维A酸CD437和阿维A抑制人黑素瘤A375细胞的比较

目的探讨合成的维A酸CD437与阿维A对体外培养的人黑素瘤A375细胞的增殖抑制、凋亡诱导、周期阻滞作用及对Bax/bcl-2蛋白表达的影响。方法MTT法测定CD437及阿维A对人黑素瘤A375细胞的增殖抑制作用;流式细胞术检测两种药物诱导细胞凋亡及周期阻滞;细胞爬片SABC免疫细胞化学分析两种药物对细胞Bax/bcl-2蛋白表达的影响。结果干预24h后,10-5mol/L维A酸CD437和阿维A对人黑素瘤A375细胞的增殖抑制率(PIR)和凋亡率分别为58.6%和43.25%,28.03%和17.13%(P<0.05),CD437促A375细胞G0/G1期阻滞,而阿维A无此作用;两药均上调A375细胞Bax蛋白表达和下调bcl-2蛋白表达,但CD437组与阿维A组差异无显著性。结论与阿维A相比较,CD437更有效抑制人黑素瘤A375细胞的增殖及更明显的凋亡诱导和G0/G1期阻滞作用;在辅助治疗黑素瘤方面,CD437比阿维A可能更具潜力。     

重楼皂苷Ⅰ通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导人黑素瘤A375细胞凋亡与自噬

目的探讨重楼皂苷Ⅰ(PolyphylinⅠ,PPⅠ)对人黑素瘤A375细胞凋亡和自噬的影响以及相关机制,确定PPⅠ诱导的细胞自噬与其促进A375细胞凋亡的相关性。方法 PPⅠ处理A375细胞后,采用CCK-8法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双标法检测PPⅠ对人黑素瘤细胞凋亡的作用;免疫印迹法检测相关蛋白的表达水平;通过观察细胞内自噬标志分子LC3的分布与表达来确定PPⅠ对自噬的诱导作用;采用氯喹抑制细胞自噬后,观察PPⅠ对细胞凋亡的影响。结果 PPⅠ能抑制A375细胞增殖活力;PPⅠ抑制PI3K/Akt/mTOR通路的活化并促进了A375细胞内Bax和cleaved-caspase 3的表达,抑制Bcl-2表达,诱导人黑素瘤细胞发生凋亡;PPⅠ促进了A375细胞LC-Ⅱ/LC-Ⅰ值和Beclin-1蛋白表达的升高,下调了p62蛋白的水平,促进了细胞自噬;PI3K/Akt/mTOR通路活化剂IGF-1处理A375细胞后抑制了PPⅠ的上述作用;PPⅠ与自噬抑制剂氯喹联用后,A375细胞凋亡数量明显减弱。结论 PPⅠ能抑制A375细胞的增殖,诱导细胞发生凋亡与自噬,抑制自噬减少了PPⅠ诱导的人黑素瘤细胞凋亡。     

姜黄素对人黑素瘤A375细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究姜黄素抑制人黑素瘤A375细胞增殖及诱导凋亡的作用.方法 体外培养人黑素瘤A375细胞,倒置显微镜观察细胞形态;采用MTT法检测细胞增殖抑制作用;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡.结果 姜黄素可使A375细胞体积缩小,细胞变圆;姜黄素对人A375细胞的生长增殖有明显的抑制作用,并且这种作用呈时间和剂量依赖性;Annexin V/PI双染法证实姜黄素可以诱导A375细胞发生凋亡.结论 姜黄素对人黑素瘤A375细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用.     

麦冬皂苷B通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡

目的探讨麦冬皂苷B对人黑色素瘤(Melanoma)A375细胞增殖,凋亡和细胞周期的影响以及相关机制。方法麦冬皂苷B处理A375细胞后,采用CCK-8法检测细胞活力;流式细胞仪检测A375细胞周期变化及细胞凋亡水平;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡形态;免疫印迹法检测麦冬皂苷B对A375细胞PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT蛋白以及通路下游凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,Cleaved-caspase3表达的影响。结果麦冬皂苷B能抑制A375细胞增殖活力及PI3K/Akt/mTOR通路的活化;麦冬皂苷B促进了A375细胞内Bax和Cleaved-caspase 3的表达,抑制Bcl-2表达,诱导人黑色素瘤细胞发生凋亡;麦冬皂苷B阻滞了A375细胞细胞周期,G0/G1期细胞比例明显升高;PI3K/Akt/mTOR通路活化剂IGF-1处理A375细胞后抑制了麦冬皂苷B的上述作用。结论麦冬皂苷B能抑制A375细胞的增殖,诱导细胞发生凋亡,阻滞细胞周期于G0/G1期。     

