微载体技术培养人骨髓间充质干细胞的成骨诱导实验

目的:以微载体技术成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞,建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法。方法:实验于2002-12/2003-08在第三军医大学西南医院中心实验室完成。将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞采用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养,观察细胞增殖情况,作出生长曲线。分别于培养的第2,4,6,8,10,12,14d检测诱导细胞的碱性磷酸酶活性,并与普通成骨诱导方法进行对比。最后进行细胞碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原、骨钙素的免疫组织化学染色,观察培养细胞的成骨细胞表型的表达。结果:微载体法接种24h后约87%的人骨髓间充质干细胞贴附于微载体并铺展,3d后生长加速,约10～11d后细胞生长达最大值,最终细胞收获密度为接种时的约15～20倍。诱导细胞的碱性磷酸酶活性在培养的第12天达最大值,并表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素等成骨细胞表型。微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性意义(P>0.05)。结论:应用微载体可以成功进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导扩增,可以满足骨组织工程量和质的需要。     

微载体技术与普通方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的比较

目的:比较微载体法与普通培养瓶法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞,建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法。方法:实验于2003-12/2004-10在西南医院中心实验室完成。取在西南医院检查的15名健康自愿者骨髓组织进行梯度离心,采用普通培养法培养。将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞分别应用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养,分别于培养的第2,4,6,8,10,12,14天检测诱导培养细胞的碱性磷酸酶活性,观察细胞增殖情况,作出生长曲线,比较两种方法细胞增殖速度(收获细胞数除以接种细胞数,为细胞扩增倍数,以之除以培养天数为增殖速度)。结果:①微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的增殖动力学并与普通法的比较:培养微载体法接种24h后约87%的人骨髓间充质干细胞细胞贴附于微载体并铺展,3d后生长加速,10～11d后细胞生长达最大值,最终细胞收获密度为接种时的15～20倍,微载体法诱导培养人骨髓间充质干细胞的速度是普通培养法的3～5倍,两者差异有显著性(P<0.01)。②微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性并与普通成骨诱导培养法比较:两种方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性均在培养的第12天达最大值。微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性(P>0.05)。结论:应用微载体技术可以成功地进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导,更快地扩增,利于满足骨组织工程量和质的需要。     

微载体技术与普通方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的比较

目的：比较微载体法与普通培养瓶法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞，建立一种大量、快速获得骨组织工程种子细胞的方法。 方法：实验于2003—12／2004—10在西南医院中心实验室完成。取在西南医院检查的15名健康自愿者骨髓组织进行梯度离心，采用普通培养法培养。将普通培养瓶培养的第3代人骨髓间充质干细胞分别应用搅拌式生物反应器和微载体成骨诱导培养，分别于培养的第2，4，6，8，10．12，14天检测诱导培养细胞的碱性磷酸酶活性，观察细胞增殖情况，作出生长曲线。比较两种方法细胞增殖速度（收获细胞数除以接种细胞数，为细胞扩增倍数，以之除以培养天数为增殖速度）。 结果：①微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的增殖动力学并与普通法的比较：培养微载体法接种24h后约87％的人骨髓间充质干细胞细胞贴附于微载体并铺展，3d后生长加速。10—11d后细胞生长达最大值，最终细胞收获密度为接种时的15—20倍，微载体法诱导培养人骨髓间充质干细胞的速度是普通培养法的3—5倍，两者差异有显著性（P〈0．01）。②微载体法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性并与普通成骨诱导培养法比较：两种方法成骨诱导培养人骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性均在培养的第12天达最大值。微载体成骨诱导细胞的碱性磷酸酶活性与普通成骨诱导方法差异无显著性（P〉0．05）。 结论：应用微载体技术可以成功地进行人骨髓间充质干细胞的成骨诱导，更快地扩增，利于满足骨组织工程量和质的需要。     

人骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及成骨分化

背景：国内外对骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导分化研究手段、测定指标均不够全面。目的：建立并完善一整套人骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定方法,探讨其体外成骨分化能力。方法：采用密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定细胞表面表型。传至第3代时更换成骨诱导培养基进行成骨分化诱导。结果与结论：人骨髓间充质干细胞生长旺盛,传代后增殖旺盛,第3代骨髓间充质干细胞表面表型CD44、CD73、CD90表达阳性,CD34表达阴性。诱导后的成骨细胞碱性磷酸酶活性增加,Gomori、Vonkossa、茜素红染色均阳性。RT-PCR检测诱导后细胞有Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素、骨唾液酸蛋白、骨桥蛋白及骨连接蛋白基因的表达,证明了人骨髓间充质干细胞成功向成骨方向分化。表明实验建立了一整套稳定、成熟的骨髓间充质干细胞分离、培养、扩增方案。     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景:目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确.目的:观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化.方法:抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10<'-8> mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录一聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定.结果与结论:经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%.提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞己具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据.     

