敲低线粒体转录因子A (TFAM)通过增强IL-6表达促进人前列腺癌细胞去势抵抗性增殖

目的 探索线粒体转录因子A (TFAM)表达下调对前列腺癌细胞去势抵抗性增殖的影响及其机制.方法 免疫组织化学染色法检测前列腺癌组织TFAM的表达,分析TFAM在雄激素抵抗性前列腺癌和雄激素敏感性前列腺癌组织中的表达差异及其对雄激素抵抗性前列腺癌进展的影响.采用小干涉RNA (siRNA)敲低雄激素敏感性LNCaP前列...     

富含亮氨酸重复序列的结合蛋白1的研究进展

富含亮氨酸重复序列相互作用蛋白1 (LRRFIP1)是一种转录抑制因子,存在于多种动物和人的组织细胞中,在表皮生长、肿瘤及脑血管病中表达明显升高,具有转录抑制作用、参与信号通路调控及参与血小板细胞骨架的组成部分,也是miRNA调节的靶基因,并起着重要作用.对LRRFIP1的结构特点、分布与功能及其机制进行综述.     

富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域1(LRIG1)增强顺铂诱导的人垂体瘤细胞凋亡

目的探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白结构域1(LRIG1)在人垂体瘤组织中表达情况,并观察过表达LRIG1后对顺铂(DDP)诱导的垂体瘤细胞增殖、凋亡的影响。方法采用免疫组织化学染色法检测45例垂体瘤患者肿瘤组织及瘤旁组织中的LRIG1表达,分析LRIG1阳性表达与患者临床病理指标的相关性。选取原代分离培养的人垂体瘤细胞,采用脂质体介导的基因转染技术将LRIG1基因过表达质粒p EGFP-N1-LRIG1转染进细胞中,筛选LRIG1过表达的细胞,同时选取转染空质粒p EGFP-N1的细胞作为对照组。两组细胞均经20μg/m L DDP诱导48 h,流式细胞术检测细胞凋亡情况,平板克隆实验检测细胞的增殖能力,Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白BAX、胱天蛋白酶3(caspase-3)和Bcl2的相对表达量。结果垂体瘤患者肿瘤组织中LRIG1阳性率显著低于瘤旁组织,且LRIG1在侵袭性肿瘤表达显著降低。与对照组相比,过表达LRIG1后,DDP诱导的细胞凋亡率显著增加、细胞增殖显著降低、BAX、caspase-3的水平显著增加,而Bcl2水平显著降低。结论过表达LRIG1增加DDP诱导的人垂体瘤细胞凋亡并抑制其增殖。     

敲低STAT3基因可下调存活蛋白(survivin)水平促进U87MG胶质瘤细胞凋亡

目的探讨信号转导子与转录激活子3(STAT3)特异性小干扰RNA(siRNA)对U87MG胶质瘤细胞的促凋亡作用及其作用机制。方法体外培养U87MG胶质瘤细胞,利用MTT法观察si STAT3质粒对细胞增殖的影响,通过流式细胞术及吖啶橙染色观察其对细胞凋亡影响,反转录PCR和Western blot法检测下调STAT3对存活蛋白(survivin)的调控效应。结果 si STAT3质粒可明显抑制U87MG胶质瘤细胞增殖,敲低STAT3可明显促进胶质瘤细胞凋亡,下调STAT3水平可明显降低survivin mRNA和蛋白水平。结论敲低U87MG细胞STAT3可下调survivn水平、促进胶质瘤细胞凋亡。     

PIAS3敲低对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究PIAS3敲低对人前列腺癌细胞系DU145细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法构建PIAS3shRNA表达质粒pSilencer4.1/PIAS3,转染DU145细胞。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期和凋亡。结果测序证实PIAS3shRNA表达质粒构建成功。转染后DU145细胞PIAS3蛋白表达明显下调。MTT分析显示PIAS3敲低促进细胞增殖,并存在剂量-效应关系。流式细胞术分析显示:PIAS3敲低后S期细胞比例增加,G0/G1期细胞比例减少,凋亡细胞比例减少。结论PIAS3敲低促进体外前列腺癌细胞增殖,抑制其凋亡。     

