WHO HLA命名委员会命名的新等位基因HLA-A*24:327序列分析及确认

目的 发现一个人类白细胞抗原(HLA)-A新等位基因并对其核苷酸序列进行分析及确认。方法 采用序列特异性寡核苷酸探针技术(SSO)对2015年中国造血干细胞捐献者资料库(CMDP)陕西分库入库数据进行HLA常规检测,针对罕见结果进一步选择多聚酶链反应-测序(PCR-SBT)和组序列特异性引物(GSSP)进行确证试验,明确突变位点。结果 SSO分型结果显示为罕见等位基因,经PCR-SBT复核无完全匹配结果,提示疑似新等位基因,经GSSP确证发现该基因与同源基因HLA-B*24:02:01:01相比,在第3外显子544位置发生碱基变异由G>A,该突变造成氨基酸序列158位由丙氨酸(GCC)变成苏氨酸(ACC)。结论 确认了一个新的HLA-A等位基因,2015年12月31日被世界卫生组织HLA命名委员会正式命名为HLA-A*24:327。     

HLA新等位基因HLA-A~*2451的认定

目的发现和认定1个HLA新等位基因。方法应用PCR-SSO基因分型技术筛选可能的HLA新等位基因,PCR产物测序和基因克隆DNA测序,通过软件分析基因序列及与最同源HLA等位基因序列的差异。结果检出1样本,其HLA-A位点显示出多种不一致的结果,其中包括与已知所有HLA-A等位基因谱型不一致的新谱型,其HLA-A位点第3外显子序列与所有已知HLA-A等位基因序列不一致。软件分析表明该基因序列与同源性最高等位基因A*2415的差异只是在外显子3区域中的363位碱基发生了G→A1个碱基替代,并导致相应的121密码子由ATG(M)→ATA(I)。结论该等位基因为HLA-A位点的1个新等位基因,已被WHOHLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*2451。     

新等位基因HLA-A~*11:97与HLA-B~*44:127的确认

背景:近几年来,随着分子生物学的发展及人类白细胞抗原分型技术的提高,人类白细胞抗原新等位基因不断被发现。目的:识别并确认两个新的人类白细胞抗原等位基因。方法:应用PCR-SBT、GSSP及单链测序基因分型技术对两份中华骨髓库供者样本进行人类白细胞抗原A,B,DRB1位点进行基因分型,对新等位基因进行DNA测序并与已知同源性最高的等位基因型进行序列比对。结果与结论:两个样本各有一个位点与目前已知的相应人类白细胞抗原A、B等位基因序列均不一致,样本1与其同源性最高的A*11:01:01的差异表现在第2外显子区域中的193G>T,194C>T,导致第41位密码子由丙氨酸变为亮氨酸,样本2与其同源性最高的B*44:02比较差异表现在第2外显子区域中第320位碱基由G>A,导致编码的第83位密码子由精氨酸变为组氨酸。说明两个样本分别为人类白细胞抗原A和B位点的新等位基因,并已被WHO人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为人类白细胞抗原A*11:97和B*44:127。     

HLA-A*110104新等位基因的克隆与序列分析

目的识别并确认中国人群HLA新等位基因。方法采用基因克隆、测序及生物信息学技术,分析HLA新等位基因与HLA已知基因序列的差异。建立HLA新等位基因序列特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)分型方法,并对1200名HLA-A*11阳性的造血干细胞移植无关供者(包含100名HLA-A*11纯合子个体)进行HLA新等位基因筛选和频率分析。结果HLA新基因与A*110101的差异只是在外显子3区域中279位碱基发生C→T突变,导致93位密码子由CAC变为CAT,但氨基酸未发生变化,并最终被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*110104。该新基因出现在2个无关家系中,分别具有2～3代遗传史。在1200名无关供者中未发现其他带有新基因的个体。其基因频率为0．000 83。结论HLA-A*110104新基因具有稳定的遗传性和一定的普遍性,对无关供者的选择和人类学、遗传学等的研究具有一定意义。     

新等位基因HLA-A~*1127的确认和序列分析

目的识别确认临床样本中一个新的HLA等位基因。方法应用PCR-SSO,PCR-SSP基因分型技术对HLA分型,对可能的HLA新等位基因进行分子克隆和DNA测序,分析与最同源的A*1104的差异。结果该序列与已知的所有HLA-A等位基因序列不一致,与A*1104的差异表现在第3外显子区域中的核苷酸570 G→C,571 T→G导致氨基酸分别由谷氨酸→天冬氨酸,色氨酸→甘氨酸。结论该基因为HLA-A位点的一个新等位基因,已被WHO HLA因子命名委员会于2007年8月正式命名为HLA-A*1127。     

