复合套式PCR鉴定HIV亚型的基因分型方法

艾滋病目前已成为威胁全球人民生命健康安全的主要疾病之一。由于人类免疫缺陷病毒(HIV)的高度变异，不同亚型病毒的生物学特性及分子流行病学特征均有所不同，因此，能够快速、准确地检测HIV感染及对其进行基因水平的分型，将对搞清HIV各亚型在我国的分布、HIV生物学表型与基因型的关系等方面的研究提供资料。为此。笔者在分子生物学方法的基础上，改进研究出复合套式PCR直接鉴定HIV亚型的基因分型方法。现报告如下。     

戊型肝炎病毒结构蛋白基因的真核表达

目的使用酵母表达系统表达戊型肝炎病毒结构蛋白基因。方法构建含戊型肝炎病毒(HEV)结构蛋白嵌合基因HEVORF23(由HEVORF2C端800bp片段与ORF3全基因组成)的重组表达质粒pPICZαA_HEVORF23,并通过电转移的方法将该基因整合入甲醇营养型酵母的基因组DNA中,利用甲醇进行诱导表达,表达产物经纯化后,进行Western印迹鉴定。结果pH6.0环境下诱导培养72h后,在细胞沉淀中获得一个分子量大约为69kDa的可溶性目的蛋白,纯化蛋白经Western印迹检测后发现能与戊型肝炎患者血清发生较强的特异性免疫反应。结论采用酵母表达系统诱导表达可以获得抗原性较强的HEV重组表达抗原,为进一步开发研制有效的诊断抗原和疫苗奠定了基础。     

HIV基因治疗概况及进展

随着人免疫缺陷病毒(HIV)感染在全球的蔓延，寻求有效的治疗和预防方法成为当务之急。90年代以来，人们开始探索基因治疗的新途径。基因治疗就是将外源性基因转移到合适的靶细胞中，使其表达为RNA或蛋白质，在基因水平上改变病毒或宿主基因的表达，以达到控制病毒增殖的目的。     

甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC-a基因的克隆、原核表达及鉴定

目的:克隆甲型副伤寒沙门菌1相鞭毛蛋白抗原(H1抗原)fliC-a基因,构建原核表达系统并鉴定重组蛋白的抗原性。方法:PCR方法扩增fliC-a基因,克隆到质粒pET-42a构建原核表达载体pET-fliC-a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的重组蛋白rfliC-a表达,用SDS-PAGE鉴定rfliC-a,Western blot和双向免疫扩散法鉴定rfliC-a的抗原性和免疫原性。结果:成功表达并纯化获得相对分子量为14.4 kDa的重组蛋白rfliC-a,rfliC-a能与兔抗甲型副伤寒沙门菌全菌血清发生特异性结合,免疫家兔获得高效价抗体。结论:成功构建了fliC-a基因原核表达系统,所表达的rfliC-a具有良好的抗原性。     

ATRN基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定针对基因ATRN的特异性siRNA真核表达载体。方法:根据ATRN基因cDNA序列,设计针对目的基因ATRNcDNA序列的3个siRNA靶序列,将其插入H1启动子下游,克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo中,转化DH5α菌株扩增,提取质粒通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。结果:酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论:本研究成功构建针对ATRN的特异性真核表达载体,为进一步研究ATRN基因在雄性生殖系统的功能奠定基础。     

含信号肽的Mtb8.4/hIL12嵌合基因真核表达质粒的构建及在COS-7细胞中的表达

[目的]克隆结核分枝杆菌含信号肽的Mtb8.4（MS）/hIL12嵌合基因,导入真核表达载体pCI-neo,并在COS-7细胞中进行表达。[方法]首先以pcDNA3.1（＋）-含信号肽的Mtb8.4（pMS）为模板,经聚合酶链反应（PCR）扩增出MS-linker基因,与pCI-neo载体进行连接重组,构建成pCI-neo-MS-linker（pMSL）重组质粒,然后以pORF-hIL12质粒为模板,经PCR扩增出hIL-12基因,将hIL-12基因与pMSL质粒进行连接重组,构建成MS/hIL12嵌合基因真核表达质粒,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等多种分子生物学方法进行鉴定;重组嵌合质粒转染COS-7细胞后,用RT-PCR方法鉴定MS/hIL12嵌合基因在转录水平的表达情况。[结果]MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功;转染COS-7细胞后,MS/hIL12嵌合基因在转录水平成功表达。[结论]MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建及在COS-7细胞中的成功表达,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病MS/hIL12嵌合基因疫苗奠定了基础。     

