甘氨酸对大鼠缺血缺氧心肌细胞凋亡的影响

目的 明确甘氨酸对缺血缺氧致心肌细胞凋亡过程的影响.方法 建立SD乳鼠心肌细胞缺血缺氧模型,分为单纯缺血缺氧组和甘氨酸处理组(培养液中加入终浓度5 mmoL/L甘氨酸,其余处理同单纯缺血缺氧组).以SD乳鼠正常心肌细胞作为对照组.3组细胞培养6 h后,检测凋亡情况、线粒体跨膜电位及分布情况、线粒体通透性转换孔(mPTP)开放情况及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性变化.结果 (1)细胞凋亡程度:对照组和甘氨酸处理组荧光强度均明显低于单纯缺血缺氧组(P<0.01).(2)线粒体跨膜电位:对照组心肌细胞荧光强度为73±4,单纯缺血缺氧组荧光强度(32±7)明显较弱(P＜0.01),甘氨酸处理组荧光强度(52±4)强于单纯缺血缺氧组(P＜0.01).(3)mPTP开放情况:对照组心肌细胞线粒体荧光强度(90±7)较强,甘氨酸处理组荧光强度(62±8)明显强于单纯缺血缺氧组(27±4,P＜0.01).(4)caspase-3活性:对照组和甘氨酸处理组均显著低于单纯缺血缺氧组(P＜0.01).结论 甘氨酸对缺血缺氧心肌细胞具有抗凋亡作用,其机制可能与改变线粒体膜电位、减少mPTP开放、减轻钙超载、降低caspase-3活性有关.     

线粒体通透性转换孔与心肌细胞缺氧/复氧过程中炎症反应关系的实验研究

目的 探讨线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)功能状态与心肌细胞缺氧/复氧损伤过程中炎症反应的关系.方法 心肌细胞培养72 h后,采用随机数字表法将其随机分为4组:空白对照组(Sham 组)、缺氧/复氧损伤对照组(AR组)、mPTP开放抑制剂环孢素A(ciclosporin A,CSA)后处理组(CSA组)、mPTP开放剂苍术苷(atractyloside,ATR)后处理组(ATR组).实验结束后检测各组心肌细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率、心肌细胞凋亡、线粒体膜电位的变化和心肌细胞核转录因子-κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)与磷酸化核转录因子-κBp65 Ser536(p-NF-κB p65 Ser536)蛋白的表达量,并检测心肌细胞培养上清液白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的浓度.结果 与AR组比较,CSA组LDH漏出率显著降低[(27.2±2.6)％,(19.0±2.3)％](P＜0.01),早期凋亡细胞百分比显著降低[(33.4±2.8)％,(15.4±2.3)％](P＜0.01),p-NF-κB p65 Ser536蛋白表达量显著降低(5.1±0.7,4.4±0.4)(P＜0.01),IL-6和TNF-α浓度均显著降低[IL-6 (190±10),(170±11) ng/L;TNF-α(129±9),(118±12) ng/L](P＜0.01).与AR组比较,ATR组LDH漏出率显著升高[(27.2±2.6)％,(32.1±3.6)％](P＜0.01),早期凋亡细胞百分比显著升高[(33.4±2.8)％,(43.0±3.3)％](P＜0.0l),p-NF-κB p65 Ser536蛋白表达量显著升高(5.1±0.7,5.8±0.6)(P＜0.01),IL-6和TNF-α浓度均显著升高[IL-6 (189±10),(205±9) ng/L;TNF-α(129±9),(144±10) ng/L] (P＜0.01).结论 mPTP开放状态能够通过调控心肌细胞缺氧/复氧过程中的炎症反应而显著影响缺氧/复氧心肌细胞损伤的程度.     