HLA新等位基因A*3018的序列分析和确认

为了识别和确认中国汉族人群中的HLA新等位基因,使用PCR-SSP、FLOW-SSO以及PCR-SBT等HLA分型技术,发现样本A位点的杂合结果A*240201,300101在外显子2有3个位置与数据库不相符。用组特异性引物分别扩增A*24及A*30基因,对外显子2、3、4进行双向测序,发现1个与A*300101序列相近的新等位基因。分析该等位基因与A*300101序列的差异。用EB病毒感染外周血B淋巴细胞,建立该等位基因的无限增殖化B淋巴细胞系。结果表明:该基因与A*300101相比在外显子2有3个碱基的改变,碱基121A→C、123T→C导致密码子17AGT->CGC,17S(丝氨酸)→R(精氨酸);碱基126A→G导致密码子18GGA→GGG,18G(甘氨酸)→G(甘氨酸),该氨基酸是同义突变。成功建立了该等位基因的无限增殖化B淋巴细胞系,该基因序列已提交GenBank,编号为DQ872509。结论:该等位基因为新的HLA-A等位基因,已于2006年8月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*3018(上报编号HWS10004039)。     

新的HLA-A等位基因A~*0290的认定

目的确认1个中国人群中的HLA新等位基因。方法使用PCR-SSP和测序为基础的分型技术,分析确认HLA-A的新等位基因与A*02010101的差异。结果先证者HLA-A位点有1个等位基因的核苷酸序列与已知的HLA等位基因均不同,该基因和A*02010101的差异在第2外显子区域的292位碱基C>G,导致74编码子CAC>GAC,编码的氨基酸由组氨酸(His)变成天冬氨酸(Asp)。结论该基因为HLA新的等位基因,2005年10月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*0290。     

HLA新等位基因HLA-A~* 33:39的序列分析及鉴定

目的人类白细胞抗原(HLA)新等位基因HLA-A*33∶39的序列分析及鉴定。方法利用多聚酶链反应—基于测序的分型(PCR-SBT)技术鉴定HLA新等位基因。结果发现1个与A*33∶03∶01序列相近的未知等位基因,实验结果表明其在A*33∶03∶01第4外显子649位G>A,其突变造成A*33∶03∶01氨基酸序列中192位的丙氨酸(A)>苏氨酸(T)。结论此为HLA-A位点的1个新等位基因,2010年10月被世界卫生组织HLA命名委员会命名为HLA-A*33∶0339。     

10个HLA新等位基因的测序确认

目的用DNA测序方法确认HLA新等位基因。方法对常规流式荧光微珠HLA分型方法无法给出确切结果的标本,采用序列特异性引物测序、单倍型测序、克隆测序等方法确认新的等位基因序列,将测得的序列与已知的最相近序列进行比对,可疑新等位基因序列提交GenBank进行注册,向WHOHLA因子命名委员会申报确认。结果2004年5月—2005年12月共进行常规检测12193人份,发现可疑标本21份,测序确认为新等位基因的有10份,申报确认为新的HLA等位基因,已经被正式命名。结论测序是确认HLA基因序列的金标准,但常规直接测序并不能解决全部问题,需要借助组序列特异性引物(GSSP)测序、单倍型测序、克隆测序等方法加以解决。     

新等位基因HLA-B~* 9537的确认和序列分析

目的识别并确认1个新的HLA等位基因。方法应用PCR-SSO,PCR-SSP基因分型技术对1份临床样本做HLA分型,对可能的HLA新等位基因进行分子克隆和DNA测序,分析与最同源的B*1504的差异。结果得到1份样本的序列与已知的所有HLA-B等位基因序列不一致,与B*1504的差异表现在第3外显子区域中的379G>C,409C>T,412G>A,419C>T,导致氨基酸分别由谷氨酸→天冬氨酸(E103D),苏氨酸→赖氨酸(T113K),谷氨酰胺→谷氨酸(Q114E)和丝氨酸→苯氨酸(S116F)。结论该基因为HLA-B位点的1个新等位基因,已被WHOHLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*9537     

HLA-A新等位基因A*01∶01∶51的DNA序列分析

目的 分析HLA-A*01∶01∶51新等位基因的序列.方法 应用SBT基因分型技术,通过位点特异性PCR扩增和组特异性PCR扩增,对扩增产物进行HLA-A基因的第2、3、4外显子双向测序,将测序结果与数据库进行比对,确认突变的位置.结果 组特异性引物扩增结果显示A位点有2个等位基因,其中1个为A*02∶07∶01,另1个为新等位基因.经BLAST分析,新等位基因与HLA-A* 01∶01∶01∶01序列仅在第4外显子上有1个碱基不同,即第762位C→T,254位氨基酸CTC→CTT,氨基酸没有改变,仍为亮氨酸.新等位基因序列已递交Genebank(JX629459).结论 该HLA-A新等位基因于2012年9月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为A*01∶01∶51.     