白藜芦醇对恶性黑素瘤细胞株增殖的影响

目的 研究白藜芦醇对恶性黑素瘤体外抗癌作用,探讨其抗癌作用的分子机制.方法 采用MTT法检测白藜芦醇对人恶性黑素瘤细胞系A375及小鼠恶性黑素瘤细胞系B16-F1增殖的影响;Annexin-V/PI双标流式细胞术检测白藜芦醇对A375、B16-F1细胞凋亡的影响,PI单标流式细胞术测定白藜芦醇对A375、B16-F1细胞周期的影响;Western印迹法检测白藜芦醇对A375、B16-F1细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响.结果 白藜芦醇对A375、B16-F1细胞增殖具有明显的抑制作用,且呈量效及时效关系.25 μmol/L白藜芦醇作用24 h即可诱导A375细胞凋亡,其细胞凋亡率为16.7%±2.1%.100μmol/L白藜芦醇作用24 h时B16-F1细胞凋亡率可达39.6%±3.3%.100 μmol/L白藜芦醇作用12 h时A375细胞凋亡率为17.2%±1.7%,作用72 h时达52.3%±4.1%;相同浓度白藜芦醇作用12 h时B16-F1细胞凋亡率为18.4%±1.6%,作用72 h时达56.7%±4.5%.白藜芦醇处理组A375及B16-F1细胞周期均发生变化,细胞周期被阻滞于G1期,此阻滞效应随白藜芦醇浓度的增加而增加,25 μmol/L、100μmol/L白藜芦醇作用24 h时,A375 G1期比例分别为40.51%±3.97%和55.64%±4.95%.B16-F1细胞分别为41.34%±3.12%和53.93%±5.12%.白藜芦醇明显下调A375及B16-F1细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,同时上调促凋亡蛋白Bax的表达水平.结论 白藜芦醇可通过调控细胞周期进程、诱导细胞凋亡而有效抑制A375及B16-F1的增殖,其机制与调节Bel-2、Bax的表达有关.     

抑癌基因DKK3对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响北大核心CSCD

目的 探讨DKK3 在人皮肤恶性黑素瘤细胞及组织中的表达及其对黑素瘤细胞A375增殖与凋亡的影响。方法 通过反转录（RT）？PCR及实时定量PCR分析DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤细胞系HM、A375、WM451、WM35、SK？MEL？1、Hs？695T和MDA？MB？435s及38例原发性黑素瘤、4例转移性黑素瘤和20例色素痣组织中的相对表达。分别转染恶性黑素瘤A375细胞pcDNA3.1（＋）？Flag？DKK3 质粒（实验组）和pcDNA3.1（＋）？Flag？Vector 质粒（对照组），RT？PCR 验证 DKK3 的过表达；通过CCK8法和平板克隆实验分析 DKK3 对A375细胞增殖的影响，流式细胞仪分析 DKK3对A375细胞凋亡的影响，Western印迹检测A375细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。结果 DKK3 mRNA 在WM35细胞系表达下调，HM、A375、WM451、SK？MEL？1和Hs？695T细胞系表达缺失，MDA？MB？435s细胞高表达。与色素痣相比，DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤组织表达降低（P 〈 0.001）。与对照组A375细胞相比 （100%），实验组A375细胞克隆形成效率明显受到抑制（23.22% ± 3.55%）；同时转染后24、48、72 h细胞活性受到明显抑制（均P 〈 0.05）。流式细胞仪检测发现，与对照组A375细胞（G1期，25.38% ± 2.92%）相比，实验组A375细胞明显阻滞于G1期（48.68% ± 3.92%，P 〈 0.001），细胞凋亡率明显升高（P 〈 0.001）。与对照组A375细胞相比，实验组周期凋亡相关蛋白p21、Bax、活化的parp和 活化的Caspase？3表达升高，细胞周期蛋白D1和Bcl2表达降低（均P 〈 0.001）。结论 DKK3在人皮肤恶性黑素瘤组织中表达下调，可能作为潜在的抑癌基因参与皮肤恶性黑素瘤的进展。     