受体诱导一氧化碳经PI3 K/Akt信号途径抑制冷缺血再灌注诱导的移植心细胞凋亡

目的 观察受体诱导一氧化碳(CO)对移植心冷缺血再灌注(I/R)损伤中细胞凋亡的影响,并探讨其机制.方法 以BALB/C小鼠建立同系移植心冷I/R损伤模型.受体麻醉前3 h以二氯甲烷(MC)500 mg/kg灌胃诱导CO(MC组,n=12),或橄榄油灌胃(IR组,n=12);在MC组的基础上受体在移植心恢复血供前1 h腹腔注射PI3K抑制剂LY294002(40 mg/kg,LY组,n=10)或二甲亚砜(DMSO组,n=10);检测移植后3、24 h移植心细胞凋亡指数(AI)、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白、bcl-2与bax蛋白表达比值;设正常对照组(N组,n=5).结果 受体以MC灌胃后血液中碳氧血红蛋白(COHb)浓度与心肌组织CO含量均在3 h达到峰值,分别为(9.82±0.84)%和(2.25±0.08)pmol/mg;与IR组比较,MC组明显降低移植心AI[3 h:(8.65±2.01)%比(19.28±4.94)%,P＜0.01;24 h:(5.82±2.36)%比(10.54±3.66)%,P＜0.05]、激活Akt蛋白(3 h:P＜0.01;24 h:P＜0.05)、上调bcl-2/bax比值(3 h:1.97±0.16比0.46±0.07,P＜0.01;24 h:1.89±0.10比0.51±0.04,P＜0.01);与MC组比较,LY组明显增加AI[3 h:(17.95±4.92)%,P＜0.01;24 h:(9.75±3.14)%;P＜0.01]、抑制Akt蛋白激活(P＜0.01)、下调bcl-2/bax比值(3 h:0.47±0.06,P＜0.01;24 h:0.52±0.03,P＜0.01);DMSO组与MC组的各个指标差异无统计学意义(P＞0.05).结论 受体诱导C0能明显抑制冷I/R诱导的移植心细胞凋亡,其机制可能与通过PI3K/Akt信号途径上调bcl-2/bax比值有关.     

洛伐他汀对胆管癌细胞株QBC939生长侵袭的抑制作用

目的 研究洛伐他汀(lovastatin)对人胆管癌细胞株QBC939生长、迁移、凋亡等生物学行为的影响,初步探讨其可能机制.方法 应用四甲基偶氮唑盐法检测洛伐他汀作用后细胞增殖情况.流式细胞技术检测细胞凋亡率.细胞划痕实验观察细胞迁移能力改变.RT-PCR和Western印迹法检测洛伐他汀作用前后人胆管癌细胞株QBC939中白细胞介素-6(IL-6)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶—9(MMP-9) mRAN 和Akt蛋白的表达.结果 与对照组相比,洛伐他汀组胆管癌细胞相对活力明显降低(24 h、48 h、72 h:F=173.05、159.66、577.87,均为P＜0.01)并具有浓度时间依赖性.洛伐他汀组较对照组细胞早期凋亡[(14.29±0.75)％比(5.61±0.85)％]、总凋亡[(35.48±1.13)％比(24.94±0.40)％]比例明显增加(均为P＜0.01).细胞24 h、48 h平均迁移速率明显减慢(分别为10.94±3.07比24.17±3.31和10.96±2.45比18.65±0.94,均为P＜0.01).洛伐他汀组中IL-6、Akt、VEGF、MMP-9 mRNA和Akt蛋白的表达明显低于对照组(均为P＜0.05).结论 洛伐他汀可抑制胆管癌细胞的增殖、迁移并诱导其凋亡,可能与下调IL-6、Akt、VEGF、MMP-9的表达有关.     

异丙酚对乳鼠心肌细胞氧化损伤时线粒体功能的影响

目的 评价异丙酚对乳鼠心肌细胞氧化损伤时线粒体功能的影响.方法 SD乳鼠20只,分离乳鼠心肌细胞,接种于96孔培养板原代培养48 h,随机分为5组,每组32孔,对照组(C组):继续培养4 h;氧化损伤组(OI组):加入叔丁基过氧化氢,终浓度为100 μmol/L,孵育4 h;异丙酚1 μmol/L组、10 μmol/L组和30 μmol/L组(P1-3组):加入叔丁基过氧化氢,终浓度为100 μmol/L,同时加入异丙酚,终浓度分别为1、10、30,μmol/L,孵育4 h.于细胞培养或孵育4 h时,测定上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性,细胞谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物岐化酶(SOD)活性、心肌细胞线粒体活力、线粒体膜电位和心肌细胞凋亡率.结果 与C组比较,其余4组上清液LDH活性、心肌细胞MDA含量、凋亡率升高,心肌细胞线粒体活力、膜电位降低、心肌细胞GSH含量、SOD活性降低(P<0.05);与OI组比较,P2,3组上清液LDH活性、心肌细胞MDA含量、凋亡率降低,心肌细胞线粒体活力、膜电位升高,P3组心肌细胞GSH含量、SOD活性升高(P<0.05),P1组上述指标差异无统计学意义(P>0.05);P2组与P3组上述指标比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 异丙酚减轻心肌细胞氧化损伤的机制与改善线粒体功能、抑制细胞凋亡有关.     

