抗TSLP全人源单链抗体筛选与初步鉴定

目的:表达TSLP蛋白,从全人源单链抗体文库中筛选得到抗TSLP单链抗体。方法:扩增TSLP cDNA,将目的基因与表达载体pET101/D-TOPO连接,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化鉴定。以生物素化的TSLP蛋白为抗原从前期构建的全人源抗体文库中采用噬菌体展示技术筛选抗TSLP全人源单链抗体(scFv)。结果:扩增的TSLP cDNA片段大小为423 bp左右。表达的TSLP蛋白大小为26 kD左右,Dot blot及Western blot鉴定显示表达的蛋白正确,为TSLP目的蛋白。以生物素化的TSLP蛋白为抗原,采用噬菌体展示技术对全人源抗体文库进行3轮富集,通过ELISA检测有35%的scFv与TSLP有结合特性。将筛选的与TSLP结合能力强的单链抗体进行了Western blot鉴定和测序。结论:成功筛选到抗TSLP全人源单链抗体。     

抗人载脂蛋白6 单链抗体的筛选、制备及活性鉴定

目的:筛选特异性抗人载脂蛋白6单链抗体(anti-hLCN6 scFv),并进行表达纯化和活性鉴定。方法:采用RT-PCR技术,用抗体可变区简并引物,从hLCN6免疫小鼠的淋巴细胞中扩增全套V_H和V_L基因,装配成scFv基因后将其克隆到噬菌体载体pFAB5C中,构建scFv噬菌体抗体库。对抗体库进行4轮富集,筛选抗hLCN6阳性scFv。经原核表达纯化后,用Western blot和间接ELISA对其活性进行鉴定。结果:筛选到2株亲和力较高的阳性克隆,测序表明其序列一致。获得了高纯度的scFv抗体,其对抗原具有良好的亲和力和特异性。结论:成功筛选到特异性抗hLCN6 scFv,为利用该抗体进行混合斑中的精子分离奠定了基础。     

人源性抗乳腺癌单链抗体库的筛选与初步鉴定

目的:本研究旨在已构建的大容量人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的基础上,筛选出高亲和力的特异性单链抗体(scFv)并对抗体基本特性进行初步鉴定。方法:以人乳腺癌细胞系MCF-7为靶标,经过4轮淘洗,筛选出高亲和力的特异性抗乳腺癌scFv,并对其结构序列进行分析;通过ELISA和Western blot方法,鉴定scFv的亲和力和特异性,以及其蛋白的基本表达情况。结果:成功构建具有高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库,获得scFv的长度约为750 bp,ELISA证实所得抗体对乳腺癌细胞具有良好的亲和力和高度的特异性,IPTG诱导表达及Western blot结果显示,scFv为相对分子质量(Mr)30 000的可溶性蛋白。结论:本研究在已构建的大容量抗乳腺癌单链抗体库的基础上,筛选获得了高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库。研究结果为进一步获得可应用于临床诊断和治疗的乳腺癌靶向性抗体奠定了良好的基础。     

抗金黄色葡萄球菌α-溶血素全人源单链抗体的筛选及初步鉴定

目的:从全人源单链抗体文库中筛选并鉴定抗金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-HL)单链抗体。方法:IPTG低温诱导α-HL融合蛋白表达并纯化鉴定;采用噬菌体展示技术从单链抗体文库中筛选抗α-HL全人源单链抗体(sc Fv)。将筛选并测序鉴定正确的15株sc Fvs插入p LZ16载体进行表达验证和ELISA鉴定。结果:表达纯化的α-HL融合蛋白为可溶性蛋白,大小约为90 k D。采用表达的α-HL融合蛋白作为抗原,经过4轮噬菌体展示筛选,ELISA结果显示大约有34%的sc Fvs与α-HL具有结合特性。将与α-HL结合良好且序列正确的15株sc Fvs插入p LZ16载体中进行可溶性表达后,经Western blot验证正确; ELISA鉴定结果显示:sc Fvs与购买的α-HL(Sigma,USA)、金黄色葡萄球菌都具有较高的结合活性且对金黄色葡萄球菌特异,与白色葡萄球菌无交叉反应。结论:成功筛选到抗α-HL全人源单链抗体。     