骨髓间充质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓间充质干细胞共培养后的成骨特性

目的：观察由骨髓间充质干细胞诱导的内皮细胞与自体骨髓间充质干细胞共培养时对骨髓间充质干细胞成骨作用的影响。 方法：实验于2005—03／11在复旦大学附属中山医院外科中心实验室完成。①使用密度梯度离心法分离兔骨髓间充质干细胞。②取传两三代细胞分组分别进行如下操作：骨髓间充质干细胞组仅应用基础培养液（DMEM—LG培养基、体积分数为0．1的胎牛血清）常规培养；骨髓间充质干细胞成骨诱导组在基础培养液中加入成骨诱导剂；内皮细胞诱导组在内皮细胞生长培养基作用下将骨髓间充质干细胞诱导为内皮细胞；诱导的骨髓间充质干细胞与内皮细胞联合培养组将骨髓间充质干细胞和诱导而来的内皮细胞按1：1的比例接种于培养板中，加入成骨诱导培养液。③通过干细胞形态、免疫荧光、细胞增殖、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量等从酶学、组织学、生化等不同方面观察诱导的内皮细胞对骨髓间充质干细胞成骨活性及细胞生长情况的影响。 结果：①免疫细胞荧光染色结果：内皮细胞诱导组培养诱导的细胞成为内皮细胞。②倒置相差显微镜、苏木精一伊红染色结果：均显示联合培养组骨髓间充质干细胞和诱导的内皮细胞混合生长良好。③四甲基偶氮唑盐法检测结果：各组细胞增殖差异无显著性（P〉0．05）。④碱性磷酸酶活性：除内皮细胞诱导组外，其他3组细胞的活性均随时间的延长而逐渐增高，联合培养组增长最明显，第12天时联合培养组细胞碱性磷酸酶活性已达到（618．46&;#177;28．34）nkat／L，高于其他各组（P〈0．05）。⑤骨钙素检测结果：在培养的第7天、第14天，联合培养组的骨钙素分泌量分别为2．03，3．17μg／L，明显高于其他各组（P〈0．01）。 结论：由骨髓间充质干细胞诱导的内皮细胞能够增强骨髓间充质干细胞的成骨活性，提高骨髓间充质干细胞的增殖能力。     

改良法培养骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的:研究大鼠骨髓基质干细胞的生长特点和在诱导条件下的成骨能力。方法:通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并检测骨钙素的分泌、碱性磷酸酶的活性和细胞矿化作用。结果:原代培养基质干细胞首先形成细胞集落,12d时集落间接近融合;传代细胞体积变大,约5～7d传代一次。诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,并出现了矿化结节。结论:骨髓基质干细胞易于分离培养及体外扩增,成骨能力肯定,可作为骨组织工程的种子细胞     

血管内皮生长因子/纳米晶胶原基骨缓释系统与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性

背景:利用载体或缓释系统负载生长因子,既能保护生长因子的生物活性,又可以使生长因子缓慢释放,从而持续促进细胞生长及组织修复再生,是目前控制释放载体材料应用研究的方向之一.目的:观察血管内皮生长因子/纳米晶胶原基骨缓释系统的体外缓释效果及与种子细胞的生物相容性.方法:人骨髓间充质干细胞经体外诱导培养、扩增后种植于血管内皮生长因子+肝素/纤维连接蛋白+纳米晶胶原基骨支架(实验组)和单纯的纳米晶胶原基骨支架(对照组)行体外培养.测定缓释支架材料上血管内皮生长因子的释放量和持续时间;种植细胞后细胞的黏附率;培养3,7,10,14 d时支架材料中细胞数、碱性磷酸酶活性以及细胞在材料上的生长状况.结果与结论:①该缓释支架具有一定的血管内皮生长因子缓释效果,持续时间可达14 d.②第3代人骨髓间充质干细胞经成骨诱导培养,可表达成骨细胞表型:碱性磷酸酶细胞化学染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色均为阳性.③体外实验显示该缓释支架与入骨髓间充质干细胞具有优良的生物相容性:相同时间点实验组的细胞黏附率、支架上细胞数量及细胞碱性磷酸酶活性均明显高于对照组;扫描电镜发现两组材料上均有细胞生长,但实验组的细胞生长状况明显好于对照组.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向成骨细胞分化培养的生物学特性