血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)敲低抑制宫颈癌SiHa细胞增殖并促进其凋亡

目的研究慢病毒介导短发夹RNA(shRNA)沉默血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)基因对人宫颈癌Si Ha细胞增殖和凋亡的影响。方法用ANGPTL4 shRNA慢病毒感染Si Ha细胞,实时荧光定量PCR检测各组细胞ANGPTL4 mRNA水平,Western blot法检测ANGPTL4蛋白水平;MTT法和软琼脂克隆形成实验检测Si Ha细胞增殖能力;流式细胞术检测Si Ha细胞周期。藻红蛋白标记的annexin V和7-氨基放线菌素D联合染色(annexin V-PE/7-AAD)结合流式细胞术检测慢病毒感染后Si Ha细胞的凋亡。结果重组慢病毒感染Si Ha细胞后,LV3-ANGPTL4组Si Ha细胞中ANGPTL4 mRNA和蛋白表达水平降低;MTT结果显示,LV3-ANGPTL4组细胞增殖受抑制;软琼脂克隆形成实验显示,LV3-ANGPTL4组细胞克隆形成数减少;流式细胞术结果显示,LV3-ANGPTL4组G0/G1期细胞所占比例增加,细胞凋亡率增高。结论下调Si Ha细胞ANGPTL4的水平可抑制细胞增殖,使细胞周期阻滞于G0/G1期,诱导细胞凋亡。     

敲减抗增殖蛋白2促进非小细胞肺癌细胞系A549凋亡

目的 探讨抑制抗增殖蛋白2(PHB2)表达对非小细胞肺癌细胞系A549凋亡的影响及机制。方法 慢病毒感染非小细胞肺癌细胞系A549,建立敲减PHB2的稳转细胞株,用动力相关蛋白1(DRP1)抑制剂Mdivi-1处理敲减PHB2的A549细胞。Western blot检测PHB2、p-DRP1(Ser616)和DRP1蛋白表达水平;TUNEL染色和annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡;MitoTracker染色评估线粒体分裂情况;用相应试剂盒检测线粒体含量、柠檬酸合酶活性和细胞色素c含量。结果 与shCtrl组相比,shPHB2组A549细胞凋亡率增加(P<0.05),DRP1介导的线粒体分裂增加(P<0.05),ATP含量减少(P<0.05),柠檬酸合酶活性降低(P<0.05),线粒体内细胞色素c减少(P<0.05)。与shPHB2组相比,shPHB2+Mdivi-1组A549细胞凋亡率减少(P<0.05),DRP1介导的线粒体分裂减少(P<0.05),ATP含量增加(P<0.05),柠檬酸合酶活性增加(P<0.05)...     

敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡

背景：环状RNA(circular RNA,circRNA)在多种疾病或肿瘤中发挥着重要作用,近年研究结果发现,膝骨关节炎中circRNA失常表达,并可通过调控微小RNA(miRNA)/mRNA参与疾病进展。目的：探究circ-BRWD1/miR-488-3p/DNMT3A对膝骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的影响。方法：实时荧光定量PCR检测膝骨关节炎软骨细胞mi R-488-3p、circ-BRWD1、DNMT3A表达。将细胞分为si-NC组、si-circ-BRWD1组、si-circ-BRWD1+anti-miR-NC组、si-circ-BRWD1+anti-miR-488-3p组、vector组、circ-BRWD1组、miR-NC组、miR-488-3p组、miR-488-3p+vector组、miR-488-3p+DNMT3A组、anti-miR-NC组、anti-miR-488-3p组;实时荧光定量PCR检测circ-BRWD1、miR-488-3p、DNMT3A表达,MTT、流式细胞术检测增殖和凋亡,Western blot检测DNMT3A、增殖、凋亡相关蛋白表达;双荧光素...     

敲低HSC-LX2人肝星状细胞钙网蛋白引起细胞内Ca2+水平升高并促进细胞凋亡

目的 探讨沉默钙网蛋白(CALR)基因对人肝星状细胞(HSC-LX2)凋亡及细胞内Ca2+水平的影响.方法 设计靶向CALR的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染至HSC-LX2细胞,筛选出敲低CALR的HSC-LX2细胞.采用异硫氰酸荧光素标记的膜联素V/碘化丙啶(annexin Ⅴ-FITC/PI)双标记结合流...     

