人端粒酶反转录酶基因诱导人永生化成骨细胞的生物学特性

目的：研究反转录病毒(hTERT)基因诱导的人永生化成骨细胞系Clone5的生物学特性，包括增殖能力、细胞周期和是否恶性变。方法：收集30～31代Clone5和6～7代人成骨细胞(hOB)，绘制两种细胞的生长曲线并用流式细胞仪检测细胞周期特征，软琼脂集落实验和裸鼠致瘤实验检测Clone5是否恶性变。结果：由生长曲线计算出细胞倍增时间：hOB：190h；Clone5：62h；曲线显示Clone5的增殖能力明显增强；流式细胞仪检测发现，Clone5细胞周期中G1期细胞占53．46％，S期细胞占28．24％，凋亡率为0．76％，hOBG，期细胞占79．81％，S期细胞占19．76％，凋亡率为33．33％。和hOB相比。Clone5 G1期细胞比例减少，S期比例增加，细胞的凋亡率显降低；软琼脂集落实验未见细胞团形成，裸鼠接种不致瘤。结论：转导hTERT基因的Clone5增殖能力明显增强，凋亡率降低，且未发生恶性变，可用做组织工程的种子细胞和研究正常骨生理、生化的工具细胞。     

不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶反转录酶表达的比较

目的:目前已知端粒酶活性的丧失及其增殖相关基因表达的改变是造成多种成体干细胞体外复制和扩增受限的主要原因,而端粒酶反转录酶对端粒酶活性起关键作用。体外分离培养人胚胎、少儿、成人3种不同皮肤来源的表皮干细胞,对比观察不同发育阶段端粒酶反转录酶表达的差异。方法:实验于2005-09/2007-04在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。①对象:因创伤等原因致意外流产的妊娠24～26周龄胎儿皮肤标本,4～12周岁少儿及25～45岁成年人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本,分别由南昌大学第一附属医院产科、烧伤科提供,产妇与烧伤患者对治疗及实验均知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法:取胎儿、少儿和成年人的全层皮肤,用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,胶原快速贴附法纯化人表皮干细胞,用未黏附的角质细胞作为对照,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液组成的表皮干细胞培养基进行体外培养。③实验评估:通过β_1整合素、角蛋白19、p63免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定,计算克隆形成率。以免疫细胞化学染色法和图像定量分析法检测3种不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶的表达差异。结果:①细胞生长特征:分离培养的人表皮干细胞呈明显克隆性生长,克隆形成率高于角质细胞对照组(P<0.05)。②表皮干细胞的鉴定:细胞克隆经免疫细胞化学染色后,β_1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达。③端粒酶反转录酶免疫细胞化学染色及定量表达:不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶均呈阳性,但表达强度不同,人胚胎>少儿>成人。3种皮肤来源的表皮干细胞平均吸光度值和阳性面积值均随年龄增加而逐渐降低,人胚胎>少儿>成人(P<0.05)。结论:人胚胎、少儿、成人皮肤来源的表皮干细胞均有端粒酶反转录酶表达,其表达强度依次减弱。提示诱导和增强端粒酶反转录酶的表达对维持表皮干细胞在体外自我更新和增殖能力可能具有重要意义。     

人端粒酶反转录酶基因转染人胚胎大脑皮质神经元的凋亡

背景：人端粒酶反转录酶重组腺病毒转染原代培养的人胚胎大脑皮质神经元,可以促进细胞生存,抑制凋亡。目的：观察人端粒酶反转录酶对β淀粉样蛋白（amyloidβ-protein,Aβ）诱导人胚胎大脑皮质神经元凋亡的影响。方法：人胚胎大脑皮质神经元原代培养后,分为3组：对照组、Aβ25-35组和人端粒酶反转录酶组。Aβ25-35组和人端粒酶反转录酶组细胞在培养144 h后,用Aβ25-35 5μmol/L干预24 h。人端粒酶反转录酶组在Aβ25-35 5μmol/L干预72 h进行人端粒酶反转录酶基因转染。结果与结论：原代培养的人胚胎大脑皮质神经元培养7 d后,出现凋亡细胞,而Aβ25-35干预后使凋亡细胞数量增加,而人端粒酶反转录酶可防止Aβ25-35诱导的人胚胎大脑皮质神经元的凋亡。     