从噬菌体抗体库中筛选抗Cry1Ac蛋白单链抗体

目的:从Tomlinson J噬菌体抗体库中筛选人源化抗Cry1Ac蛋白单链抗体(scFv)并进行鉴定.方法:以Cry1Ac蛋白为抗原包被固相,经4轮"吸附-洗脱-扩增"过程后,挑取单克隆,用ELISA法测定特异性结合活性,并对其进行基因序列测定.结果:经过4轮筛选,获得了2株能与Cry1Ac蛋白特异性结合的阳性克隆.结论:利用噬菌体抗体库技术可以不经过免疫制备出高特异性的人源化抗Cry1Ac蛋白scFv,为Cry1Ac毒素蛋白检测提供了条件.     

可与肝癌细胞系HepG2特异性结合的单链抗体的表达及其特性

目的:在原核细胞中表达经噬菌体抗体库筛选可与HepG2细胞特异性结合的单链抗体(scFv),并对其特性进行鉴定。方法:采用正常肝细胞系L02和肝癌细胞系HepG2,从人源噬菌体抗体库中筛选可与HepG2细胞特异结合的scFv。对scFv DNA测序后,以其阳性噬菌体感染大肠杆菌HB2151,在IPTG诱导下表达scFv并以金属离子螯和层析(IMAC)进行纯化,用100g/L SDS-PAGE、Western blot及ELISA分析纯化的scFv。将纯化的scFv与HepG2细胞共孵育后,观察其对细胞生长的影响。结果:经筛选获得的2个相对特异性的scFv,分别命名为SLH04及SLH10。经IPTG诱导获得可溶性scFv的表达。Western blot分析证明,表达产物的相对分子质量(Mr)均为36000左右,与理论预期值相符。ELISA检测表明,纯化的scFv能与HepG2细胞特异性结合,并抑制HepG2细胞的生长。结论:从人源噬菌体抗体库中,筛选出能与HepG2细胞特异性结合的scFv,并在大肠杆菌中表达,有望用于肝癌生物治疗的实验研究。     

抗阿尔茨海默病Aβ人源单链抗体基因的筛选和表达

目的 从人源噬菌体单链抗体库中筛选与阿尔茨海默病发病中起关键作用的β淀粉样多肽(Aβ)1-42特异性结合的单链可变区抗体(scFv)基因,利用原核生物大肠杆菌进行可溶性表达,以获得抗AB1-42人源抗体.方法 利用噬菌体展示技术对人源噬菌体单链抗体库进行多轮富集,以Aβ1-42为抗原经酶联免疫吸附(ELISA)检测,筛选与Aβ1-42特异性结合的阳性噬菌体克隆,再用阳性噬菌体感染E.coli HB2151进行可溶性表达,经SDS-PAGE、Western blot及ELISA法检测scFv单抗的可溶性表达水平及抗原结合活性.并对阳性scFv抗体基因进行基因测序鉴定.结果 获得了7个特异性的抗Aβ1-42 scFv阳性噬菌体克隆,其中4个克隆ELISA检测吸光度值(A值)高于阴性对照5倍以上;其中1株(A 10)获得可溶性单链抗体的成功表达,表达产物主要位于菌体中,ELISA效价显示在全菌蛋白中A值高于对照5倍以上.其相对分子质量约为33 000.DNA测序表明所获抗体的可变区基因属于scFv抗体基因,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构.结论 用人源噬菌体单链抗体库筛选出抗Aβ1-42的人源抗体单链可变区基因,并成功表达了具有抗原结合活性的可溶性单链抗体,为进一步研究阿尔茨海默病的发病机制和治疗奠定了基础.     