新等位基因HLA-B~*5413的确认

目的确认1个新的等位基因HLA-B*5413。方法应用PCR-SSP技术作HLA分型检测;PCR-SS0技术作HLA分型复核;DNA测序技术进行新等位基因的核苷酸序列测定,在NCBI和EBI基因数据库上进行基因序列比对分析验证,最后提交。结果新等位基因与所有已知的HLA-B位点的等位基因的序列均不相同,与同源性最高的HLA-B*5401相比,在第2外显子上有6个核苷酸差异:第229位置上G>A,导致第77位Ser>Asn,第238位置上A>T,导致第80位Asn>Ile,第240、241位置上C>G、T>C导致第81位Leu>Ala,第244位置上G>T,导致第82位Arg>Leu,第246位置上G>C导致第83位Gly>Arg。结论2007年4月世界卫生组织HLA新基因命名委员会正式将这例新基因命名为HLA-B*5413。     

新等位基因 HLA-B*40: 162 测序分析及确认简

本研究旨在识别并确认中国人群中HLA-B位点的一个新等位基因.应用PCR-SBT对中华骨髓库供者样本进行HLA分型,对可能的HLA-B新等位基因利用组序列特异性引物（GSSP）及单链测序基因分型技术进行测序,并与已知同源性最高的等位基因进行序列比对,分析二者差异.结果发现,有1个样本的HLA-B位点与目前已知的HLA-B基因序列均不一致,与其同源性最高的B＊40：06：01的差异表现在第2外显子272位碱基由C＞T,导致第67位密码子由丝氨酸变为苯丙氨酸.结论：确认该基因为HLA-B位点的1个新等位基因,已经被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B＊ 40：162.     

发现1例新的HLA-A等位基因A~*0299

目的发现和认定一个中国人群中的HLA-A位点新等位基因。方法使用PCR-SSP和PCR-SSO为基础的分型技术筛选可能的HLA新等位基因,应用分子克隆技术和DNA测序的方法确认与最同源HLA等位基因序列的差异。结果发现一个样品的HLA-A位点结果异常。DNA克隆的测序结果表明,此A位点序列与已知的A*020601的差异在于第3外显子区域中的184位碱基发生了T>A碱基的替换,导致152编码子GTG>GAG,编码的氨基酸由Val>Glu。结论该等位基因为HLA-A位点的一个新等位基因,已被WHO HLA因子命名委员会于2006年7月14日正式命名为HLA-A*0299。     

HLA新等位基因HLA-B*35:155的确认

目的发现和认定一个人类白细胞抗原(HLA)新等位基因。方法应用多聚酶链式反应—基于测序的分型技术(polymerase chain reaction-sequence based typing,PCR-SBT)进行HLA常规分型,HLA-B位点分型结果与等位基因B*35:03:01,51:01:01在112位有一个碱基不匹配,不能指定为任何HLA-B位点等位基因,用针对于B*35、B*51的序列特异性SSSP引物测序,确认与同源性最高的HLA等位基因序列的差异。结果测序结果表明该等位基因与其同源性最高的等位基因B*35:03:01的差异是在第2外显子112位的C>T,其突变导致密码子CGG>TGG,结果造成B*35:03:01氨基酸序列中14位的精氨酸(R)变为色氨酸(W)。结论该等位基因为HLA-B位点的一个新等位基因,世界卫生组织(WHO)HLA命名委员会将其正式命名为HLA-B*35:155。     

HLA-B新等位基因B~*4069的确认

目的识别和确认中国人群的HLA新等位基因。方法使用PCR-SSO技术进行HLA分型工作,发现反应格局异常的新等位基因,采用DNA双向测序技术测定新等位基因的核苷酸序列,并与已知等位基因进行序列比对分析。结果检出1个样本HLA-B位点反应格局异常,DNA测序结果显示HLA-B位点的1对等位基因分别为B*5801和1个核苷酸序列与已知HLA等位基因均不同的新等位基因。该基因序列与同源性最高的HLA-B*400101基因序列相比在第2外显子区域中263位碱基发生C>T突变,导致64位编码氨基酸由苏氨酸(Thr)>异亮氨酸(Ile)。结论该等位基因为新的HLA-B位点等位基因,2006年9月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*4069。     