携带人端粒酶反转录酶基因脐血间充质干细胞移植治疗肺动脉高压

背景:保护机体肺血管的内皮细胞,是降低肺循环压力,预防肺动脉高压的重要环节。目的:观察携带人端粒酶反转录酶基因的脐血间充质干细胞移植对大鼠肺动脉高压的治疗作用。方法:体外进行脐血间充质干细胞的培养及纯化,在腺病毒介导下使人端粒酶反转录酶基因成功导入脐血间充质干细胞。将60只SD大鼠随机分成3组:肺动脉高压组、空腺病毒组、腺病毒转染组,每组20只,腹腔注射野百合碱进行肺动脉高压模型复制后,于颈内静脉分别注射1 mL的伊戈尔低糖培养基(L-DBEB),1 mL(1.5×1010 L-1)脐血间充质干细胞悬液,1 mL(1.5×1010 L-1)腺病毒介导下人端粒酶反转录酶基因转染的脐血间充质干细胞悬液。移植21 d后检测各组大鼠血流动力学水平、血浆内皮素1水平以及右心室的肥大指数。结果与结论:各组大鼠动脉血压差异无显著性意义(P>0.05);与肺动脉高压组及空腺病毒组比较,腺病毒转染组大鼠肺动脉收缩期压力、平均肺动脉压均降低,差异有显著性意义(P<0.05);腺病毒转染组大鼠右心室肥大指数与肺动脉高压组及空腺病毒组相比较,差异均无显著性意义(P>0.05);腺病毒转染组大鼠血浆内皮素1水平明显低于肺动脉高压组及空腺病毒组,差异有显著性意义(P<0.05)。结果表明携带人端粒酶反转录酶基因的脐血间充质干细胞移植后,能够改善大鼠机体血流动力学异常状态,还可以保护机体血管内皮细胞。     

小分子干扰RNA介导的RhoA沉默优化胎肝干细胞培养

背景：细胞移植治疗是目前的研究热点之一,寻找良好的细胞来源并有效扩增,是大量临床应用的基础。目的：通过沉默RhoA基因优化胎肝干细胞培养方法。方法：体外培养胎肝干细胞,经小分子干扰RNA转染以沉默RhoA基因表达,分为3组：A组为干细胞组,B组为经随机打乱顺序的小分子干扰RNA转染干细胞组,C组为经小分子干扰RNA转染的干细胞组。应用反转录-聚合酶链反应、Western blot法检测胎肝干细胞在转染前后RhoA基因和蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝比色法观察细胞生长的优化作用;流式细胞术测定细胞周期分布的变化。结果与结论：转染小分子干扰RNA后C组与A、B组相比,RhoA基因和蛋白表达量明显降低（P〈0.05）,细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多,各组间差异有显著性意义（P〈0.05）。提示通过沉默RhoA基因的方法可以促进胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用。     

胶原酶和胰酶对胎鼠端脑神经干细胞培养的影响

背景：神经干细胞为神经发育和神经功能重建的研究带来了广阔前景,其体外培养已成为神经科学的一个研究基础。目的：比较胶原酶和胰酶对体外培养神经干细胞的作用。方法：取孕14d的SD大鼠,无菌条件下取胎鼠端脑,剪碎后分别用含EDTA的胰酶和Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞。结果与结论：胶原酶消化得到的神经干细胞呈单层贴壁生长,而用胰酶消化得到的则形成聚集体;Nestin免疫荧光鉴定细胞为阳性;获取的神经干细胞纯度大于99%。提示用胶原酶可以简单而快速地获得原代单层化贴壁生长的神经干细胞。     

