染料木黄酮对成骨细胞C-fos、ALP及骨钙蛋白基因表达的影响

目的研究不同浓度的染料木黄酮（genistein，GEN）对体外培养大鼠成骨细胞C-fos、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）及骨钙蛋白（osteocalcin）基因表达的影响。方法采用新生大鼠颅骨分离培养成骨细胞，加入不同浓度的染料木黄酮（10^-8mol·L^-1、10^-7mol·L^-1、10^-6mol·L^-1、10^-5mol·L^-1），以妊马雌酮（商品名：倍美力）（10^-8mol·L^-1、10^-7mol·L^-1、10^-6mol·L^-1、10^-5mol·L^-1）作为阳性对照组，提取总RNA，RT-PCR半定量分析其表达。结果染料木黄酮对成骨细胞C-fos、ALP及骨钙蛋白基因水平的影响呈正相关性，并与其剂量成正相关性，但这些作用均低于雌激素水平（P〈0．05）。结论染料木黄酮能诱导成骨细胞C-fos、ALP及骨钙蛋白基因的表达，并与其浓度有关，作用与雌激素相似。     

持续给予hPTH1-34对体外成骨细胞增殖与分化的影响

目的研究持续给予人甲状旁腺激素（human parathyroid hormone,hPTH）1-34对体外培养成骨细胞增殖与分化的干预作用。方法体外培养乳鼠成骨细胞,将细胞分为空白培养液对照组和10^-6、10^-7、10^-8mol·L^-1hPTH（1-34）3个不同剂量的给药组。每48h换1次液,换液时采用MTT法进行细胞增殖测定,同时检测细胞裂解液中的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和骨钙素（bone gla protein,BGP）的水平,持续培养6d。结果持续给予hPTH1-34作用48h后,各给药组的MTT均明显高于对照组且各给药组间差异均有显著性（P〈0.05）,至第6天时各给药组则均明显低于对照组（P〈0.05）。ALP和BGP测定结果显示持续给予hPTH1-34作用48h后,10^-6mol·L^-1PTH给药组的BGP含量明显高于对照组（P〈0.01）,其余各组ALP及BGP含量与对照组比较差异虽无显著性,但均值高于对照组,至第6天各给药组均明显低于对照组（P〈0.05）。结论持续给予hPTH（1-34）对体外培养成骨细胞增殖与分化的影响与作用的时间和给药浓度密切相关。短期持续用药有促进作用,并且在10^-6-10^-8mol·L^-1浓度范围内呈剂量依赖性;长期持续用药抑制成骨细胞的增殖与分化,给药浓度越高抑制作用越强。     

棕榈酸及亚油酸对人成骨肉瘤细胞MG63作用的研究

目的探讨棕榈酸及亚油酸对人成骨肉瘤细胞MG63的作用。方法取对数生长期的MG63细胞分5组进行干预,分别是：①对照（CON）组;②棕榈酸1.0×10^-4mol·L^-1组;③棕榈酸5.0×10^-4mol·L^-1组;④棕榈酸10.0×10^-4mol·L^-1组;⑤棕榈酸5.0×10^-4mol·L^-1＋亚油酸1.0×10^-5mol·L^-1组。干预24h后用AO/PI荧光双染和TUNEL法观察细胞凋亡的形态学改变;用Annexin-V/FITC流式细胞技术检测早期细胞凋亡;用单细胞凝胶电泳评估细胞损伤和凋亡情况。结果随着棕榈酸浓度的增加,细胞凋亡比例增加,呈浓度梯度效应。棕榈酸组细胞凋亡百分比明显高于对照组及同时给予亚油酸组（P均〈0.05）。结论棕榈酸能引起成MG63细胞凋亡,亚油酸则对其有保护作用。     