DNA测序鉴定HLA新等位基因B~* 35:03:07

本研究旨在分析鉴定中国人群HLA-B位点一个新等位基因。应用PCR-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)技术检测到一个与HLA-B*35:03:01相关的未知基因,应用DNA序列分析技术鉴定并分析该基因与同源性最高的HLA等位基因的序列差异。结果表明,先证者HLA-B位点有1个等位基因的核苷酸序列与所有已知基因序列均不相同,与同源性最高的HLA-B*35:03:01相比,第3外显子387位碱基由C→G,并导致相应的105位密码子编码的氨基酸由CCC变为CCG,编码的氨基酸没有改变,仍为苯丙氨酸。结论:被测样本含有HLA-B新等位基因,WHO HLA因子命名委员会将其正式命名为HLA-B*35:03:07。     

DNA序列分析鉴定HLA新等位基因B~*0740

目的确认一个中国人群中的新HLA等位基因。方法应用单倍型特异性分离(haplotype-specific ex-traction,HSE)技术和DNA序列分析技术鉴定HLA-B~*的新等位基因。结果被检标本HLA-B位点有一个等位基因的核苷酸序列与任何已知的HLA等位基因均不同,与同源性最高的B~*0705相比,在exon3区域中的605位碱基由A>T,引起编码178位的氨基酸由赖氨酸(K)变成甲硫氨酸(M)。血清学分型表明新等位基因的免疫学表型仍为HLA-B7。家系分析提示,HLA-B~*0740基因来源于其母亲。结论该等位基因序列为HLA-B位点的一个新等位基因,于2005年2月由WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B~*0740。     

克隆测序确认HLA新等位基因B*3712

目的：由于技术原理的限制，目前尚不能对所有的HLA等位基因进行严格的区分，特别是以往没有发现的新基因序列只能通过测序的方法解决，然而，当遇到等位基因杂合时，测序给出的结果仍然无法确认新的序列改变发生在等位基因的哪一侧，这时需要用分子生物学方法分离杂合子然后进行测序才能确定新的基因序列。采用基因克隆方法确认HLA新等位基因。 方法：实验于2006-01／05在河南省红十字血液中心HLA实验室，美国海军骨髓库HLA实验室完成。造血干细胞血样由中华骨髓库提供。采用荧光微珠HLA分型方法对中华骨髓库捐献者血样进行HLA分型检测，无法给出确切结果的摸棱两可结果标本用基因克隆（TOPO TA Cloning）、DNA测序的方法确认新的HLA基因序列。 结果：通过克隆分离杂合等位基因，再进行测序确认发现新的序列与B^＊3709相比，出现4个核苷酸改变：1．355nt C〉A，2．363nt C〉G，3．412nt G〉A，4．477ntC〉G，而且均发生在H哺B基因外显子3（exon3）。4处改变引起氨基酸编码改变：①编码95CTC〉ATC，氨基酸改变L〉1（亮氨酸〉异亮氨酸）。②97AGC〉AGG．S〉R（丝氨酸〉精氨酸）。③114GAC〉AACD〉N（天门冬氨酸〉天冬酰胺）。（9135GCC〉GCGA=A无氨基酸改变。 结论：①新的基因序列已经在GenBnak注册，被WHO的HLA因子命名委员会得到正式命名为HLA-B^＊3712基因。②基因克隆是确认HLA新基因的根本方法。     

人类白细胞抗原新等位基因B*07:110的序列分析及确认

背景：近几年来,随着中华骨髓库的建立和人类白细胞抗原分型技术的不断发展和提高,中国人类白细胞抗原新等位基因不断被发现。目的：采用序列分析确认1例中国人的人类白细胞抗原新等位基因。方法：应用聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针基因分型技术进行样本的人类白细胞抗原基因分型,并应用基于测序的方法分析该基因序列及与最相近等位基因序列的差异。结果与结论：聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针结果显示,该样本人类白细胞抗原B基因座反应格局出现异常;基因测序结果表明,其B基因座第2外显子序列与所有已知人类白细胞抗原B等位基因序列均不一致,在所检测的第2、3外显子中,与序列同源性最高的等位基因B*07：01：02的差异是在第2外显子发生了nt 226和nt 228两个A->G核苷酸取代,导致第76位密码子由ATA->GTG,相应的导致氨基酸由异亮氨酸(I)改变为缬氨酸(V)。将其序列提交国际基因数据库(GenBank)及IMGT/HLA数据库,证实该新人类白细胞抗原等位基因为国际上首次发现,被世界卫生组织织人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为人类白细胞抗原B*07：110(HM989017)。