人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体的构建

背景:外源性端粒酶反转录酶的表达可重建端粒酶活性,诱导细胞永生化.目的:采用慢病毒载体作为基因转移载体,克隆人端粒酶反转录酶的编码区全序列,同时选用绿色荧光蛋白作为目的基因表达标志物,构建人端粒酶反转录酶慢病毒表达载体.设计、时间及地点:开放性实验,单一样本观察,于2007-06/2008-03在暨南大学生物工程研究所及暨南大学附属第一医院中心实验室完成.材料:pBABE-puro-hTERT质粒由Robert Weinberg教授惠赠,质粒pDONR221,pLenti6N5一DEST,ccdB Survival,Stb13及293FT细胞由暨南大学生物工稃研究所提供.方法:以pBABE-puro-hTERT质粒为模板聚合酶链反应法获取目的基因人端粒酶反转录酶(包含酶切位点BglⅡ、HindⅢ),通过BP反应克隆至pDONR221,以质粒pEGFP-N1为模板,以聚合酶链反应法获取目的基因增强型绿色荧光蛋白(包含酶切位点Hind Ⅲ,Bg Ⅲ),通过酶切及连接反应形成pDONR221一hTERT-EGFP.采用LR重组酶将pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5一DEST-hTERT-EGFP.将PLenti6N5一DEST-hTERT-EGFP与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞.主要观察指标:通过酶切、聚合酶链式反应及测序验证重组质粒pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6N5-DEST-hTERT-EGFP是否构建成功.包装重组慢病毒,应用荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白在293FT细胞中的表达情况.结果:测序发现慢病毒入门载体pDONR221包含目的基因hTERT 1547位点存在点突变(原碱基A变成G),通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6N5-DEST-hTERT-EGFP成功构建.转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光.结论:实验成功构建了人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因的慢病毒表达载体,为人端粒酶反转录酶稳定转染提供快速、简洁的方法.     

DNA去甲基化对大鼠骨髓间充质干细胞端粒酶反转录酶的调节

背景:DNA去甲基化是一种重要的表观遗传修饰,对肿瘤细胞的端粒酶具有重要调节作用,而对骨髓间充质干细胞端粒酶活性有何影响尚不清楚.目的:观察DNA去甲基化对骨髓间充质干细胞增殖及端粒酶反转录酶蛋白表达的影响.方法:全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞;按照下列分组加入5-杂氮胞苷,使各组5-杂氮胞苷终浓度分别为0,3,6,12,24 μmol/L.加入5-杂氮胞苷后第1,2,3,5,7天进行指标检测.结果与结论:与对照组相比,5-杂氮胞苷干预24 h,各浓度组均显著促进细胞增殖活性(P < 0.05);干预48 h,6,12,24 μmol/L组显著促进细胞增殖活性(P < 0.05);干预72 h,12,24 μmol/L组显著抑制细胞增殖活性(P < 0.05);干预120,168 h,对照组与各浓度组间差异均无显著性意义(P > 0.05).5-杂氮胞苷干预48 h,6,12,24 μmol/L组端粒酶反转录酶蛋白IA值较对照组显著增加(P < 0.05).提示在一定浓度范围及一定作用时间内,5-杂氮胞苷可以促进骨髓间充质干细胞增殖与端粒酶反转录酶蛋白的表达.     

