG进行诱导后,破菌,离心,包涵体经尿素变性溶解后用His·Bind亲和层析柱纯化,透析复性,纯化后蛋白进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行特异性免疫检测。结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有蛋白表达,所表达的蛋白质相对分子质量为27800,抗体检测有特异条带,大小为27.8kDa。结论目的基因克隆到了表达载体内并证明表达,重组结核杆菌分泌蛋白MPT51的成功表达为核酸疫苗的研制与应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增结核杆菌ESAT-6基因,并构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-ESAT-6和重组耻垢分枝杆菌。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌ESAT-6基因,克隆入pGEMT载体。然后,构建亚克隆ps3000-ESAT-6大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将ESAT-6基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌(Mycobacteri-umsmegmatis mc~2155)中,热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察ESAT-6蛋白的表达,Western blotting鉴定其生物学活性。结果成功扩增了结核杆菌ESAT-6基因;正确构建穿梭质粒ps3000-ESAT-6,用pET表达系统ESAT-6纯化蛋白免疫小鼠的多抗血清通过Western blot证实了该重组耻垢杆菌中有表达并具有生物学活性。结论ESAT-6重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达ESAT-6蛋白的重组BCG(BacilliCalmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌早期分泌抗原ESAT-6的高效表达及其在结核分枝杆菌特异细胞免疫检测中的应用

目的 获得纯化的MTB早期分泌抗原ESAT-6,并对其抗原性及在MTB特异性细胞免疫检测中的应用价值进行评价.方法 采用基因工程技术表达MTB ESAT-6蛋白,通过Western blot法分析ESAT-6与特异性抗体的反应性.以纯化ESAT-6为抗原,用酶联免疫斑点技术(Elispot)检测肺结核患者、健康医务工作者、自然村居民外周血γ-干扰素的应答水平,同时与用于隐性结核感染及结核病诊断的QFT-G检测法进行平行比较,对其在MTB感染细胞免疫检测中的应用价值进行评价.结果 成功表达和纯化了 ESAT-6重组蛋白,所表达的蛋白能被特异性抗ESAT-6抗体识别,同时与肺结核外周血单核细胞反应,刺激后者产生γ-干扰素.Elispot技术检测肺结核患者、健康医务工作者、自然村居民的阳性率分别为36/49(73.5%)、11/62(17.7%)、17/194(8.8%),同时用QFT-G法对肺结核患者和健康医务工作者进行检测阳性率分别为38/49(77.6%)、14/58(24.1%),两种检测方法比较敏感度(73.5%,77.6%;χ2=0.381,P>0.05)和特异度(82.3%,75.9%;χ2=0.406,P>0.05),差异无统计学意义.结论 利用pET原核表达系统可成功地表达和纯化MTB ESAT-6重组蛋白,以ESAT-6为抗原建立的Elispot外周血IFN-γ检测技术与QFT-G的特异性和敏感性相当,可用于结核病的辅助诊断.     

结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析

目的构建结核分枝杆菌rv1837c．rv3803c基因原核表达重组质粒,进行表达、纯化,并分析其免疫原性。方法PCR扩增结核分枝杆菌H37Rvrv1837c．rv3803c基因,并克隆入pTA2质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a（＋）质粒,构建pET30a（＋）：rv1837c．pET30a（＋）：rv3803c重组体。然后转化人表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）,经0．4mmol／L异丙基硫代-β—D-半乳糖苷诱导1分别与组氨酸标签单克隆抗体及结核患者血清进行Western—blot,鉴定Rv1837c、Rv3803c重组蛋白。经镍离子螯和氮川乙酸一组氨酸标签亲和树脂纯化,将纯化的重组蛋白分别免疫家免,取兔血清与纯化蛋白通过Western-blot方法,检测家兔血清中的抗体。结果pET30a（＋）：rv1837c．pET30a（＋）：rv3803c重组体表达相对分子质量为92000及38000的重组蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量分别占全菌蛋白质的30％及50％。获得纯度为90％的重组蛋白。纯化蛋白通过Western-blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a（＋）：rv1837c,pET30a（＋）：rv3803c,并获得Rv1837c及Rv3803c重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。     