抗淋巴细胞激活基因3(LAG-3)全人源抗体的制备

目的淋巴细胞激活基因3(LAG-3)是一个极具潜力的肿瘤治疗靶点。本研究旨在从大容量全人源噬菌体抗体库中筛选抗LAG-3的单链抗体(scFv),将其转化为完整的全人源抗体。方法从全人源噬菌体抗体库,筛选抗LAG-3全人源噬菌体scFv,ELISA鉴定噬菌体scFv的特异性,采用表面等离子共振技术(SPR)测定其亲和力,再通过真核表达系统获得抗LAG-3全人源完整抗体。结果通过3轮筛选富集,获得了4个具有特异结合活性的scFv。亲和力测定最高的达到3.48×10~(-10)。再通过构建完整的抗LAG-3全人源抗体表达载体,经真核细胞表达、纯化后,获得了3株特异性抗LAG-3全人源抗体。结论利用大容量全人源噬菌体抗体库,成功筛选并表达出3种高亲和力和特异性的抗LAG-3全人源抗体。     

人源性抗人FKBP52 IgG的表达和纯化

目的将噬菌体抗体库中筛选到的抗52-k Da FK506结合蛋白(FKBP52)人源单链抗体(sc Fv)转换为完整人IgG并在真核细胞中表达。方法噬菌体抗体库获得的5株抗人FKBP52-sc Fv,PCR扩增其轻重链可变区(V_H/V_κ),利用同源重组技术将5对V_H、V_κ拼接至分别包含有人κ链及IgG1恒定区的真核表达载体p CMV/R-L、p CMV/R-H上,转染HEK293F细胞进行完整抗体表达,ELISA鉴定抗体活性,蛋白A柱分离纯化活性最高的抗体,SDS-PAGE、Western blot法鉴定纯化后抗人FKBP52-IgG。结果 PCR及测序结果证实正确构建得到5对抗人FKBP52真核表达载体,转染HEK293F细胞后经ELISA鉴定均有完整抗体表达,对活性最高的5号克隆进行抗体分离纯化,经SDS-PAGE及Western blot验证获得高纯度的特异性人源抗FKBP52-IgG。结论成功将原核表达的抗人FKBP52-sc Fv转换为真核表达的完整人IgG。     

抗骨肉瘤细胞系MG63特异性单链抗体的制备及功能鉴定

目的从全人源噬菌体抗体库中筛选与人骨肉瘤细胞MG63特异性结合的单链抗体(scFv)并进行表达、纯化及鉴定。方法采用噬菌体表面展示技术,以正常人成骨细胞系hFOBl.19为阴性筛选细胞,人骨肉瘤细胞系MG63为阳性筛选细胞,经过"吸附-洗脱-扩增"过程筛选并富集特异性抗体,ELISA检测并进行PCR扩增及测序鉴定。获得的阳性噬菌体感染大肠杆菌HB2151,IPTG诱导后经镍亲和层析柱纯化,用SDS-PAGE鉴定表达、纯化效果,ELISA检测可溶性特异性单链抗体的亲和力、特异性及稳定性。MTT法检测纯化后的单链抗体对骨肉瘤细胞MG63增殖的影响。结果通过筛选、PCR扩增和序列分析确定scFv4的片段包含免疫球蛋白序列,其表达产物可与抗原结合;纯化后的单链抗体对骨肉瘤细胞MG63增殖有明显的抑制作用,且其抑瘤作用与质量浓度成正相关。未加蛋白保护剂的纯化抗体4℃下其抗体活性可保持约5周,添加蛋白保护剂的纯化抗体则可在4℃下保持6~7周。结论利用噬菌体表面展示技术成功筛选出能与人骨肉瘤细胞MG63特异性结合的scFv,在大肠杆菌中成功表达并获得基因序列,抗体能抑制MG63细胞的增殖且稳定性良好。     