构建人端粒酶反转录酶基因腺相关病毒2载体在人髓核细胞的表达

背景：动物研究显示,自体髓核细胞移植能有效修复椎间盘退变。然而髓核细胞体外增殖能力差,这就限制了其作为种子细胞在椎间盘退变性疾病治疗中的研究及应用。 目的：构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2载体,观察其转染人髓核细胞后人端粒酶反转录酶基因的表达。 方法：构建pSNAV2.0-pRSV-hTERT质粒并鉴定,采用AAVMaxTM包装系统进行重组腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体的构建,以 PCR 及酶切方法验证构建的质粒,构建成功后扩增,并纯化。利用腺相关病毒2-增强型绿色荧光蛋白载体转染第1代人髓核细胞,测定最佳感染复数。参照此感染复数值,确定腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶对人髓核细胞转染的相关感染复数;对照组采用不含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2进行转染。转染后1,2,4周分别采用RT-PCR对人端粒酶反转录酶基因mRNA水平进行半定量检测。 结果与结论：实验成功构建了腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体;并获得了滴度达2×1011 v·g/mL的腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体。测得腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体对人髓核细胞的最佳感染复数为5×104 v·g/cel。在以1×104,5×104,1×105 v·g/cel 转染人髓核后,均可检测到人端粒酶反转录酶基因mRNA的高量表达。采用RT-PCR半定量检测方法,发现以转染后2周时人端粒酶反转录酶 mRNA表达量相对最高（P 〈0.05）,4周时仍可见人端粒酶反转录酶基因mRNA的稳定表达。而对照组无论在何时间点均未能检测到人端粒酶反转录酶mRNA的表达。提示利用腺相关病毒2可以成功构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的病毒载体,腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶能有效转染人髓核细胞并稳定表达人端粒酶反转录酶基因mRNA,此结果可能为增强髓核细胞性能提供新的策略。     

人端粒酶反转录酶对人胚胎皮质神经元损伤的保护**

背景：端粒酶可维持端粒长度,避免细胞复制性衰老和凋亡,其催化亚基端粒酶反转录酶还具有抗凋亡和调节细胞生存的作用。目的：观察人端粒酶反转录酶对β淀粉样蛋白1-40引起的人胚胎皮质神经元损伤的影响。方法：分离和培养12-16周龄人胚胎皮质神经元,将人端粒酶反转录酶基因重组腺病毒转染至神经元。免疫细胞化学法检测人端粒酶反转录酶基的表达,端粒重复序列扩增酶联免疫吸附法检测端粒酶活性。转染后第3天,给予10μmol/L β淀粉样蛋白1-40作用24 h 后,应用 MTT 检测细胞活力。荧光探针2’7’-二乙酰二氯荧光素标记检测细胞内活性氧水平,比色法测定细胞匀浆中谷胱甘肽含量。结果与结论：转染后第3天,人端粒酶反转录酶的表达最高,并重建了其端粒酶活性;10μmol/L β淀粉样蛋白1-40显著降低神经元的细胞活力和谷胱甘肽的含量(P <0.05和 P <0.01),升高活性氧水平(P <0.05)。转染了人端粒酶反转录酶基因的神经元能显著对抗β淀粉样蛋白1-40的毒性作用,增加细胞的活力和谷胱甘肽含量(P <0.05和 P <0.01),降低活性氧水平(P <0.05)。结果表明,人端粒酶反转录酶对β淀粉样蛋白1-40引起的人胚胎皮质神经元的损伤有明显保护作用。     

人端粒酶反转录酶启动子调控人钠碘同向转运体基因肿瘤靶向治疗的实验研究

目的:探讨肿瘤特异性人端粒酶反转录酶(hTERT)启动子调控的人钠碘同向转运体(hNIS)的特异性抗肿瘤作用。方法:将质粒pcDNA3.1-CMV-hNIS中的hNIS cDNA亚克隆至含hTERT核心启动子的质粒载体pGL3-hTERT-luc中,以构建质粒pGL3-hTERT-hNIS,并以质粒pGL3-hTERT-luc及pcDNA3.1-CMV-hNIS分别作为阴性对照及阳性对照,然后采用脂质体将其转染至人胚肺成纤维细胞MRC-5及肿瘤细胞HeLa、A549和U87中,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测hNIS mRNA水平;免疫细胞化学法及流式细胞术(FCM)检测hNIS蛋白的表达情况;摄碘实验验证hNIS蛋白的功能;同时采用MTT观察131I的细胞杀伤作用。结果:成功构建质粒pGL3-hTERT-hNIS,转染4种细胞后,3种肿瘤细胞的hNIS mRNA水平明显高于MRC-5细胞(P<0.05)。结论:hTERT启动子调控hNIS基因在肿瘤细胞中特异性表达,这些细胞可特异性摄碘并被其有效杀伤,为行进一步体内实验奠定基础。     