结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达、纯化与鉴定

目的构建结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）RpfA的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出编码RpfA蛋白的Rv0867c基因,通过克隆载体pMD18-T构建质粒载体pMD18-T-Rv0867c。经酶切和DNA序列测定证实正确后,将Rv0867c基因克隆到pET32a（＋）载体并在大肠杆菌BL21中诱导表,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致。Western-blot结果显示,在相对分子量约102 kDa处有分别与Anti-His单抗、Rpf结构域单抗和TB病人血清特异性结合带。结论成功表达、鉴定和纯化了RpfA蛋白。     

结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp70在原核表达载体中的克隆表达与鉴定

目的对结核分枝杆菌的一种热休克蛋白Hsp70基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达。方法以结核杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因Hsp70进行扩增,产物与载体质粒pET-22b(+)构建表达Hsp70的重组质粒,将此重组质粒先转化到E.coliDH5α内提取质粒,酶切鉴定,再转化入表达宿主E.coliBL21(DE3)PlysS菌株内,对转化菌株以IPTG进行诱导后,破菌,离心,上清进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫印迹分析。结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白,所表达的蛋白质相对分子质量为70 000,抗体检测有特异带大小为70kDa。结论成功进行了结核杆菌分泌热休克蛋白Hsp70基因的克隆表达。     

结核分枝杆菌MPT-64分泌蛋白在原核表达载体中的克隆,表达与鉴定

目的　对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT - 6 4基因进行克隆 ,鉴定与表达 ,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法　以结核杆菌H3 7Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR法对基因MPT - 6 4进行扩增 ,产物与载体质粒pGEX - 4T - 1构建表达MPT - 6 4的重组质粒 ,将此重组质粒先转化到E coliDH5α内抽提质粒 ,酶切检验 ,再转化入表达宿主E coliBL2 1(DE3)PLysS菌株内 ,对转化菌株以IPTG进行诱导后 ,破菌 ,离心 ,上清进行SDS -PAGE ,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫染色 ,一抗为结核分枝杆菌菌株H37Rv羊抗阳性血清。结果　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,所表达的蛋白质相对分子质量为 5 0 0 0 0 ,抗体检测有特异带大小为 5 0kDa。结论　目的基因克隆到菌株内 ,重组结核杆菌分泌蛋白MPT - 6 4的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-ESAT6的融合表达及纯化

目的　融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B ESAT6 ,为结核病的预防提供有效亚单位疫苗。方法　设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)的方法从结核分枝杆菌毒株H3 7Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与PGEM T easy载体连接测序。将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入PPROEXHT表达载体 ,挑选出阳性克隆 ,将诱导的表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,同时与含6个组氨酸 (histidine 6×his)的单克隆抗体 (monoclonalantibody ,mAb)进行固定化蛋白质免疫学测定(Western blot) ,将用含Ni 鳌合剂的Ni NTA亲合柱纯化的表达产物免疫小鼠 ,用结核分枝杆菌培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins ,CFP)作为抗原 ,酶联免疫吸附试验 (enzyme linkedimmunosorbentassay ,ELISA)测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。结果　PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与基因文库 (GenBank)报道的完全一致。两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物约为 370 0 0 ,与预计大小相吻合。Western blot结果显示 ,在相对分子量约 370 0 0处有表达产物与 6×hismAb特异性结合带。表达产物为包涵体 ,通过Ni NTA纯化系统 ,可得到纯化的目的蛋白。Ag8     

结核分枝杆菌glcB基因原核表达质粒的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌glcB基因原核表达工程株,并进行表达、纯化。方法用PCR 扩增结核分枝杆菌glcB基因, 并克隆入pTA2质粒。测序正确后, 再亚克隆入pET30a(+)质粒, 构建pET30a(+):glcB重组体,转化宿主菌大肠埃希菌BL21 (DE3)。结果结核分枝杆菌glcB基因工程株经0.4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,表达出相对分子质量为92kD重组蛋白。SDS-PAGE 分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中, 表达量占全菌蛋白质的50％。经Ni-NTA 柱纯化,获得纯度为90%的重组蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌glcB基因工程表达株,并获得GlcB重组蛋白, 为研究新型血清学诊断活动性结核病奠定了基础。     