背景：骨髓间充质干细胞因取材方便、对机体损伤小,是目前最为合适的骨组织工程种子细胞,但其体外培养的具体方法及生物特性仍无定论。目的：建立一种简单有效的骨髓间充质干细胞的体外培养及成骨诱导方法,并探讨其体外培养的生物学特点。方法：采用贴壁法分离提纯Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代细胞后,分别在普通培养基（对照组）和成骨诱导培养基（实验组）中培养10d,绘制细胞生长曲线。于培养第4,7,10,13,16天检测两组细胞碱性磷酸酶活性,并对细胞爬片行Vonkossa染色。结果与结论：采用贴壁法获得了均一性较好的骨髓间充质干细胞,对照组细胞生长速度明显快于实验组细胞。对照组细胞碱性磷酸酶活性明显低于实验组（P〈0.05）。实验组细胞Vonkossa染色为阳性,对照组为阴性。说明贴壁筛选法是一种简单有效的骨髓间充质干细胞的分离纯化方法,骨髓间充质干细胞在体外可诱导分化为成骨细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向成骨细胞分化培养的生物学特性

背景:骨髓间充质干细胞因取材方便、对机体损伤小,是目前最为合适的骨组织工程种子细胞,但其体外培养的具体方法及生物特性仍无定论.目的:建立一种简单有效的骨髓间充质干细胞的体外培养及成骨诱导方法,并探讨其体外培养的生物学特点.方法:采用贴壁法分离提纯Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代细胞后,分别在普通培养基(对照组)和成骨诱导培养基(实验组)中培养10 d,绘制细胞生长曲线.于培养第4,7,10,13,16天检测两组细胞碱性磷酸酶活性,并对细胞爬片行Von kossa染色.结果与结论:采用贴壁法获得了均一性较好的骨髓间充质干细胞,对照组细胞生长速度明显快于实验组细胞.对照组细胞碱性磷酸酶活性明显低于实验组(P<0.05).实验组细胞Von kossa染色为阳性,对照组为阴性.说明贴壁筛选法是一种简单有效的骨髓间充质干细胞的分离纯化方法,骨髓间充质干细胞在体外可诱导分化为成骨细胞.     

不同培养条件下兔骨髓间充质细胞成骨特性的比较

目的：观察不同培养的条件下兔骨髓间充质细胞的成骨特性。方法：比较骨髓间充质细胞在普通培养基培养、诱导培养基培养和新鲜兔骨碎粒的共培养3种条件下的成骨分化特性，观察3种条件下细胞的形态及碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素水平，并用免疫组化方法检测Ⅰ型胶原、骨钙素。结果：共培养及诱导培养的间充质细胞同期ALP活性及细胞内骨钙素均显著高于普通培养组(P&lt;0．01)，诱导培养最高；经过诱导培养及共培养的间充质细胞，其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性；对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性。结论：诱导培养及共培养条件呈现促间充质细胞向成骨方向转化的特点，诱导培养短期能使ALP、骨钙素达到较高水平。     