敲低dachshund同源物1(DACH1)促进Capan-1胰腺癌细胞凋亡并抑制其侵袭和迁移

目的探讨抑制dachshund同源物1(DACH1)的表达对Capan-1胰腺癌细胞周期、凋亡、迁移及侵袭的影响。方法设计合成针对人DACH1基因的4条小干扰RNA(si RNA),退火形成双链短发夹RNA(shRNA),插入p Genesil-1载体中,构建成重组质粒,进行酶切及测序鉴定,通过脂质体介导转染入Capan-1细胞,利用荧光显微镜、反转录PCR和Western blot法检测其转染表达效率。藻红蛋白标记的膜联蛋白Ⅴ和7-氨基放线菌素D(annexinⅤ-PE/7AAD)双标记结合流式细胞术检测Capan-1细胞凋亡和流式细胞术检测细胞周期,TranswellTM侵袭、迁移实验检测Capan-1细胞侵袭迁移能力。结果成功构建并筛选出干扰质粒pshRNA-DACH1,将其转染Capan-1胰腺癌细胞后,成功下调Capan-1细胞DACH1水平,同时细胞凋亡明显增加,而对细胞周期无明显影响。下调DACH1表达后细胞侵袭和迁移能力均降低。结论敲低DACH1基因表达能显著促进胰腺癌细胞Capan-1凋亡,抑制其侵袭及迁移。     

敲低YTH结构域N~6甲基腺嘌呤(m~6A)RNA结合蛋白2(YTHDF2)抑制宫颈癌细胞增殖并促进其凋亡

目的探讨敲低YTH结构域N~6甲基腺嘌呤(m~6A)RNA结合蛋白2(YTHDF2)对人宫颈癌细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法利用人蛋白图谱(Human Protein Atlas)数据库分析YTHDF2在宫颈癌中表达及与生存时间的关系。收集宫颈癌和正常宫颈组织各31例,采用免疫组织化学法检测YTHDF2的蛋白表达差异;利用敲低YTHDF2的短发夹RNA(shRNA)及空载质粒包装慢病毒,并感染至宫颈癌HeLa细胞和SiHa细胞,实时荧光定量PCR及Western blot法检测YTHDF2的mRNA及蛋白水平,敲低YTHDF2后,采用CCK-8法检测细胞增殖活性,集落形成实验检测细胞集落形成能力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果检测数据库发现YTHDF2在宫颈癌中表达越高生存时间越短,与正常宫颈组织相比, YTHDF2在宫颈癌组织高表达。敲低YTHDF2后,抑制宫颈癌细胞增殖,促进细胞凋亡,使细胞阻滞于S期。结论 YTHDF2在宫颈癌组织中高表达,敲低后抑制宫颈癌细胞增殖并促进其凋亡。     

敲低高迁移率族蛋白B1(HMGB1)抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖并促进其凋亡

目的探讨敲低高迁移率族蛋白B1(HMGB1)水平对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞(GMC)增殖的影响及机制。方法培养大鼠GMC,分为正常组、高糖处理组、阴性对照小干扰RNA联合高糖处理组(siRNA-NC-高糖组)、 HMGB1小干涉RNA联合高糖处理组(siRNA-HMGB1-高糖组)。正常组GMC用正常DMEM培养基培养;高糖处理组GMC换用高糖DMEM培养基培养; siRNA-HMGB1-高糖组GMC转染siRNA-HMGB1序列6 h后,用高糖培养液培养24 h; siRNA-NC-高糖组GMC转染siRNA-NC序列6 h后,用高糖培养液培养24 h。实时荧光定量PCR检测GMC中HMGB1 mRNA水平, MTT法检测GMC增殖情况,流式细胞术检测GMC凋亡情况, Western blot法检测GMC中HMGB1、核因子κBp65 (NF-κBp65)和核因子κB抑制物α(IκBα)蛋白水平, ELISA检测细胞上清液中白细胞介素1β(IL-1β)、 IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。结果与siRNA-NC-高糖组或单纯高糖组相比, siRNA-HMGB1-高糖组GMC中HMGB1 mRNA水平降低,在处理24、 48、 72、 96 h, GMC增殖活性和细胞凋亡率降低;敲低GMC的HMGB1水平后,细胞NF-κBp65蛋白水平降低、 IκBα蛋白水平增加,且上清液中IL-1β、 IL-6和TNF-α水平降低。结论敲低GMC的HMGB1水平抑制高糖诱导的GMC增殖,并促进其凋亡,可能与抑制NF-κB/IκBα通路有关。     