淫羊藿苷对小鼠骨髓源性破骨细胞诱导生成及骨吸收功能的影响

目的探讨淫羊藿苷对破骨细胞诱导产生及骨吸收功能的影响。方法用终浓度分别为25ng·mL^-1、30ng·mL^-1、10^-8mol·L^-1的M—CSF、RANKL、1，25（OH）2VitD3体外诱导培养小鼠骨髓源性破骨细胞，在此过程中加入终浓度分别为0、10^-7mol·L^-1、10^-6mol·L^-1、10^-5mol·L^-1的淫羊藿苷。倒置相差显微镜下观察活体细胞、HE染色、TRAP染色及降钙素受体染色鉴定破骨细胞，计数骨片上骨吸收陷窝数及面积，玻片上TRAP阳性多核细胞数。结果加药组随淫羊藿苷浓度的增加，骨片上形成的骨吸收陷窝数及面积，玻片上的TRAP阳性多核细胞数呈量的依赖性的减少，与非加药组比较，10^-5mol·L^-1、10^-5mol·L^-1浓度的淫羊藿苷组，差异有显著性（P〈0．05）。结论淫羊藿苷具有抑制破骨细胞诱导产生及骨吸收功能的作用，并随浓度增加抑制作用增强。     

骨相关生长因子对兔骨髓基质干细胞生长及分化的量效作用

目的研究地塞米松、重组人成纤维细胞生长因子（recombinant human fibroblast growth factor，rhFGF）及重组人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2，rhBMP-2）对兔骨髓基质干细胞（marrow slromal stem cells，MSCs）生长及分化的量效作用，为其在骨组织上程中的应用提供实验基础。方法体外分离培养免MSCs，分为1个空白对照组及9个实验组。实验组分别与终浓度为10^-8、10^-7、10^-6mol／L地塞米松；终浓度为50、200、500ngng/ml FGF；终浓度为50、500、1000ng／ml rhBMP-2培养。于4、7d终止培养并测定细胞总蛋白及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase。ALP）活性。结果与空白对照组比较，10mol／L地塞米松显著抑制细胞蛋白合成（P〈0．05），而10^-8、10^-7mol／L地塞米松对细胞蛋白合成无明显影响；10^-6,10^-7mol／L地塞米松刺激MSCs高度表达ALP（P〈0．05）。rhFGF各浓度组显著促进细胞蛋白合成量差异有统计学意义（P〈0．05），表现ALP活性抑制。rhBMP-2符浓度组对细胞蛋白合成九明显影响；50ng／ml rhBMP2不影响MSCs的ALP活性；当浓度增至500ng／ml与1000ng／ml时，ALP活性显苦增加（P〈0．05）。结论10^-7mol／L地塞米松及500、1000ng／ml rhBMP-2在不影响MSCs增殖的前提下，适当浓度能显著促进MSCs向成骨细胞转化，在骨组织工程的研究中有重要的应用价值。     

Effect of estrogen on MMPs mRNA expression of osteoclasts

目的本实验通过体外分离培养兔破骨细胞，观察不同浓度雌激素对兔破骨细胞基质金属蛋白酶MMPmRNA表达的影响。方法体外分离培养出生24h内的新西兰兔破骨细胞，用含有不同浓度17β-雌二醇（0、10^-5～10^-13mol·L^-1）的M199培养液分别作用于破骨细胞，观察不同浓度雌激素及相同浓度雌激素不同时间对破骨细胞活性的影响，采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法观察兔破骨细胞MMP-9 mRNA、MMP-8 mRNA表达状况。结果不同浓度17β-雌二醇对破骨细胞的活性有不同程度的抑制，同时对MMP-9 mRNA的表达有明显抑制作用，以10^-5、10^-6、10^-7mol·L^-1（P〈0．05）最为显著。所有破骨细胞均未表达MMP-8mRNA。结论不同浓度的雌激素呈时间和剂量依赖性地抑制破骨细胞的活性，对兔破骨细胞基质金属蛋白酶表达的调控作用随其浓度变化而不同。     

二磷酸盐和骨碎补总黄酮对诱导后成骨细胞影响的实验研究

目的探索二磷酸盐和骨碎补总黄酮联合作用如何在分子水平发挥作用于成骨细胞,揭示其效果如何。方法使用诱导方法作用于骨髓基质干细胞,使之转化为成骨细胞;用RT-PCR检验成骨细胞;不同浓度的二磷酸盐或骨碎补总黄酮配制成条件培养基,作用于成骨细胞,并分析生长曲线,分析细胞基因碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ALP）和胶原酶Ⅰ（collagenase colⅠ）表达情况。结果骨髓基质细胞经过4周诱导可转化为表达colⅠ和ALP的成骨细胞,经过生长曲线分析,二磷酸盐和骨碎补总黄酮10^-4^-10-6mmol·L^-1时,对诱导后的成骨细胞有抑制作用;10^-8mmol·L^-1有促进作用;10^-10-10^-12mmol·L^-1不明显,其中10^-8mmol·L^-1作用最强;基因分析后,发现二磷酸盐和骨碎补总黄酮促进成骨细胞表达colⅠ和ALP,且两者合用效果大于单独用药。结论二磷酸盐和骨碎补总黄酮合用均可促进成骨细胞基因表达,且两者合用效果大于单独用药。     