干细胞因子及受体c-kit对A375细胞增殖和凋亡影响的体外研究

目的利用基因工程方法建立稳定表达干细胞因子受体(SCF/c-kit)的恶性黑素瘤A375细胞株,再给予外源性SCF/c-kit,观察其对A375细胞增殖、凋亡的影响。方法通过脂质体转染技术构建稳定表达c-kit的黑素瘤细胞株(hc-kit/A375),给予A375细胞和hc-kit/A375细胞外源性SCF,将所有的细胞分为A375组、A375-SCF组、hc-kit/A375组和hc-kit/A375-SCF组。应用MTT法及流式细胞仪分析细胞的增殖和凋亡,并应用酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组化方法检测肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF),基质金属蛋白酶(MMP)-9及肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达。结果①通过脂质体介导能将c-kit-pcDNA3.1neo重组质粒成功转染入黑素瘤细胞,建立稳定表达c-kit的黑素瘤细胞株hc-kit/A375,hc-kit/A375细胞中c-kit表达明显增加。②给予外源性SCF后,细胞的生长受到抑制,以培养后第5天尤为显著;细胞的凋亡率明显增加,S期比例降低,且hc-kit/A375-SCF组尤明显。③转染后细胞及加入SCF干预组VEGF、MMP-9分泌减少,而TNF-α的分泌增加。结论通过脂质体转染和G418筛选成功构建稳定表达c-kit的A375细胞株;通过增加A375细胞中SCF/c-kit的表达能改变肿瘤细胞对VEGF、MMP-9、TNF-α的分泌,抑制肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡。     

淫羊藿素联合达拉菲尼抑制黑素瘤增殖和转移

目的探讨淫羊藿素联合达拉菲尼对人黑素瘤A375细胞增殖和转移的抑制作用及可能的机制。方法采用不同浓度淫羊藿素和达拉菲尼单独及联合作用于A375细胞;CCK-8法检测细胞生长抑制率,进行协同性分析;Transwell和划痕实验检测细胞迁移和侵袭能力;qPCR及Westernblot检测MMP-2、MMP-9、Vimentin和E-cadherin的表达情况。结果淫羊藿素和达拉菲尼均能下调A375细胞MMP-2、MMP-9和Vimentin的表达,上调E-cadherin的表达,抑制其增殖、迁移和侵袭,且两药低浓度联合具有协同效应。结论淫羊藿素能协同达拉菲尼抑制A375细胞MMP-2、MMP-9和Vimentin的表达,促进E-cadherin的表达,抑制黑素瘤细胞的增殖和转移。     

白花丹素对黑素瘤A375细胞体外增殖及凋亡的影响

目的: 评价白花丹素对黑素瘤细胞体外增殖及凋亡的影响.方法: 体外培养黑素瘤细胞A375细胞株,应用不同浓度的白花丹素进行处理,培养24 h后,MTT法测定对细胞增殖的影响;用流式细胞术检测细胞的凋亡率;Western blot检测bcl-2的表达.结果: 浓度为1～13 μmol/L的白花丹素能显著抑制A375细胞株的增殖,且随浓度增加抑制作用递增;白花丹素作用24 h的半数抑制浓度约为10 μmol/L;当浓度为2.5 μmol/L、5.0 μmol/L和10.0 μmol/L作用24 h,细胞的凋亡率分别为8.52%±0.96%、14.83%±1.34%和19.56%±1.85%,与空白对照组(4.58%±0.46%)比较差异有统计学意义(P<0.05);细胞内bcl-2蛋白表达量随药物浓度升高而递减,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论: 白花丹素体外能抑制黑素瘤细胞增殖,并诱导细胞凋亡及下调黑素瘤细胞bcl-2蛋白的表达.     