敲低膀胱癌细胞热休克蛋白60(HSP60)通过上调乳酸脱氢酶A(LDHA)表达抑制人NKL细胞杀伤

目的 探索热休克蛋白60(HSP60)蛋白表达变化影响膀胱癌细胞逃避自然杀伤(NK)细胞免疫监视的作用及机制.方法 免疫组织化学染色法检测HSP60在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达,统计学分析HSP60在膀胱癌及癌旁组织的表达差异及HSP60表达水平与膀胱癌患者预后的相关性.利用腺病毒载体构建HSP60稳定干涉及过表达的...     

cAMP反应元件结合蛋白(CREB)与细胞凋亡

cAMP反应元件结合蛋白(CREB)是真核细胞内核转录调节因子,受多因素的激活而调控靶基因,调节细胞凋亡.细胞凋亡与机体生长发育、内环境稳定、防御反应等功能相关.     

敲低趋化因子受体7(CCR7)抑制MG63骨肉瘤细胞的增殖和侵袭并诱导其凋亡

目的研究小干扰RNA(siRNA)靶向抑制趋化因子受体7(CCR7)表达对MG63人骨肉瘤细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。方法设计并合成靶向抑制CCR7表达的siRNA,转入MG63细胞后,采用Western blot法检测CCR7蛋白水平,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖,TranswellTM侵袭和迁移实验检测细胞侵袭和迁移能力。结果 MG63细胞转染CCR7-siRNA后,细胞CCR7表达明显下调;同时细胞增殖明显减弱,侵袭和迁移能力明显下降,且细胞凋亡率升高。结论下调MG63骨肉瘤细胞的CCR7,可明显抑制细胞增殖、侵袭和迁移,并能诱导细胞凋亡。     

敲低赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)促进人诱导性多能干细胞分化为产胰岛素细胞

目的探索一种人诱导性多能干细胞(hiPSC)体外高效分化为产胰岛素细胞(IPC)的诱导方案。方法 RNAi技术敲低hiPSC赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)基因后,利用四步法诱导其体外分化为IPC。流式细胞术分析IPC分化效率,实时定量PCR检测细胞LSD1、POU5同源盒转录因子1(OCT4)、Y染色体性别决定区因子17(SOX17)、叉头盒蛋白A2 (FOXA2)、胰腺和十二指肠同源盒蛋白1 (PDX1)、配对盒转录因子4(PAX4)、PAX6、肝细胞核因子6 (HNF6)、肝细胞核因子1同源盒蛋白A(TCF1)、NK6同源盒蛋白1(NKX6. 1)、葡萄糖转运子2(GLUT2)、葡萄糖激酶(GK)、胰岛素及MAF b ZIP转录因子A(MAFA)的mRNA水平,免疫荧光技术检测细胞PDX1、胰岛素的表达和定位;双硫腙(DTZ)染色和透射电镜分别观察细胞内胰岛素的分泌和分泌颗粒分布情况; ELISA检测诱导后细胞胰岛素和C肽分泌量。结果 LSD1敲低组的IPC分化效率较对照组有明显提高,胰岛β细胞发育相关基因SOX17、PDX1、PAX4、胰岛素的mRNA表达显著上调。LSD1敲低组的IPC共表达成熟β细胞特异性蛋白PDX1和胰岛素。另外,这些IPC能感应葡萄糖刺激并以胰岛素分泌小泡形式释放胰岛素,胰岛素或C肽释放量约为天然胰岛细胞的1/6(而对照组仅为1/8)。结论敲低LSD1基因可以促进hiPSC体外高效分化为IPC。     

富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1基因特异性RNA干扰表达载体的构建、鉴定和稳定株筛选