人源性抗HER2胞外段Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建全人源抗HER2胞外段(HER2 ECD)噬菌体Fab抗体库,从中筛选出特异性的抗体,并对其进行鉴定。方法:体外致敏并用EB病毒(EBV)转化HER2高表达乳腺癌患者的外周血单核细胞(PBMC),用PCR分别扩增重链Fd和轻链κ/λ基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建抗HER2 ECD人源化Fab噬菌体抗体库。以纯化HER2 ECD蛋白为抗原进行3轮固相淘选,富集抗HER2 ECD的抗体,并随机挑选克隆进行ELISA,获得的阳性克隆进一步以Western blot鉴定其抗原结合活性,对其中活性最高的克隆进行DNA测序。结果:构建了容量为2.5×107的抗HER2 ECD的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了4株与HE2 ECD特异性结合的阳性克隆,Western blot分析显示其与HER2 ECD能较好的结合。选取结合活性最高的阳性克隆进行DNA序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。结论:成功构建了全人源抗HER2 ECD噬菌体抗体库,并筛选出抗HER2 ECD特异性较强的噬菌体克隆,为获得新的有临床应用价值的HER2 ECD抗体提供了实验基础。     

抗骨肉瘤细胞系MG63特异性单链抗体的制备及功能鉴定

目的从全人源噬菌体抗体库中筛选与人骨肉瘤细胞MG63特异性结合的单链抗体(scFv)并进行表达、纯化及鉴定。方法采用噬菌体表面展示技术,以正常人成骨细胞系hFOBl.19为阴性筛选细胞,人骨肉瘤细胞系MG63为阳性筛选细胞,经过"吸附-洗脱-扩增"过程筛选并富集特异性抗体,ELISA检测并进行PCR扩增及测序鉴定。获得的阳性噬菌体感染大肠杆菌HB2151,IPTG诱导后经镍亲和层析柱纯化,用SDS-PAGE鉴定表达、纯化效果,ELISA检测可溶性特异性单链抗体的亲和力、特异性及稳定性。MTT法检测纯化后的单链抗体对骨肉瘤细胞MG63增殖的影响。结果通过筛选、PCR扩增和序列分析确定scFv4的片段包含免疫球蛋白序列,其表达产物可与抗原结合;纯化后的单链抗体对骨肉瘤细胞MG63增殖有明显的抑制作用,且其抑瘤作用与质量浓度成正相关。未加蛋白保护剂的纯化抗体4℃下其抗体活性可保持约5周,添加蛋白保护剂的纯化抗体则可在4℃下保持6~7周。结论利用噬菌体表面展示技术成功筛选出能与人骨肉瘤细胞MG63特异性结合的scFv,在大肠杆菌中成功表达并获得基因序列,抗体能抑制MG63细胞的增殖且稳定性良好。     

甲状腺未分化癌人源单链抗体制备及初步鉴定

目的从大容量甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma,ATC)人源单链抗体(single chain variable fragments,sc Fv)库中筛选特异性抗ATC单链抗体并进行生物特性鉴定。方法对该抗体库进行4轮筛选后,挑取抗ATC阳性克隆感染E.coli HB2151;并用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导该sc Fv抗体可溶性表达,ELISA法检测其可溶性表达;经HiTrap~(TM) Anti E-tag亲和柱层析纯化抗体;细胞ELISA鉴定可溶性抗体与细胞结合的特异性,分别设置TT细胞、ARO细胞、人肝癌Hep G2细胞及PBS空白对照组,用酶标仪检测各组在450 nm处的吸光度。SDS-PAGE法及Western blot检测抗体的表达和相对分子质量;流式细胞术观察细胞凋亡情况。结果经4轮筛选后抗体实现了显著富集,并得到了纯化抗体。ELISA结果表明筛选出的抗体与甲状腺未分化癌细胞能够特异性结合。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示ATC抗体的相对分子质量约为2.9×10~4。流式细胞术结果显示ARO细胞经sc Fv特异性作用后细胞明显凋亡。结论成功获得抗ATC特异性人源单链抗体,鉴定结果显示抗体活性较好。     