生存素反义寡核苷酸对人恶性黑素瘤A375细胞生物学行为的影响

目的研究生存素反义寡核苷酸(AS-ODN)经脂质体介导转染对A375细胞增殖、凋亡的影响。方法合成生存素硫代反义寡核苷酸(AS-ODN),脂质体携带转染人恶性黑素瘤A375细胞。采用台盼蓝计数、软琼脂克隆形成试验、电镜、流式细胞仪检测AS-ODN对A375细胞增殖及凋亡的影响。通过裸鼠致瘤实验观察AS-ODN对A375细胞动物体内增殖的抑制作用。结果生存素反义寡核苷酸能降低G2/M期细胞百分比,诱导细胞凋亡发生,明显抑制A375细胞的生长和克隆形成,裸鼠体内A375细胞恶性增殖潜力下降。结论脂质体介导生存素AS-ODN能有效抑制A375细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡。     

MEK/ERK通路阻断剂对黑素瘤细胞增殖的影响

目的研究MEK/ERK通路阻断剂U0126对黑素瘤细胞A375增殖的影响,并探讨其作用机制。方法噻唑蓝法(MTT)测定U0126和传统抗癌药物达卡巴嗪(DTIC)分别及联合作用时对黑素瘤细胞A375的增殖抑制作用;流式细胞术检测不同药物处理组的细胞周期及凋亡情况;Western blot检测U0126处理后细胞p-ERK1/2的表达。结果药物作用24h时U0126单一用药组对细胞的增殖抑制率高于DTIC单一用药组(P<0.01);联合应用U0126和DTIC对细胞的增殖抑制率明显高于DTIC用药组(P<0.01);U0126组与对照组相比,G1期细胞比例数提高了21.83%(P<0.01),凋亡率提高了13.96%(P<0.01),联合用药组与对照组相比G1期比例增加了26.64%(P<0.01),凋亡率亦明显提高了25.20%(P<0.01);不同浓度U0126处理细胞后,细胞的p-ERK1/2均明显降低(P<0.01)。结论 MEK/ERK通路阻断剂U0126可显著抑制黑素瘤细胞的增殖,其机制可能与降低p-ERK1/2的表达从而参与细胞周期调控有关;联合U0126用药有望成为治疗黑素瘤新的有效途径。     

HINT1对人黑素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响

目的 探讨HINTl基因对人黑素瘤细胞A375增殖、凋亡的影响及其作用机制.方法 应用构建的peDNA.3.1/mye-His(-)A-HINTl真核表达载体,建立稳定转染且能高表达HINTI的A375细胞模型.用M1rr法检测细胞增殖活性变化,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率,TUNEL法检测细胞凋亡.分光光度法检测Caspase 3,Caspase 8及Caspase 9的相对活性.Western印迹法检测bcl-2、bax、细胞色素C及p53的表达.结果 与空载体-A375及未转染A375细胞相比,HINT1-A375细胞生长速度明显减慢(P<0.05);Gl期细胞增多(73.17%±3.99%,F=25.65,P<0.05),S期细胞减少(16.75%±1.62%.F=75.48,P<0.01),细胞出现明显的晚期凋亡(23.57%±9.58%,F=11.71,P<0.01). TUNEL法显示凋亡阳性细胞百分比(12%±1%)显著增高(F=358.02,P<0.01);Caspase 9(0.45±0.03,F=135.62,P<0.01)和Caspase 3表达(0.46±0.04,F=90.28,P<0.01)升高.凋亡相关蛋白bax、细胞色素C及p53表达增加,bel-2表达降低.结论 高表达H1NT1可抑制A375细胞的增殖,促进其凋亡,细胞周期出现G_1期阻滞,提示HINT1可能是人黑素瘤的抑癌基因.     