背景：有研究表明富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1,LRIG1)基因在神经胶质瘤细胞中呈低表达,LRIG1基因过表达后对神经胶质瘤细胞的 LRIG1 mRNA和蛋白表达均明显增强和抑制其生物学行为,但却很少有研究从阻断LRIG1基因的表达的角度进行论证。 目的：构建针对LRIG1基因的特异性RNA干扰质粒,稳定转染人脑胶质瘤GL15细胞系,观察其对目的基因LRIG1表达的影响。 方法：根据GenBank提供的LRIG1基因序列设计2条RNA干扰序列,命名为LRIG1-shRNA1和LRIG1-shRNA2,并设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为pGenesil2-negative shRNA。合成各自的寡核苷酸链,退火后与pGenesil2质粒载体连接,转化扩增后测定序列。用不同浓度的G418作用于GL15细胞确定G418对GL15细胞的筛选浓度。将3种重组表达载体转染GL15细胞,G418筛选后挑单克隆并扩增获得稳定株。Western blot检测LRIG1蛋白的表达。 结果与结论：构建的重组pGenesil2-LRIG1- shRNA质粒经限制性酶切及DNA测序分析证明其序列插入正确。转染pGenesil2- LRIG1-shRNA1(LRIG11)细胞和pGenesil2- LRIG1-shRNA2(LRIG12)细胞LRIG1蛋白表达水平较阴性对照组pGenesil2-negative shRNA分别下降47.9%(P < 0.01)和32.8% (P > 0.05)。结果证实,实验成功构建了针对LRIG1基因的特异性shRNA表达载体pGenesil2-LRIG1-shRNA1,其转染GL15细胞后可抑制LRIG1的表达。     

敲低核蛋白1(NUPR1)基因抑制人U266多发性骨髓瘤细胞增殖并促进其凋亡北大核心CSCD

目的构建核蛋白1-短发夹RNA(NUPR1-sh RNA)慢病毒载体定向敲低NUPR1基因,研究NUPR1基因下调对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖及凋亡的影响。方法以正常浆细胞为对照,通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测骨髓瘤U266细胞和RPMI8226细胞的NUPR1 m RNA水平。设计针对NUPR1基因的sh RNA并包装慢病毒载体感染U266细胞,流式细胞术观察转染效率,q RT-PCR、Western blot法验证NUPR1基因干扰效果,CCK-8法及台盼(trypan)蓝染色检测细胞增殖,流式细胞术及Hoechst染色观察细胞凋亡。结果与正常人浆细胞相比,U266、RPMI8226细胞NUPR1 m RNA水平较高;U266细胞慢病毒感染效率达80%,NUPR1-sh RNA慢病毒载体构建成功。敲低NUPR1水平后,U266细胞增殖减弱,抑制率高达(58.71±1.64)%;与阴性对照组和空白对照组相比,敲低NUPR1水平后,U266细胞凋亡率明显增加。结论敲低U266细胞NUPR1水平后,可明显抑制U266细胞增殖并促进其凋亡。     

敲减microRNA-205靶向PTEN抑制食管癌细胞TE1的增殖并促进细胞凋亡

目的:探讨miRNA-205对食管癌细胞株TE1增殖和凋亡能力的影响及其作用机制.方法:实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和Western印迹检测正常食管黏膜细胞Het-1A和不同食管癌细胞株(KYSE70,TE12,TE1)中miRNA-205的mRNA及蛋白表达水平.转染miRNA-205抑制剂下调TE1细胞中miRNA-205的表达,采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖能力、细胞周期和细胞凋亡情况;Western印迹检测细胞增殖和细胞凋亡相关CDK2,cyclin D1,P21,Bcl-2,cleavedcaspase-3,caspase-3,p-Rb,Rb,p-Akt和Akt的蛋白表达水平.双荧光素酶报告基因分析法预测及验证其可能的靶基因.结果:MiRNA-205在各型食管癌细胞中高表达.沉默miRNA-205后,TE1细胞的增殖能力降低并表现为细胞周期阻滞,而细胞凋亡率显著升高(p＜0.05).同时细胞中cyclin D1,CDK2,bcl-2,p-Rb及p-Akt的蛋白表达水平均显著降低,p21及cleaved-caspase-3的蛋白表达水平显著升高.双荧光素酶报告基因分析显示PTEN是miRNA-205的可能作用靶点,TE1中共转染miRNA-205抑制剂和PTEN siRNA可部分逆转miRNA-205介导细胞增殖抑制及凋亡诱导作用.结论:沉默miRNA-205可靶向PTEN抑制食管癌细胞株TE1的增殖,并促进其凋亡,提示miRNA-205可作为食管癌诊疗的一个潜在作用靶点.