地塞米松和1，25(OH)2D3对体外人骨髓基质细胞成骨及成脂分化的影响

目的 观察地塞米松（Dex）和1，25（OH）2D3（D3）对骨髓基质细胞（MSCs）成骨及成脂分化的影响。方法 以离心法分离培养人MSCs，以10^-7mol／LDex和，或10^-8mol／Ll，25（OH）2D3作为分化诱导剂对细胞进行干预，分别用细胞碱性磷酸酶（ALP）染液试剂盒及苏丹Ⅲ染液对成骨细胞和脂肪细胞进行组织化学染色，计数；使用RT-PCR技术在转录水平检测成骨细胞标记物骨桥蛋白（OPN）及脂肪细胞标记物过氧化酶体增殖激活受体72（PPARγ2）mRNA的表达。结果细胞染色结果表明各干预组ALP^＋细胞百分比均较对照组增加，与对照组相比有显著性差异（P〈0．05），苏丹Ⅲ^＋细胞百分比Dex组较对照组增多，耽组较对照组减少，差异有显著性（P〈0．05），Dex＋D3组较Dex组苏丹Ⅲ^＋细胞数明显减少，两者相比差异有显著性（P〈0．05）；OPNmRNA及PPARγ2mRNA表达未在对照组测得，Dex诱导了OPNmRNA及PPARγ2mRNA表达，1，25（OH）2D3诱导OPNmRNA表达，并抑制Dex诱导的PPARγ2mRNA的表达。结论 Dex促进MSCs的成骨分化及成脂分化，1，25（OH），D，促进MSCs的成骨分化的同时抑制其成脂分化，与Dex合用抑制Dex成脂分化作用，强化了其成骨分化作用，反映了成骨细胞与脂肪细胞间存在的反变关系，表明两者来源于同一前体细胞的可能性。     

大黄素对大鼠肝移植后肝细胞凋亡的影响

目的：探讨大黄素对大鼠肝移植后肝细胞凋亡的影响。方法：建立LEW→BN大鼠肝移植动物模型,随机分为A组（排斥反应组）、B组（CsA组）、C组（大黄素组）、D组（CsA＋大黄素组）4组,每组6只。术后每天分别腹腔注射生理盐水0.5mL/d、环孢素A（CsA）10.0mg/（kg·d）、大黄素50.0mg/（kg·d）、大黄素50.0mg/（kg·d）＋CsA10.0mg/（kg·d）。连续用药8d,停药后处死动物取肝脏组织观察肝细胞凋亡指数（AI）和排斥活动指数（RAI）。结果：A、B、C、D组AI分别是35.83±2.32、15.83±1.33、16.50±2.35、11.50±1.05,RAI分别是7.67±0.98、5.17±0.40、5.83±0.75、3.83±0.75。B、C、D组的AI、RAI较A组均明显降低（P〈0.01）,而D组较B、C组也均有明显降低（P〈0.05）,B、C组间差别均无意义（P〉0.05）。结论：大黄素能有效减少大鼠移植肝术后肝细胞凋亡,抑制排斥反应。     