靶向端粒酶反转录酶基因短发夹RNA载体的构建

背景：端粒酶反转录酶对端粒酶活化起重要作用。 目的：利用pLentilox3.7.U6载体构建靶向大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA干扰分子表达载体并鉴定其作用。 方法：选择端粒酶反转录酶基因上两段序列体外合成RNA干扰分子的正义链和反义链模板序列,经退火成互补双链,与线性化pLentilox3.7.U6载体连接、转化大肠杆菌和序列测定,应用蛋白质印迹和免疫荧光技术,在体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞模型上验证构建的干扰载体抑制端粒酶反转录酶基因表达的效果。 结果与结论：蛋白质印迹和免疫荧光检测结果表明,重组质粒干扰组中星形胶质细胞端粒酶反转录酶均呈低表达。结果证实,实验成功构建了针对大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA质粒表达载体,此载体能有效抑制体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶的表达。     

小鼠胎肝干细胞的分离培养与鉴定

背景:胎肝细胞可能具有比骨髓干细胞等更强的增殖分化能力和更低的免疫原性,但目前涉及胎肝干细胞直接分离、培养的报道甚少.目的:拟在体外分离培养小鼠胎肝干细胞,并对其生物学特性进行初步鉴定.设计、时间及地点:细胞学体外观察.于2008-03/06在重庆市神经病学重点实验室完成.材料:SPF级13.5 d龄昆明种胎鼠9只,由重庆医科大学实验动物中心提供.方法:采用胶原酶+EDTA联合消化法与差速贴壁法体外分离胎鼠肝干细胞,按2×108L-1接种,待细胞80%一90%汇合后消化传代.采用链霉亲和素一生物素-过氧化酶复合物技术对原代接种后5 d的贴壁细胞进行多种肝干细胞表面标志物的标记.主要观察指标:原代胎肝干细胞形态变化,胎肝干细胞的传代扩增情况.胎肝十细胞表面标志的表达.结果:原代培养24 h细胞贴壁,呈致密圆形,边缘清楚:3 d左右部分细胞呈梭形,7 d后细胞铺展呈上皮样:传代后细胞扩增速度无明显变化,至第5代仍保持较均一的上皮细胞状.原代接种后5d的贴壁细胞,人干细胞因子受体与甲胎蛋白呈阳性表达,白蛋白与细胞角蛋白19呈阴性.结论:胎肝干细胞原代培养早期表达甲胎蛋白与人干细胞因子受体,不表达白蛋白和细胞角蛋白19,提示所分离的胎肝干细胞可能足一种较原始的干细胞,尚处在未分化的早期阶段.     

DNA去甲基化对大鼠骨髓间充质干细胞端粒酶反转录酶的调节

背景：DNA去甲基化是一种重要的表观遗传修饰,对肿瘤细胞的端粒酶具有重要调节作用,而对骨髓间充质干细胞端粒酶活性有何影响尚不清楚。目的：观察DNA去甲基化对骨髓间充质干细胞增殖及端粒酶反转录酶蛋白表达的影响。方法：全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞;按照下列分组加入5-杂氮胞苷,使各组5-杂氮胞苷终浓度分别为0,3,6,12,24μmol/L。加入5-杂氮胞苷后第1,2,3,5,7天进行指标检测。结果与结论：与对照组相比,5-杂氮胞苷干预24h,各浓度组均显著促进细胞增殖活性（P〈0.05）;干预48h,6,12,24μmol/L组显著促进细胞增殖活性（P〈0.05）;干预72h,12,24μmol/L组显著抑制细胞增殖活性（P〈0.05）;干预120,168h,对照组与各浓度组间差异均无显著性意义（P〉0.05）。5-杂氮胞苷干预48h,6,12,24μmol/L组端粒酶反转录酶蛋白IA值较对照组显著增加（P〈0.05）。提示在一定浓度范围及一定作用时间内,5-杂氮胞苷可以促进骨髓间充质干细胞增殖与端粒酶反转录酶蛋白的表达。     