芹菜素对人恶性黑素瘤A375细胞周期的影响及机制研究

目的研究芹菜素对人恶性黑素瘤细胞系A375细胞周期的影响,并进一步探讨其作用机制。方法 A375细胞经芹菜素干预后,MTT比色法检测芹菜素对细胞增殖的影响,PI单标流式细胞术检测芹菜素对细胞周期的影响,蛋白印迹法检测芹菜素对细胞周期相关蛋白Cyclin D1及p21表达的影响。结果芹菜素在体外能明显抑制A375细胞增殖,其抑制效应呈时间及浓度依赖性;芹菜素可影响A375细胞周期,经芹菜素干预的A375细胞,其细胞周期被阻滞于G1期;芹菜素可显著影响A375细胞周期相关蛋白的表达,芹菜素在下调A375细胞Cyclin D1表达的同时,明显上调p21蛋白的表达。结论芹菜素能拮抗人恶性黑素瘤A375细胞增殖,其机制可能与芹菜素影响A375细胞周期相关蛋白Cyclin D1/p21的表达进而调控A375细胞周期进程有关。     

BRAFV600E突变基因对人黑素瘤细胞侵袭能力影响的研究

目的 探讨BRAFV600E突变基因对黑素瘤细胞侵袭能力的影响。方法　用构建成功的质粒载体转染人黑素瘤细胞株A375,在体外干扰BRAFV600E突变基因,用Transwell小室检测肿瘤细胞侵袭能力,用明胶酶法检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的变化,采用RT-PCR和Western印迹检测MMP-2和血管内皮细胞生长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达。结果　特异性短发卡RNA抑制人黑素瘤细胞MMP-2和VEGF mRNA和蛋白的表达,MMP-2 mRNA和蛋白表达分别减少35%和80%,VEGF则减少45%和14%。转染特异性质粒的黑素瘤细胞穿过Metrigel的数目下降69%。结论 BRAFV600E突变增强黑素瘤细胞的侵袭能力,特异性shRNA可以使瘤细胞的侵袭性下降。     

西达本胺对恶性黑素瘤细胞系A375的体外抗增殖作用

目的 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺对体外培养的皮肤恶性黑素瘤细胞株A375细胞的抗癌作用。方法 用不同浓度的西达本胺和曲古抑菌素A处理A375细胞,以噻唑蓝法检测西达本胺和曲古抑菌素A对A375细胞体外增殖的影响;Annexin V-EGFP/PI双荧光活染-流式细胞测量法检测细胞凋亡率;DNA倍体分析检测细胞周期。结果 西达本胺和曲古抑菌素A可明显抑制A375细胞增殖,西达本胺在5 ~ 500 μmol/L浓度范围内呈量效关系,其中50 ~ 500 μmol/L浓度范围内在作用0 ~ 120 h时间内呈时效关系。曲古抑菌素A在0.1 ~ 1 μmol/L浓度范围内呈量效关系,其中在0.25 ~ 1 μmol/L浓度范围内作用0 ~ 120 h呈时效关系。西达本胺和曲古抑菌素A作用A375细胞48 h的IC50分别为250和0.7 μmol/L。西达本胺（62.5,125,250 μmol/L）作用48 h后诱导A375细胞的凋亡率分别为80.27% ± 3.06%、79.53% ± 5.70%、83.13% ± 6.90%,曲古抑菌素A（0.175,0.35,0.7 μmol/L）作用48 h后诱导A375细胞的凋亡率分别为16.27% ± 2.46%、28.83% ± 2.55%、83.40% ± 8.65%,显著高于空白对照组（10.43% ± 0.96%）（P < 0.01）。西达本胺（62.5,125,250 μmol/L）作用48 h后诱导A375细胞发生G0/G1期阻滞,G0/G1期细胞比例分别为76.30% ± 6.06%、82.79% ± 0.74%、88.91% ± 5.29%,与空白对照组（38.73% ± 3.36%）比较,差异有统计学意义（P < 0.01）;曲古抑菌素A（0.35,0.7 μmol/L）作用48 h后诱导A375细胞发生G2/M期阻滞,G2/M期细胞比例分别为25.15% ± 2.71%、58.71% ± 3.45%,与空白对照组（15.73% ± 0.23%）比较,差异有统计学意义（P < 0.01）。结论 西达本胺和曲古抑菌素A在体外能诱导A375细胞发生周期阻滞,促使细胞凋亡,抑制细胞生长。