青藤碱和环孢素A联合应用延长大鼠移植心的存活时间

目的探讨青藤碱在大鼠单个核细胞（PBMC）增殖中的作用；观察青藤碱和环孢素A（CsA）联合应用对大鼠心脏移植术后移植心存活时间的影响。方法分离出大鼠外周血单个核细胞，用刀豆蛋白A（ConA）和混合淋巴细胞培养（MLC）激活单个核细胞增殖，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法及磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V）法检测单纯应用青藤碱或青藤碱＋CsA联合应用后对单个核细胞增殖作用的影响；以Wistar大鼠为供者，SD大鼠为受者，建立改良的颈部异位心脏移植模型，根据术后用药不同将其分为5组。（1）对照组：肌肉注射生理盐水1ml；（2）青藤碱组：肌肉注射青藤碱20mg·kg^-1·d^-1；（3）CsA组：肌肉注射CsA2mg·kg^-1·d^-1;（4）青藤碱＋CsA组：肌肉注射青藤碱20mg·kg^-1·d^-1＋CsA2mg·kg^-1·d^-1；（5）大剂量青藤碱组：肌肉注射青藤碱40mg·kg^-1·d^-1。观察各组移植心存活时间及病理学改变。结果（1）青藤碱能够显著的抑制ConA和MLC激活的单个核细胞增殖，并与CsA有协同作用。（2）青藤碱组及大剂量青藤碱组与对照组比较，移植心存活时间虽延长，但差异无统计学意义（P〉0．05）；青藤碱＋CsA组移植心存活时间明显延长，与其它4组比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论青藤碱能够显著的抑制单个核细胞的增殖；青藤碱联合小剂量环孢素A能明显延长移植心存活时间。     

siRNA腺病毒载体对兔骨髓基质细胞成脂分化的干扰效应

目的 观察靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因siRNA腺病毒载体阻断乙醇诱导兔骨髓基质细胞(MSCs)的成脂分化.方法 培养兔MSCs随机分为7组:N:对照组,M:模型组,CO:感染空载体组,C1:感染无关siRNA组,S1、S2、S3:干扰1、2、3组.将重组腺病毒载体转染细胞,检测MSCs内PPARγ mRNA、osteocalcin mRNA、PPARγ蛋白表达、甘油三酯、ALP活性和培养液骨钙素含量,并计数脂肪细胞.结果 N、M、CO、C1组PPARγ mRNA和osteocalcinmR-NA表达值分别为(0.39±0.02)、(0.75±0.03)、(0.74±0.03)、(0.73±0.02)和(1.09±0.19)、(0.50±0.10)、(0.46±0.12)、(0.49±0.13),M、CO、C1组脂肪细胞多,甘油三酯高,ALP活性与骨钙素量均低.S1、S2、S3组PPARγ mRNA和osteocalcin mRNA表达值分别为(0.28±0.03)、(0.30±0.03)、(0.31±0.01)和(0.92±0.09)、(0.87±0.32)、(0.93±0.25),脂肪细胞数、甘油三酯量、ALP活性值与骨钙素含量均接近正常,与M、CO、C1组间差异有统计学意义(P<0.05),与N组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 该腺病毒载体能阻断乙醇诱导的MSCs成脂分化.     

益肾健脾法对老年髋部骨折术后骨代谢的影响

目的运用益肾健脾法中药干预老年髋部骨折术后,观察其对骨代谢及骨密度等临床指标的影响。方法符合纳入标准的40例病例,随机分为治疗组和对照组,各20例。治疗组根据临床辨证,运用益肾健脾法给予中药口服,每日1剂,早晚分服;对照组不予干预,2月后复诊。术前和术后2月对比观察Ca、P、ALP、ACP、PTH、BGP、CT及骨密度指标,两次所得数据进行统计分析。结果最终资料收集完善的18例病例,治疗组8例,对照组10例。术前两组各项指标差异无统计学意义(P0.05),术后两组Ca、ALP、ACP、PTH、BGP、CT差异具有统计学意义(P0.05),术后P及骨密度两组差异无统计学意义(P0.05)。结论老年髋部骨折术后运用益肾健脾法进行中药干预,可以改善部分骨代谢指标。     

中医不同治法对绝经后骨质疏松症大鼠骨骼、骨骼肌SDF-1含量影响的比较研究

目的探究用中医滋补肾阴、温补肾阳、健脾、补肾健脾治法治疗绝经后骨质疏松症是否会引起骨骼、骨骼肌中SDF-1水平的变化,从而扩展中医防治骨质疏松症的现代医学机制。方法除正常组外,将去卵巢致骨质疏松症的大鼠随机分为模型组、补肾阴组、补肾阳组、健脾组、补肾健脾组和福善美组。采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清ALP、TRACP及骨骼、骨骼肌中SDF-1的水平。结果模型组大鼠血清ALP和TRACP水平均比正常组显著升高(P<0.01);各治疗组均比模型组显著降低(P<0.01),以福善美组降低最为明显,其次为补肾健脾组。②模型组大鼠的骨骼和骨骼肌SDF-1水平均比正常组显著升高(P<0.01);与模型组相比,补肾阳组、福善美组大鼠骨组织SDF-1水平显著降低(P<0.01),健脾组、补肾阴组也降低(P<0.05),福善美组、健脾组大鼠的骨骼肌SDF-1水平显著降低(P<0.01)。结论骨质疏松症的发生与骨骼、骨骼肌中SDF-1水平的升高有关。②补肾阴、补肾阳、健脾和补肾健脾法可以减少绝经后骨质疏松症大鼠骨骼、骨骼肌中SDF-1的水平,从而对骨质疏松症起到一定的防治作用。     