猪链球菌2型溶血素sly基因的表达及其产物的纯化和活性研究

目的 克隆并表达猪链球菌2型(SS2)溶血素基因(sly),为筛选SS2疫苗保护性抗原奠定基础.方法 用PCR方法从SS2临床分离株05ZYH33的基因组DNA中扩增出溶血素基因片段,将目的 基因插入表达载体pET-30b(+)中,构建重组表达载体pET30b-sly.重组载体经限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定后,转化大肠埃希菌(E.coli Rosetta).IPTG诱导表达,镍离子亲和层析纯化重组蛋白,鉴定目的 蛋白的免疫学活性以及溶血活性.结果　PCR扩增的sly基因长度约为1500 bp,经测序分析,插入载体的sly基因序列准确并保持了正确的读框.经IPTG诱导的目的 蛋白表达量约占总蛋白的30%,亲和层析纯化后,蛋白纯度达80%以上.Western blot检测证实该蛋白能与感染SS2的人血清发生特异性结合.溶血试验表明重组蛋白溶血素能使猪红细胞发生溶解,溶血价为256.结论 成功构建了表达载体pET30b-sly,该载体可在大肠埃希菌中表达,表达蛋白具有免疫反应原性及溶血活性.     

抗菌肽D基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的　将抗菌肽D基因克隆至甲醇营养型酵母表达载体pPICZα A中 ,并与α factor信号肽相连接 ,经EcoRⅠ酶切分析和PCR扩增鉴定 ,获得阳性重组子。方法　用锂盐法将重组表达载体转化巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)受体菌GS115 ,筛选获得阳性克隆。结果　将阳性菌落发酵产物进行抑菌试验 ,表达产物有较强的杀菌作用 ,表达产物杀菌活性达到5 6 5 6U ml。结论　抗菌肽D基因已经导入酵母细胞并整合在其基因组中 ,表达产物均具有高效的杀菌作用 ,有希望开发成为一种新型的抗菌消毒药物。     

家蝇幼虫抗菌肽diptericin2基因的克隆及原核表达-鉴定

目的扩增出全长diptericin2基因,并构建表达pGEX-4T-1/diptericin2重组蛋白。方法运用经典的5′末端扩增法(5′-Full RACE)法,通过双酶切、连接反应,将目的基因片段定向插入到表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠埃希菌BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析diptericin2重组蛋白的表达情况,蛋白质印迹实验(Western-blotting)对其进行了鉴定。结果获得目的片段468bp的家蝇抗菌肽diptericin2基因(GENBANK登录号FJ795370),双酶切鉴定及DNA测序结果显示,目的基因diptericin2已成功连接到表达载体pGEX-4T-1上,SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为27 kDa。结论扩增出了全长diptericin2基因并成功构建pGEX-4T-1/diptericin2重组蛋白原核表达系统,融合蛋白以包涵体形式在大肠埃希菌BL21中表达,为下一步研究其生物活性打下初步的基础。     

HIV—1基因亚型的研究现状

人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）于１９８３年被分离并证实为艾滋病（ＡＩＤＳ）的病原。随后，ＨＩＶ被划分为ＨＩＶ－１和ＨＩＶ－２两型。ＨＩＶ－１是目前在全球几乎所有的国家或地区广泛流行的ＨＩＶ毒株。９０年代初以来，根据ＨＩＶ毒株的外膜糖蛋白基因核苷酸序列的差...     

德宏州暗娼人群HIV监测指纹识别技术应用

目的 了解云南省德宏州暗娼人群艾滋病病毒（HIV）监测中指纹识别技术应用情况。方法 利用指纹识别技术建立云南省德宏州暗娼人群HIV监测队列,对所收集信息进行整理分析。结果 2011-2015共监测暗娼6 893人,其中,实现指纹采集人数比例为76.9%（5 299/6 893）,历年指纹采集率依次分别为66.2%（1 015/1 534）、78.5%（1 246/1 588）、75.2%（1 735/2 308）、92.9%（1 885/2 028）、92.1%（1 243/1 349）;未采集指纹者HIV阳性率2.1%（36/1 683）,指纹采集者HIV阳性率1.0%（69/7 124）;指纹仅采集1次者HIV阳性率1.4%（55/4 007）,指纹采集2次者HIV阳性率0.5%（14/3 117）。结论 指纹识别技术在德宏州暗娼人群HIV监测作为身份识别手段具有一定优势,能在一定程度上规避阳性者的重复检测。     