应用纳米晶胶原基骨体外构建组织工程骨

目的:应用组织工程技术,建立体外诱导人骨髓间充质干细胞,与纳米晶羟基磷灰石/胶原骨共培养的人工骨模型,探求细胞与纳米晶胶原基骨结合的最佳模式。方法:实验于2005-09/2006-09在江苏大学医学技术学院中心实验室完成。①实验材料:纳米晶胶原基骨材料由清华大学材料系崔福斋等人研制。骨髓取自骨科取髂骨患者(男性,30岁,患者知情同意)。②实验干预:全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞并扩增,应用成骨诱导剂诱导向成骨细胞表型转化。取纳米晶胶原基骨材料经60Co照射灭菌,无水乙醇疏水化,三蒸水洗去乙醇等处理制备支架材料。细胞与支架材料复合培养。③实验分组:骨髓间充质干细胞培养至第3代后分为两组:复合材料后加成骨诱导剂组:骨髓间充质干细胞先与纳米晶胶原基骨复合培养3d后再加入成骨诱导剂;成骨细胞复合材料组:骨髓间充质干细胞在诱导成骨细胞后与纳米晶胶原基骨复合培养。④实验评估:记录第3代骨髓间充质干细胞生长曲线。将诱导后细胞分别进行碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色。扫描电镜比较两组复合物经体外孵育2周后,细胞在其中生长情况。结果:①细胞生长情况:倒置显微镜下观察原代培养的骨髓细胞增殖迅速,基本都呈形态均一成纤维样细胞,10～12d左右即可长满,并可稳定传代,传代细胞7～9d即可传代。诱导培养后的细胞呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建出骨髓间充质干细胞与骨组织共培养的模型。②体外复合后细胞生长及基质分泌情况:细胞可在纳米晶胶原基骨内表面良好贴壁,复合材料后加成骨诱导剂组,细胞贴附,但成骨细胞少见;成骨细胞复合材料组,细胞数量明显较前者多。复合培养8d,分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。第14天,大量细胞在材料表面和孔隙中生长。细胞之间广泛存在突起连接,局部有胶原分泌,且可见成骨细胞形成。结论:证实纳米晶胶原基骨适合种子细胞的贴附、生长和增殖,经成骨诱导后的细胞较骨髓间充质干细胞更易与材料贴附、增殖。     

α- 玉米赤霉醇影响小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化简

背景：骨髓间充质干细胞具有向成骨细胞分化的能力,植物雌激素α-玉米赤霉醇对小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化可能有促进作用。 目的：探讨α-玉米赤霉醇对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：采用全骨髓培养差速贴壁法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为6组：非诱导组加含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的 IMDM 普通培养基;空白诱导组仅加入等量成骨条件培养基（含0.1μmol/L 地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μmol/L 维生素C）;阳性对照诱导组加入等量成骨条件培养基及10-8 mol/L雌二醇;高、中、低α-玉米赤霉醇组分别加入成骨条件培养基及10-5,10-6,10-7 mol/L梯度浓度的α-玉米赤霉醇。倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT 实验测定细胞增殖状态绘制细胞生长曲线,酶联免疫吸附法测定碱性磷酸酶、骨钙素的表达。 结果与结论：非诱导组细胞呈长梭形,生长密集时有接触抑制,各诱导组的细胞增殖受促进,诱导后细胞呈三角形、多角形、不规则形状,细胞可重叠生长;非诱导组低表达碱性磷酸酶、骨钙素,低浓度（10-7 mol/L）α-玉米赤霉醇组和阳性对照诱导组高表达碱性磷酸酶、骨钙素,与空白诱导组相比,差异有非常显著性意义（P＜0.01）。结果说明α-玉米赤霉醇可以促进骨髓间充质干细胞的增殖,低浓度α-玉米赤霉醇可显著促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。而上调碱性磷酸酶、骨钙素的表达量可能是α-玉米赤霉醇诱导促进骨髓间充质干细胞骨向分化的作用机制之一。     

骨髓间充质干细胞的旁分泌能影响成骨细胞生物学功能

背景：有研究表明骨髓间充质干细胞移植可促进骨缺损的修复,但受损组织的缺血、缺氧和炎症反应限制了其临床应用。 目的：观察骨髓间充质干细胞旁分泌作用对成骨细胞MG63增殖、迁徙、分化功能的影响 方法：Ficol-Paque 密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,制备骨髓间充质干细胞条件培养基培养成骨细胞 MG63。CCK-8法检测 MG63细胞增殖能力变化;细胞划痕法检测 MG63细胞迁徙能力变化;微板检测MG63细胞合成碱性磷酸酶能力的变化;Real-time PCR法检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及骨钙素基因表达量的变化;茜素红染色检测其矿化能力的变化。 结果与结论：骨髓间充质干细胞表型为 CD44、CD73、CD90表达强阳性,CD34表达阴性。与普通培养基（DMEM）相比,在骨髓间充质干细胞条件培养基作用下,MG63细胞的增殖速度明显加快;细胞划痕结果示其迁徙能力明显提高;诱导第4,7天后碱性磷酸酶基因表达量及蛋白合成量明显增多（P 〈;0.01）;Ⅰ型胶原及骨钙素基因表达量在诱导第4天后差异无显著性意义,诱导第7天后较对照组明显升高（P〈;0.05）;茜素红染色示骨髓间充质干细胞条件培养基诱导MG63细胞21 d后钙结节形成增多,矿化沉积作用增强。结果证实,骨髓间充质干细胞的旁分泌物质可以显著促进成骨细胞的增殖、迁徙、分化和矿化能力。     