胰淀素Fab抗体的筛选及初步鉴定

目的:从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选胰淀素(amylin又称为胰岛淀粉样多肽)Fab抗体,测定其特异性及抗原结合活性.方法:以胰淀素为抗原,对抗体库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选;将从人源噬菌体抗体库中筛选出的阳性克隆,提取其质粒、切除gⅢ、自身环化并转入大肠杆菌中,以IPTG诱导表达可溶性抗体,最后用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定抗原结合活性和特异性.结果:成功筛选并表达了抗胰淀素的可溶性Fab抗体,经SDS-PAGE蛋白电泳,在相对分子质量约为47 kD处可见一蛋白条带.ELISA和Western blot证实了该Fab片段与胰淀素抗原的结合活性和特异性.结论:利用噬菌体抗体库技术获得了人源性的特异抗胰淀素Fab抗体,为临床进行下一步研究奠定了基础.     

利用大型天然噬菌体抗体库筛选抗死亡受体5人源抗体

目的从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗人死亡受体5(DR5)单链抗体(sc Fv)并对其抗原结合活性进行鉴定。方法以前期真核表达纯化的DR5-Fc蛋白包被筛选管,从自主构建的大容量天然噬菌体抗体库中,通过4轮筛选过程获得噬菌体抗体,采用免疫细胞化学染色、ELISA鉴定其抗原结合活性;DNA指纹图谱分析和序列测定确定其抗体类型。结果经过4轮筛选,获得26株与DR5特异性结合的阳性克隆,DNA指纹分析有4种不同的可变区片段;经过基因测序,分析可变区基因的亚群,并将其制备成可溶性的抗体,进一步用免疫细胞化学技术证实所获得的抗体可特异性结合SW480细胞的DR5蛋白。结论利用噬菌体抗体库技术成功获得了特异性抗DR5的人源性sc Fv。     

利用人源化噬菌体抗体库筛选骨唾液酸蛋白的单链抗体

目的:从人源化噬菌体抗体库中筛选高亲和、特异结合人骨唾液酸蛋白(BsP)的人源可变区单链抗体(scFv).方法:采用噬菌体表面展示系统,以重组的BSP蛋白为包被抗原,从噬菌体可变区scFv中筛选特异性结合BSP的小分子scFv,经过3轮亲和富集筛选后,再用ELISA方法进一步鉴定与抗原BSP有特异结合活性的scFv阳性克隆,PCR扩增鉴定阳性克隆的插入轻、重链基因片段,并对阳性scFv分子测序和序列分析.结果:筛选得到的scFv片段可以特异地结合BSP蛋白,PCR扩增都得到了长为368 bp、527 bp和935bp的轻链、重链和轻链-连接片段-重链的基因片段,测序结果分析发现上述scFv片段在轻链有11处的氨基酸组成不同,在重链区域氨基酸组成则有3处不同.基因序列分析结果表明符合人源单链可变区抗体基因序列的结构特征.结论:利用噬菌体抗体库技术成功获得BSP蛋白的特异性人源单链可变区抗体.     

乳腺癌抗hEGF单链抗体的筛选和活性鉴定

目的:从噬菌体单链抗体库筛选特异性的抗人表皮生长因子(hEGF)抗体并进行活性鉴定。方法:以hEGF为抗原,对所建抗体库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"的亲和筛选。将筛选后的单链抗体(scFv)通过ELISA和基因测序分析等方法进行鉴定;利用MTT法在体外培养的人乳腺癌细胞系MCF-7/Her-2+中检测抗体的生物结合活性。结果:在亲和筛选过程中,乳腺癌噬菌体scFv得到富集,收获率逐轮得到提高,3轮筛选之后,得到了3株高亲和力的抗hEGF抗体;ELISA检测筛选出的3种有较高活性;测序结果与人hEGF抗体基因序列高度一致;该抗体对MCF-7/Her2+乳腺癌细胞系有特异性杀伤作用。结论:成功地筛选到特异性抗hEGF的scFv抗体,为今后的研究和应用提供依据。     