人端粒酶反转录酶小发夹RNA质粒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶是端粒酶的活性亚基,已成为肿瘤研究的热点。RNA干扰技术作为一种基因沉默方法,具有高效、特异等优点,现已广泛应用于肿瘤、病毒等研究领域。目的:构建针对人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,并观察其对乳腺癌T47D细胞人端粒酶反转录酶基因的表达和端粒酶活性的影响。方法:以Genbank中人端粒酶反转录酶基因的mRNA序列为基础,设计人端粒酶反转录酶基因的小干扰RNA序列,将其连接到具有G418抗性的质粒pBAsi-hU6-Neo(BamHⅠ/HindⅢ)中,应用基因测序加以验证,扩增提取质粒,以脂质体转染表达小发夹RNA的质粒到乳腺癌T47D细胞,抗生素G418筛选出转染成功的各组细胞。结果与结论:实验所构建的人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,经测序验证无误。将pBAsi-hU6-Neo重组质粒转染入T47D细胞,经G418筛选获得了转染成功的细胞。经RT-PCR和Western blot检测,转染后的人端粒酶反转录酶基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低(P<0.01),经TRAP-ELISA法检测实验组细胞端粒酶活性出现显著下降(P<0.01)。结果证实,实验成功构建人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,实验所设计的小干扰RNA能有效抑制肿瘤细胞人端粒酶反转录酶基因的表达,进而降低细胞的端粒酶活性。     

人端粒酶反转录酶基因诱导人永生化成骨细胞的生物学特性

目的:研究反转录病毒(hTERT)基因诱导的人永生化成骨细胞系Clone5的生物学特性,包括增殖能力、细胞周期和是否恶性变。方法:收集30～31代Clone5和6～7代人成骨细胞(hOB),绘制两种细胞的生长曲线并用流式细胞仪检测细胞周期特征,软琼脂集落实验和裸鼠致瘤实验检测Clone5是否恶性变。结果:由生长曲线计算出细胞倍增时间:hOB:190h;Clone5:62h;曲线显示Clone5的增殖能力明显增强;流式细胞仪检测发现,Clone5细胞周期中G1期细胞占53.46%,S期细胞占28.24%,凋亡率为0.76%,hOBG1期细胞占79.81%,S期细胞占19.76%,凋亡率为33.33%。和hOB相比,Clone5G1期细胞比例减少,S期比例增加,细胞的凋亡率显著降低;软琼脂集落实验未见细胞团形成,裸鼠接种不致瘤。结论:转导hTERT基因的Clone5增殖能力明显增强,凋亡率降低,且未发生恶性变,可用做组织工程的种子细胞和研究正常骨生理、生化的工具细胞。     

人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰成肌细胞移植心肌梗死大鼠心肌细胞胰岛素样生长因子Ⅰ及端粒酶反转录酶mRNA的表达