Toll样受体基因表达水平在儿童时期的变化及其意义

【目的】观测单个核细胞Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)2、3、4的基因表达水平在儿童时期的变化,探讨其在天然免疫发育中的意义。【方法】收集0~15岁健康儿童的外周血,共259份标本,分离单个核细胞,采用RT-荧光定量PCR法测定TLR2、3、4 mRNA。【结果】婴幼儿TLRs基因表达水平较高,其后有所下降,男童至青春期达到第二个高峰。性别对TLRs mRNA水平具有影响,表现为学龄前期儿童TLR2、3、4 mRNA水平女童高于男童,而9岁以后TLR2、3、4 mRNA水平女童普遍低于男童。【结论】TLRs基因表达水平存在年龄和性别相关的变化。年幼儿TLRs的高表达表明在婴幼儿时期,天然免疫系统对外界病原体的识别就已经相当完善。学龄前期及青春期前后儿童,确实存在性别有关的TLRs的表达差异,可能与其性激素的水平有关。     

绿色荧光蛋白标记HIV融合蛋白基因表达载体

目的利用基因工程技术，构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的HIV（ENV-6C）基因的表达载体。并在E.coli BL21中高效表达。方法经核酸内切酶酶切、连接，构建重组表达载体pRSETB-HIV（ENV-6C）-GFP，通过十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、Western印迹杂交技术（Western blot）分析重组结果．转化到E．roli BL21中，荧光分光光度计检测含有重组质粒的大肠埃希菌培养物中重组蛋白的表达情况。结果成功构建重组原核表达载体pRSETB、HIV（ENV-6C）-GFP，并在E．coli BL21中实现高效表达，检则到发绿色荧光的融合蛋白GFP-HIV（ENV-6C）。结论融合蛋白具有人类免疫缺陷病毒（HIV）外壳蛋白的抗原活性，可用绿色荧光蛋白标记抗原，对制备HIV抗体及免疫诊断新技术有一定价值。     

主要黄病毒E蛋白抗原表位分析与初步鉴定

目的 对主要黄病毒结构蛋白的抗原表位情况进行系统分析,鉴别共同及特异性抗原表位并对可能的特异性抗原表位进行原核表达.方法 分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对登革病毒1～4型、流行性乙型脑炎(乙脑)病毒及黄热病毒E蛋白的亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Garnier-Robson的二级结构进行分析,预测可能的抗原表位.在此基础上,根据表位位置和氨基酸序列的相似性,分析6种病毒的共有及特异性抗原表位,并参考GenBank中的序列信息,对预测的抗原表位进行比对,进一步分析抗原表位在不同病毒株中的保守性.然后利用pET32及pMAL-c2x系统对可能的特异性抗原表位进行高效原核表达、Western blot验证其抗原性.结果 经系统的生物信息学分析,共预测获得登革病毒1～4型、乙脑病毒及黄热病毒共有抗原表位15个,病毒特异性抗原表位47个.利用pET32及pMAL-c2x系统对6种病毒部分可能的特异性抗原表位进行了高效表达.Western blot结果显示登革病毒1型及2型表达抗原片段表现良好的抗原反应原性,并与试验中所用其他黄病毒及甲病毒多克隆抗体无明显的交叉反应.而所表达的登革病毒3型和4型、乙脑病毒及黄热病毒片段无抗原反应原性.结论 6条原核表达抗原片段经Western blot验证,获得登革病毒1型和2型特异性抗原片段.     

砷对NIH 3T3细胞谷胱甘肽水平、相关酶活性及其基因表达的影响

【目的】探讨急性、慢性砷暴露对小鼠成纤维细胞(NIH 3T3细胞)氧化还原状态的影响，进而探讨其对细胞谷胱甘肽(GSH)水平、相关酶活性及其基因表达的影响。[方法]将经过不同浓度砷处理的细胞，抽提细胞总蛋白。采用经过改进的Clark法测定细胞中谷胱甘肽；采用Thomas法测定谷胱甘肽还原酶(GR)活性；使用分光光度法测定谷胱甘肽与1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)的结合以确定谷胱甘肽转移酶(GST)活性。采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和固定化蛋白质的免疫学测定法测定血红素氧化酶(HO-1)蛋白表达；采用RNA印迹法测定谷胱甘肽还原酶(GR)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的基因表达。【结果】急性砷处理细胞在较低浓度范围可以引起GSH水平的增加；而当砷浓度高于25μmol/L时，GSH水平降低；在0．1和0．5μmol／L慢性染毒之后细胞GSH水平明显降低。然而，在急性和慢性砷处理组GST和GR的活性均有升高，而在高浓度24h处理组则显著降低；GR的mRNA水平与GR的活性相一致，在急、慢性染毒组中均表现为GR的mRNA表达上调；砷可以引起血红素氧化酶-1(HO-1)蛋白水平的增加。急性、慢性砷处理均引起GSH-PxmRNA表达下调。【结论】三价砷可以引起氧化应激、GSH水平改变、以及相关酶活性及其基因表达的改变，急性与慢性砷接触对GSH系统的影响不尽相同，不同染砷浓度的作用也有不同。长期低浓度砷暴露所致GSH水平变化以及相关酶活性及其基因表达的改变在砷致病机制中可能起到十分重要的作用。     