富血小板血浆联合钙化诱导对骨髓间充质干细胞增殖和成骨活性的影响

目的:观察富血小板血浆与地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠联合应用对体外培养的MSCs增殖和诱导成骨的影响。方法:应用密度梯度离心联合贴壁筛选法从兔髂骨骨髓中分离、纯化骨髓间充质干细胞(MSCs),取第3代MSCs随机分为3组,空白对照组加入含10%血清DMEM培养基,钙化诱导组利用含有钙化诱导剂0.1μmol/L的地塞米松、50mg/L的维生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的DMEM培养基,联合诱导组加入含有1%PRP及钙化诱导剂的DMEM培养基,诱导培养8d。结果:MSCs传至第3代细胞多呈长梭多角形。诱导培养5d后,空白对照组碱性磷酸酶染色弱阳性,钙化诱导组碱性磷酸酶染色为阳性,联合诱导组碱性磷酸酶染色为强阳性。诱导培养21d,两诱导组钙结节茜素红染色均呈阳性,MTT法显示诱导培养第2～5d联合诱导组细胞增殖明显高于钙化诱导组(P0.05)。碱性磷酸酶定量测定显示,联合诱导组于第3d、5d和7d,OD值均高于钙化诱导组(P0.05)。结论:富血小板血浆(PRP)与地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠联合应用于MSCs的成骨诱导,优于单纯钙化诱导方法,且诱导的成骨细胞具有更好的增殖及成骨活性。     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中CXCR4蛋白表达的研究

目的 探究中医补肾阴、补肾阳、健脾、补肾健脾不同治法对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中CXCR4蛋白表达的影响,从而为中药防治骨质疏松症提供依据。方法 体外分离培养大鼠BMSCs,将SPF雌性SD大鼠用随机数字表法随机分成6组,依次分别为：正常组、诱导液组、补肾阴组、补肾阳组、健脾组、补肾健脾组。对大鼠进行7 d灌胃,制备含药血清,各组成骨诱导18 d后,进行茜素红染色检测矿化情况,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测上述每组细胞上清液CXCR4、BMP2蛋白表达水平。结果 诱导18 d后,与正常组相比,补肾阳组与补肾健脾组BMP-2含量均显著升高(P<0.01),诱导组、补肾阴组BMP-2含量有所升高,但差异不具有统计学意义(P>0.05);与诱导组相比,补肾健脾组BMP-2含量均显著升高(P<0.01),补肾阴组与补肾阳组BMP-2含量有所升高,但差异无统计学意义(P>0.05),各含药组BMP-2蛋白浓度比较依次为：补肾健脾组>补肾阳组>补肾阴组>健脾组;与正常组相比,各组CXCR4含量均显著升高(P<0.01),且补肾健脾组上...     

补肾方药对骨质疏松大鼠骨中LIM矿化蛋白1表达的影响

目的：探讨补肾方药预防糖皮质激素诱导大鼠骨质疏松发生的机理。方法：通过肌肉注射地塞米松造成骨质疏松模型,观察补肾中药对骨密度的影响,从骨骼中提取mRNA,采用RT-PCR方法对LIM矿化蛋白（LMP-1）进行半定量。结果：病理组大鼠的骨密度及骨骼中LMP-1的表达明显降低（P＜0.05),而补肾方药组的骨密度及LMP-1的表达明显高于地塞米松组（P＜0.05)。结论：地塞米松抑制LMP-1在骨骼的表达,而补肾方药可通过提高LMP-1在骨的表达而预防骨质疏松的发生。     