骨髓间充质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓间充质干细胞共培养后的成骨特性

目的:观察由骨髓间充质干细胞诱导的内皮细胞与自体骨髓间充质干细胞共培养时对骨髓间充质干细胞成骨作用的影响。方法:实验于2005-03/11在复旦大学附属中山医院外科中心实验室完成。①使用密度梯度离心法分离兔骨髓间充质干细胞。②取传两三代细胞分组分别进行如下操作:骨髓间充质干细胞组仅应用基础培养液(DMEM-LG培养基、体积分数为0.1的胎牛血清)常规培养;骨髓间充质干细胞成骨诱导组在基础培养液中加入成骨诱导剂;内皮细胞诱导组在内皮细胞生长培养基作用下将骨髓间充质干细胞诱导为内皮细胞;诱导的骨髓间充质干细胞与内皮细胞联合培养组将骨髓间充质干细胞和诱导而来的内皮细胞按1∶1的比例接种于培养板中,加入成骨诱导培养液。③通过干细胞形态、免疫荧光、细胞增殖、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量等从酶学、组织学、生化等不同方面观察诱导的内皮细胞对骨髓间充质干细胞成骨活性及细胞生长情况的影响。结果:①免疫细胞荧光染色结果:内皮细胞诱导组培养诱导的细胞成为内皮细胞。②倒置相差显微镜、苏木精-伊红染色结果:均显示联合培养组骨髓间充质干细胞和诱导的内皮细胞混合生长良好。③四甲基偶氮唑盐法检测结果:各组细胞增殖差异无显著性(P>0.05)。④碱性磷酸酶活性:除内皮细胞诱导组外,其他3组细胞的活性均随时间的延长而逐渐增高,联合培养组增长最明显,第12天时联合培养组细胞碱性磷酸酶活性已达到(618.46±28.34)nkat/L,高于其他各组(P<0.05)。⑤骨钙素检测结果:在培养的第7天、第14天,联合培养组的骨钙素分泌量分别为2.03,3.17μg/L,明显高于其他各组(P<0.01)。结论:由骨髓间充质干细胞诱导的内皮细胞能够增强骨髓间充质干细胞的成骨活性,提高骨髓间充质干细胞的增殖能力。     

纳米晶羟基磷灰石/胶原骨与骨髓间充质干细胞的相容性

背景：组织工程支架材料表面的微观和亚微观结构对细胞的黏附与生长有很重要的影响。利用纳米技术和三维造孔技术制备的纳米晶羟基磷灰石，胶原骨模仿了天然骨的成分与微结构特征。目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨的细胞相容性。设计、时间及地点：单一样本观察，于2005-09／2006—12在江苏大学医学技术学院完成。材料；纳米晶羟基磷灰石，胶原骨由清华大学材料科学与工程系研制。人骨髓间充质干细胞由健康成年志愿者自愿捐献，受试者对实验内容知情同意。方法：全骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞，应用成骨诱导剂（地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油、碱性成纤维细胞生长因子）诱导向成骨细胞表型转化。将第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石，胶原骨复合培养14d。主要观察指标：通过碱性磷酸酶组织化学染色、Von Kossa染色鉴定诱导培养的成骨细胞的细胞学特性。通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞生长及其在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨上的生长情况。结果：原代培养的骨髓细胞增殖迅速，10～12d左右即可稳定传代，传代细胞7-9d即可传代。经诱导培养的细胞碱性磷酸酶组织化学染色阳性，Von Kossa染色阳性，可见钙化的基质沉积，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。构建的骨髓间充质干细胞与纳米晶羟基磷灰石／胶原骨共培养模型中，细胞可在纳米晶羟基磷灰石，胶原骨表面良好贴壁。复合培养8d，分布于支架材料上的细胞大量增殖、分泌细胞外基质。复合培养14d，大量细胞在材料表面和孔隙中生长，细胞之间广泛存在突起连接。结论：纳米晶羟基磷灰石肢原骨适合种子细胞的贴附、生长和增殖，细胞相容性良好。     