结核分枝杆菌glcB基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆glcB基因原核表达载体,并进行表达,纯化。方法用PcR扩增结核分枝杆菌glcB基因,并克隆入pTA2质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a（＋）质粒,构建pET30a（＋）：glcB重组体。结果以重组体转化BL21（DE3）后,经0．4mM异丙基硫代-β．D．半乳糖苷（IPTG）诱导,表达出分子量为92KD重组蛋白。SDS—PAGE分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量占全菌蛋白质的50％。经Ni-NTA柱纯化,获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：glcB,并获得GIcB重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。     

结核分枝杆菌热休克蛋白HtpG基因的原核表达与鉴定

目的 克隆并表达结核分枝杆菌 ＨｔｐＧ 分子，并鉴定其免疫反应性。 方法 采用聚合酶链式反 应扩增结核分枝杆菌 Ｈ３７Ｒａ ＨｔｐＧ 基因，并克隆至 ｐＥＴ２２ｂ 质粒，测序筛选到重组成功的质粒。 重组质粒 ｐＥＴ２２ｂ － ＨｔｐＧ 转化大肠埃希菌 ＢＬ２１（ＤＥ３），表达的 ＨｔｐＧ 重组蛋白通过镍柱纯化。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定表达 蛋白，并使用 ＨｔｐＧ 重组蛋白经 ＥＬＩＳＡ 法检测肺结核患者血清特异性抗体水平。 结果 成功构建了 ｐＥＴ２２ｂ － ＨｔｐＧ 重组质粒； 在大肠埃希菌中表达出分子质量约 ７３ｋＤａ 的重组蛋白。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定该重组蛋白具 有良好免疫反应性，ＥＬＩＳＡ 法检测肺结核患者血清中存在特异性抗 ＨｔｐＧ 抗体。 结论 在大肠埃希菌内成功 表达 ＨｔｐＧ 重组蛋白，为将该蛋白用于结核免疫诊断试剂的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6抗原真核表达质粒的构建及其免疫原性

目的构建结核分枝杆菌抗原ESAT-6的真核表达质粒,并研究其免疫原性.方法采用聚合酶链反应（PCR）方法自结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增esat-6基因片段,定向亚克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-esat-6重组质粒;利用脂质体介导的转染技术,将其导入Vero E6细胞,RT-PCR法检测mRNA表达情况,Western-blot法鉴定表达产物;重组质粒经基因枪免疫小鼠后,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清抗ESAT-6特异性抗体以及小鼠脾淋巴细胞培养上清液干扰素-γ（IFN-γ）含量.结果成功构建了真核表达重组质粒pVAC-esat-6,并可在VeroE6细胞中表达;重组质粒免疫小鼠3次后,抗体滴度达到了1：1600,重组质粒组（pVAC-esat-6组）小鼠脾淋巴细胞培养上清液IFN-γ水平明显高于对照组（pVAC组）（P＜0.01）.结论成功构建结核分枝杆菌抗原ESAT-6的真核表达质粒pVAC-esat-6,免疫小鼠后诱导产生了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体并进行表达、纯化.方法 用PCR扩增结核分枝杆菌mpt51基因,并克隆入pTA2质粒.测序正确后.再亚克隆人pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):mpt51重组体.结果 以pET30a(+):mpt51转化BL21(DE3)后.经0.4 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,重组菌表达出相对分子质量为38 000的重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导4小时重组蛋白的表达量最高.表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中.表达量占全菌蛋白质的30%.经Ni-NTA树脂纯化,获得纯度为90%的重组蛋白.结论 成功地构建原核表达载体pET30a(+):mpt51,并获得MPT51重组蛋白.为血清学诊断活动性结核病奠定了基础.     

结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M.tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增MTB rv3873基因，并克隆入pGEM-T Easy质粒。测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5α和BL21（DE3）菌后，经0．4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导，pET30a（＋）：rv3873表达出分子量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的50％，Western blot证实其具有良好的抗原性。经Ni—NTA柱纯化，获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873，并获得PPE68重组蛋白，为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。