地塞米松对人牙髓细胞增殖分化影响的研究

目的观察地塞米松对体外培养的人牙髓细胞增殖和分化的影响。方法收集拔除的无龋坏、无牙周疾病的健康前磨牙及第三磨牙,获得牙髓,酶消化联合组织块法体外培养人牙髓细胞(Human dental pulp cells,hDPCs),扩增后取第4代生长状态良好的细胞用于实验。分为两组,实验组hDPCs在含2%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的αMEM培养基中加入10-8mol/L地塞米松(Dexamethasone,Dex)培养,对照组单纯使用含2%FBS的αMEM培养基培养。在细胞培养第1、3、5天检测细胞增殖情况;细胞培养的第1、5、10天分别进行ALP染色及ALP定量分析检测细胞分化情况;细胞培养第10天进行茜素红染色观察钙化结节形成情况。结果细胞增殖活性检测显示,实验组培养第3天及第5天可见hDPCs增殖活性得到显著抑制,与对照组相比有统计学差异;ALP染色及定量测定:培养10 d后,地塞米松实验组ALP活性明显高于对照组;茜素红染色结果:培养10 d后两组细胞茜素红染色均为阳性,表明实验组与对照组均有钙化结节形成,但是实验组钙化结节形成数量较多。结论酶消化联合组织块法可以成功体外培养hDPCs。10-8mol/L地塞米松可显著抑制hDPCs的增殖活性,提高hDPCs的ALP活性及矿化能力。     

地塞米松对骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的 探讨地塞米松对体外培养的骨髓基质细胞增殖和分化等生物学特性的影响。方法 取4－6周龄新西兰兔双侧股骨骨髓3ml,体外分离,培养至第3代骨髓基质细胞,分别用地塞松浓度为0、10^10、10^-9、10^-8、10^-7和10^-6mol/L的培养基,作用2、4、及6天后,测定骨髓基质细胞的分裂增殖能力和碱性磷酸酶活性。结果 地塞米松对骨髓基质细胞的增殖起抑制作用,并随地塞米松浓度的升高而增强,其浓度大于10^-8mol/L后抑制作用越显著。地塞米松在抑制增殖的同时,可显著增强骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性,浓度越高作用也越显著,但超过10^-8mol/L后各浓度的作用效果无显著差别;这种作用随时间的延长而增强,至6天时与对照组相比可增强2－4倍。结论 地塞米松抑制骨髓基质细胞的增殖,但可促进其分化成骨细胞, 浓度为10^-8mol/L较合适。     

体外诱导家猪骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的观察家猪骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)在体外诱导条件下成骨分化的特征及相关基因的表达。方法选取3月龄雌性长白猪6头,无菌条件下于胫骨近端抽取骨髓15ml。采用密度梯度离心法并根据细胞贴壁特性对MSCs进行分离、纯化,倒置相差显微镜观察原代细胞生长情况,于培养第7天计算MSCs百分比含量及群体倍增值。将第1代细胞置于含1×10-8mmol/L地塞米松(dexamethasone,Dex)、10mmol/Lβ-磷酸甘油(β-glycerophosphate,β-GP)和82μg/ml抗坏血酸(ascorbic acid,Asc)的成骨诱导培养液中培养21d,作为实验组;DMEM培养液中培养作为对照组。分别行细胞形态学观察、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)组织化学染色、钙沉积和细胞增殖测定,采用实时定量PCR分析成骨分化的相关基因表达。结果原代MSCs特征:培养第1天,有核细胞大部分由悬浮的圆形血源性细胞组成;第3天换液弃除非贴壁细胞,MSCs克隆开始形成,细胞呈成纤维细胞样生长;第7天,镜下观察到大小不一的克隆。细胞在培养后12～14d基本长满,原代细胞群体倍增值平均为13。MSCs成骨分化:诱导培养14d实验组细胞形态由成纤维细胞样变成立方体样,而对照组细胞始终保持成纤维细胞样。培养5d,对照组细胞计数为11723±4040,实验组为10276±5513,二者差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,实验组诱导培养14d,ALP染色呈强阳性,21d钙沉积明显增加(P<0.01)。实验组MSCs成骨相关基因:核心结合因子α1(corebinding factorα1,Cbfα1)、osterix、ALP、型胶原、骨连接素(osteonectin,ON)、骨钙素(osteocalcin,OC)表达逐渐增强;Cbfα1、ALP、ON在分化早期增加明显;与第7天比较,第21天osterix和OC基因表达明显上调(P<0.05);第14天,型胶原表达也上调(P<0.05)。结论密度梯度离心法分离的猪MSCs,在体外诱导条件下能通过上调分化特异基因表达向成骨细胞分化。