目的:检测人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞移植后,心肌梗死大鼠血浆及心肌组织内胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白浓度的变化,以及心肌细胞内胰岛素样生长因子Ⅰ和端粒酶反转录酶mRNA水平的表达。方法:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞、未转染的正常鼠骨骼肌成肌细胞均由实验室前期制备。健康雄性SD大鼠90只,取12只作为假手术组,剩余大鼠结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型,结扎后24h存活36只,随机分为对照组和实验组,18只/组。造模后24h,实验组在动物后肢局部分多点注射总量为0.1mL的人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞悬液,(2~4)×1010L-1细胞;对照组和假手术组给予等量未转染的正常鼠骨骼肌成肌细胞悬液。应用ELISA法检测血浆和心肌组织胰岛素样生长因子Ⅰ的表达,RT-PCR检测心肌细胞中胰岛素样生长因子Ⅰ与端粒酶反转录酶mRNA水平。结果:①细胞移植后1,2,4周,假手术组血浆和心肌组织内鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的表达无明显变化(P>0.05);与假手术组比较,实验组和对照组血浆中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的质量浓度均显著降低(P<0.01),心肌组织中鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的含量均明显升高,于第2周达峰值(P<0.01),且实验组较对照组升高更为显著(P<0.01)。②细胞移植后1,2,4周,假手术组和对照组大鼠血浆和心肌组织内均未检测到人胰岛素样生长因子Ⅰ的表达;实验组于第1周即表达人胰岛素样生长因子Ⅰ,含量显著高于其余两组(P<0.01)。③细胞移植后第1周,实验组和对照组心肌细胞鼠胰岛素样生长因子ⅠmRNA相对表达量明显高于假手术组(P<0.01);至第2周实验组达峰值,显著高于对照组(P<0.01),然后逐步下降。实验组和对照组心肌细胞端粒酶反转录酶mRNA的表达均逐渐呈升高趋势,且实验组更为显著(P<0.01)。结论:人胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰的鼠骨骼肌成肌细胞植入心肌梗死大鼠体内1周后,能有效合成和分泌胰岛素样生长因子Ⅰ,明显促进心肌梗死早期大鼠心肌细胞鼠胰岛素样生长因子Ⅰ及端粒酶反转录酶mRNA的表达,同时可持续促进心肌及全身其他组织鼠胰岛素样生长因子Ⅰ的分泌。     

人颊脂垫脂肪干细胞与皮下脂肪干细胞生物学特性的比较

背景:在人脂肪干细胞的研究中,针对其内脏脂肪与皮下脂肪生物学特性的比较较多,对人颊脂垫部位脂肪干细胞的研究较少。目的:提取人颊脂垫脂肪干细胞进行体外增殖及成骨诱导培养,观察其细胞生物学特性,并与皮下脂肪来源脂肪干细胞进行对比。方法:分别提取面部轮廓整形手术获取的人颊脂垫与皮下吸脂术获取的皮下脂肪中的脂肪干细胞,进行体外传代培养与成骨诱导,对二者细胞浓度、增殖活性、成骨能力等指标进行对比观察。结果与结论:人颊脂垫为特化脂肪组织,血管成分明显多于皮下脂肪。颊脂垫提取脂肪干细胞浓度显著高于吸脂术来源者;CCK-8实验生长曲线显示颊脂垫来源脂肪干细胞增殖活性亦高于吸脂术来源脂肪干细胞(P<0.05);经成骨培养后第3,7,14天碱性磷酸酶染色,颊脂垫来源脂肪干细胞成骨活性优于吸脂来源脂肪干细胞(P<0.05)。表明颊脂垫作为特化的深部脂肪组织,其包含的脂肪干细胞生物学特性明显优于吸脂来源者,且由于其解剖毗邻关系,是口腔颌面部骨组织工程理想的种子细胞库。     

人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体转染椎间盘正常髓核细胞

背景：椎间盘髓核细胞分离培养困难,老化较快,迫切需要一种标准细胞株用于实验研究。目的：探讨人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体的构建及其转染正常髓核细胞构建永生化细胞的可行性研究。方法：通过目的基因克隆、真核表达质粒中目的基因序列测定、目的基因真核表达质粒的构建、转染人端粒酶反转录酶表达检测等步骤进行实验。结果与结论：构建出人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体,成功转染正常髓核细胞并在细胞中稳定表达。结果表明运用人端粒酶反转录酶转染椎间盘髓核细胞构建永生化细胞是一种可行的方法。