抗表皮生长因子受体3(HER3)单链抗体的制备及鉴定

目的表达、纯化并鉴定抗人表皮生长因子受体3(HER3)的单链抗体(scFv)。方法从NCBI查找抗HER3单克隆抗体LJM716的轻链和重链序列,构建抗HER3-scFv基因;利用毕赤酵母组成性表达载体pGAPZαA构建重组表达载体,电转化毕赤酵母,筛选高表达工程菌;工程菌发酵上清经疏水层析和金属离子亲和层析纯化, Western blot法和ELISA鉴定纯化产物。结果成功构建了抗HER3-scFv基因,获得了高表达工程菌;发酵上清经两步层析纯化,获得了纯度达95%以上的抗HER3-scFv,产率为192 mg/L; Western blot结果显示抗HER3-scFv得到正确表达, ELISA结果表明抗HER3-scFv可特异识别HER3。结论成功制备了特异的抗HER3-scFv。     

抗CD147人源单链抗体的筛选及生物特性初步鉴定

目的利用噬菌体展示技术筛选特异性抗CD147人源单链抗体(human anti-CD147 sc Fvs)并进行生物特性鉴定。方法以真核表达的CD147蛋白为抗原,采用"酸洗脱法"对库进行4轮富集性筛选、以ELISA法对筛选克隆的结合活性进行测定,以竞争ELISA和Western blot实验对获得的噬菌体抗体和可溶性sc Fv的特异性进行鉴定,通过DNA测序核实特异性sc Fvs的人源性及其亚群,以硫氰酸盐洗脱法对获得的抗体进行相对亲和力分析。结果经过4轮的富集性筛选,共筛出4个与CD147特异性结合的阳性克隆,其中3个获得可溶性表达,竞争抑制及Western blot实验证实其能与CD147特异性结合。DNA序列分析证实3个阳性克隆具有不同的基因型,三者的轻链可变区分别属于V_λⅠ、V_κⅡ、V_λⅢ亚群,重链可变区分别属于V_HⅠ、V_HⅢ、V_HⅢ亚群。硫氰酸盐洗脱法测出13号、15号和168号3个human anti-CD147 sc Fvs的亲和力分别为0.20 mol/L、0.35 mol/L和0.6 mol/L。结论成功从大容量噬菌体抗体库中筛选到特异性human anti-CD147 sc Fvs,为进一步研究该抗体的功能及应用前景奠定了基础。     

抗B型葡萄球菌肠毒素高亲和力单链抗体的制备

目的 构建针对B型葡萄球菌肠毒素(SEB)的特异性单链抗体(scFv),并进行纯化和鉴定.方法 设计抗SEB高亲和力单克隆抗体(mAb) FMU-SEB-No.2重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗SEBmAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段;然后通过在轻链引物上设计linker序列,重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成scFv基因片段,并将其克隆入原核表达载体PGEX4T-1中;转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,融合蛋白经谷胱甘肽亲和层吸柱纯化.采用SDS-PAGE,Western blot,ELISA等方法对其表达水平和特异性进行分析.结果 成功从1株抗SEB mAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL可变区基因,并通过linker序列将其拼接成scFv片段,大小约750 bp,编码250个氨基酸.PCR、酶切鉴定和测序结果表明表达载体构建成功.转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,以可溶形式表达相对分子质量(Mr)约54 000的融合蛋白.经谷胱甘肽亲和层析法纯化融合蛋白,可获得纯度达90％以上的scFv,ELISA和Western blot法检测结果表明,可溶性scFv与抗原SEB有较强的结合活性.结论 成功构建并表达出抗SEB的特异性单链抗体.