脐血与骨髓间充质干细胞的成骨细胞定向诱导及其成骨活性比较

目的：研究脐血与成人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem ceus，Mscs)的定向分化为成骨细胞的条件及其成骨活性，比较两种不同Mscs定向成骨细胞诱导后的成骨活性。方法：采用标准Ficou-Hypque技术分离脐血和成人骨髓Mscs，以地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C为辅剂定向诱导成骨细胞，碱性磷酸酶、骨矿化结节和Ⅰ型胶原作为成骨细胞鉴定与活性评价的指标。结果：两种MSCs的细胞形态和生物学特性无明显差异。定向成骨细胞诱导后，成骨细胞标志性产物碱性磷酸酶、骨钙素、上清钙、骨矿化结节和Ⅰ型胶原均得到了稳定的表达，并显高于未诱导MSCs，而且两种细胞的成骨活性差异无显性意义。结论：脐血和成人骨髓MSCs在适当的条件下均可向成骨细胞定向转化，两种细胞均可作为骨组织工程的种子细胞。     

不同培养条件下兔骨髓间充质细胞成骨特性的比较

目的:观察不同培养的条件下兔骨髓间充质细胞的成骨特性。方法:比较骨髓间充质细胞在普通培养基培养、诱导培养基培养和新鲜兔骨碎粒的共培养3种条件下的成骨分化特性,观察3种条件下细胞的形态及碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素水平,并用免疫组化方法检测Ⅰ型胶原、骨钙素。结果:共培养及诱导培养的间充质细胞同期ALP活性及细胞内骨钙素均显著高于普通培养组(P<0.01),诱导培养最高;经过诱导培养及共培养的间充质细胞,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性;对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性。结论:诱导培养及共培养条件呈现促间充质细胞向成骨方向转化的特点,诱导培养短期能使ALP、骨钙素达到较高水平。     

低渗结合自然沉降法分离兔骨髓间充质干细胞及其鉴定

背景:骨髓间充质干细胞数量极少,10万个骨髓有核细胞中才有1个骨髓间充质干细胞,如何成功分离并鉴定骨髓间充质干细胞是研究中的关键工作。目的:建立完善的骨髓间充质干细胞体外分离培养体系,从细胞的形态、表型和功能方面鉴定骨髓间充质干细胞。方法:低渗原理去除杂细胞,结合自然沉降分离骨髓间充质细胞,并对其形态学特征进行光镜观察。对骨髓间充质细胞的表型进行流式细胞仪检测。并将骨髓间充质细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行诱导分化,行形态学观察和碱性磷酸酶、Vonkossa、Ⅰ型胶原、油红O染色检测。结果与结论:实验分离获取的骨髓间充质细胞经表型鉴定为:CD29(+),CD45(-);向成骨细胞诱导后,碱性磷酸酶、矿化结节染色及Ⅰ型胶原检测均为阳性;向脂肪细胞诱导后,油红O染色阳性。结果表明实验分离的骨髓间充质细胞为类成纤维细胞样非造血类干细胞,此类细胞具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的功能。     

低渗结合自然沉降法分离兔骨髓间充质干细胞及其鉴定

背景：骨髓间充质干细胞数量极少,10万个骨髓有核细胞中才有1个骨髓间充质干细胞,如何成功分离并鉴定骨髓间充质干细胞是研究中的关键工作。目的：建立完善的骨髓间充质干细胞体外分离培养体系,从细胞的形态、表型和功能方面鉴定骨髓间充质干细胞。方法：低渗原理去除杂细胞,结合自然沉降分离骨髓间充质细胞,并对其形态学特征进行光镜观察。对骨髓间充质细胞的表型进行流式细胞仪检测。并将骨髓间充质细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行诱导分化,行形态学观察和碱性磷酸酶、Vonkossa、Ⅰ型胶原、油红O染色检测。结果与结论：实验分离获取的骨髓间充质细胞经表型鉴定为：CD29（＋）,CD45（-）;向成骨细胞诱导后,碱性磷酸酶、矿化结节染色及Ⅰ型胶原检测均为阳性;向脂肪细胞诱导后,油红O染色阳性。结果表明实验分离的骨髓间充质细胞为类成纤维细胞样非造血类干细胞,此类细胞具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的功能。