三种细胞株细胞色素P450酶及芳香烃化合物受体基因表达比较

目的 利用HPAF-Ⅱ、SK-N-AS及MCL-5砖三种细胞株在体外培养的条例上,观察CYP1Al、CYP1B1、CYP2E1、CYP3A4砗种CYP450基因和AHR、ARNT两种芳香烃化合物受体基因的表达情况有效期进行比较。方法 本研究利用了RT-PCR方法对几种基因进行表达,并以β-actin作为内对照,对基因表达的强度进行比较分析。结果 HPAF-Ⅱ、SK-N-AS及MCL-5对AHR、ARNT、CYP1B1、CYP2E1及CYP3A4基因均有基本表达,CYP1A1、CYP3A4在HPAF-Ⅱ右表达高于SK-N-AS、MCL-5,CYP1B1、CY2E1在三种细胞株中表达差别没有显著性意义。结论 HPAF-Ⅱ、SK-N-AS及MCL-5细胞株中含有CYP1A1、CYP1B1、CYP2E1、CYP3A4四种CYP450基因及调近停些基因的AHR、ARNT基因,我们可以利用这些细胞株的特点,进一步用于CYP450、AHR及ARNT的研究。     

淋巴细胞表面CCR5在HCV与HIV感染中表达

目的探讨T淋巴细胞表面C—C趋化因子受体5（CCR5）在丙型肝炎病毒（HCV）感染、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染和HCV／HIV合并感染过程中的表达及意义。方法采用流式细胞术检测HCV感染组（n=21例），HIV感染组（n=14例），HCV／HIV感染组（n=28例）及正常对照组（n=30例）人外周血CD4＋和CD8＋T淋巴细胞表面CCR5的表达。结果与正常对照组相比，外周血CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞表面CCR5，HIV感染组高表达（P〈0．01），HCV感染组和HCV／HIV合并感染组中低表达（P〈0．01）。结论淋巴细胞表面CCR5的表达，HIV感染时升高、HCV感染时降低，HCV／HIV合并感染时HCV感染的作用更强。     

Expression analysis of radiation-responsive genes in human hematopoietic stem/progenitor cells

To clarify the nature of the genes that contribute to the radiosensitivity of human hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs), we analyzed the gene expression profiles detected in HSPCs irradiated with 2 Gy X-rays after culture with or without an optimal combination of hematopoietic cytokines. Highly purified CD34⁺ cells from human placental/umbilical cord blood were used as HSPCs. The cells were exposed to 2 Gy X-irradiation and treated in serum-free medium under five different sets of conditions for 6 h. The gene expression levels were analyzed by cDNA microarray, and then the network of responsive genes was investigated. A comprehensive genetic analysis to search for genes associated with cellular radiosensitivity was undertaken, and we found that expression of the genes downstream of MYC oncogene increased after X-irradiation. In fact, the activation of MYC was observed immediately after X-irradiation, and MYC was the only gene still showing activation at 6 h after irradiation. Furthermore, MYC had a significant impact on the biological response, particularly on the tumorigenesis of cells and the cell cycle control. The activated gene regulator function of MYC resulting from irradiation was suppressed by culturing the HSPCs with combinations of cytokines (recombinant human thrombopoietin + interleukin 3 + stem cell factor), which exerted radioprotective effects. MYC was strongly associated with the radiosensitivity of HSPCs, and further study and clarification of the genetic mechanisms that control the cell cycle following X-irradiation are required.     

恙虫病东方体蛋白基因的原核表达及活性鉴定

目的 对恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因进行原核表达，并对表达产物进行纯化，以获得有生物活性的重组蛋白，用于恙虫病诊断试剂的研制。方法 根据GiUiam株东方体56kDa蛋白基因序列设计特定引物。用PCR法扩增出编码56kDa抗原长约1320bp的DNA，克隆至原核载体PET28a，构建了表达载体PET-OTG，并获表达。表达产物经镍(Ni2 )柱亲和层析纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹(Western—blot)分析鉴定。并用间接ELISA进行抗原性分析。结果SDS—PAGE检测表明重组蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体两种方式表达，在相对分子质量约52kDa处有表达目的条带。经 Ni^2 层析柱纯化得到目的蛋白，包涵体蛋白纯化后纯度大于可溶性蛋白，达电泳纯。Western-blot证实该蛋白能被患者阳性血清所识别，用阴性血清则未出现相应印迹。间接ELISA结果表明重组蛋白具有良好的抗原性，能有效区分恙虫病阳性和阴性血清。结论 重组蛋白具有免疫反应活性。有望作为诊断抗原用于恙虫病的诊断。