线粒体在脓毒症淋巴细胞凋亡中的作用

目的 研究线粒体在脓毒症淋巴细胞凋亡中的作用机制.方法 用雌性、6～8周、C57BL/6小鼠建立盲肠结扎穿孔(CLP)的脓毒症动物模型.将实验动物随机分为两组:对照组、CLP组.分离脾淋巴细胞,采用Annexin V-FITC/PI标记,流式细胞仪检测脾淋巴细胞的凋亡变化;罗丹明123标记,流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化;分离脾淋巴细胞线粒体和胞质组分,Western blot法检测细胞色素C在线粒体、胞质中的含量变化.结果 CLP组脾淋巴细胞的凋亡率为(17.3±2.2)%,较对照组的(3.5±0.5)%明显增高(P＜0.05);CLP组线粒体膜电位无降低的细胞占(76.2±1.6)%,较对照组的(99.6±0.4)%明显减少(P＜0.05);CLP组脾淋巴细胞线粒体和胞质内的细胞色素C含量与对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在脓毒症时,线粒体及其信号传导通路在淋巴细胞凋亡中发挥了重要作用.     

胰岛素样生长因子1对结肠癌细胞凋亡的影响及其机制研究

目的研究胰岛素样生长因子1(IGF-I)通过磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI-3K/Akt)信号通路对结肠癌细胞株SW480凋亡率的影响及凋亡抑制蛋白survivin表达水平的变化。方法在培养结肠癌SW480细胞株时,采用不同浓度的IGF-I不同时间作用于SW480细胞,然后采用Western blot检测凋亡抑制蛋白survivin表达变化。100 ng/mL IGF-I作用于SW480细胞2 h内,Westernblot检测Akt的磷酸化表达变化;Akt特异性抑制剂LY294002处理前后,利用Western blot检测Akt磷酸化表达的变化,Western blot及细胞免疫荧光检测survivin表达的变化,流式细胞术检测细胞凋亡率的改变。结果IGF-I能上调SW480细胞的survivin表达,且其表达水平与IGF-I的作用时间、浓度呈依赖性(IGF-I作用SW480细胞不同时间后,survivin蛋白表达显著升高,并在12 h时达到峰值,所有实验组survivin蛋白的表达均显著高于对照组;IGF-I浓度为100 ng/mL时,survivin蛋白的表达达到顶峰);IGF-I快速激活SW480细胞中PI-3K/Akt信号通路(IGF-I作用SW480细胞15,30 min后,p-Akt蛋白的表达达到高峰);IGF-I能通过PI-3K/Akt信号通路上调SW480细胞survivin的表达;IGF-I能通过PI-3K/Akt信号通路抑制SW480细胞凋亡[利用流式细胞术检测空白组、刺激组、阻断组各组SW480细胞的凋亡率,分别为(5.18±0.415)%,(0.85±0.052)%,(3.15±0.411)%,各组之间差异有统计学意义(P0.05)]。结论IGF-I可通过PI-3K/Akt通路诱导survivin表达,从而抑制结肠癌细胞SW480的凋亡。     

Expression and role of hypoxia inducible factor-1 α and matrix metalloproteinase-9 during early development of pressure ulcer

目的 探讨缺氧诱导因子-1α(HIF- 1α)mRNA及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在早期压疮形成中的表达及其作用机制,以期寻找早期压疮干预靶点.方法 将36只雄性SD大鼠随机分为3组,每组12只,10％水合氯醛麻醉.实验A、B两组采用特制压力装置在大鼠股簿肌处施压,两组压强相同但压力循环不同,A、B组分别给予3、5个缺血-再灌注循环(缺血2.0h,再灌注0.5 h);对照组不予压力.实验终点,取受压中心(对照组取相同解剖部位)肌肉组织标本后实施安乐死.用实时荧光定量RT-PCR法测定HIF-1α mRNA表达水平,ELISA法检测MMP-9和丙二醛(MDA)含量,免疫组织化学染色法检测抗凋亡蛋白Bcl-2,TUNEL 标记凋亡肌细胞.结果 对照组、实验A组、实验B组HIF-1α mRNA表达水平分别为2.69±1.83、2.55±1.08、3.62±1.99,实验B组高于其他两组.三组MMP-9与MDA含量比较,差异有统计学意义(均P＜0.01);实验A、B组显著高于对照组,实验B组显著高于实验A组(均P＜0.01).实验A组Bcl-2蛋白表达最高、对照组次之、实验B组最低;实验A组、B组、对照组凋亡指数(AI)分别为3.53％、7.00％、0.25％.MMP-9含量与AI、MDA呈显著正相关(均P＜0.01),HIF-1α mRNA表达与Bcl-2表达呈显著负相关(P＜0.01).结论 HIF-1α在一定缺氧时间和程度范围内介导低氧反应,可对受压组织产生细胞保护作用,而在严重或持续缺氧时则可诱导受压组织细胞凋亡.MMP-9在压疮形成早期大量表达导致细胞外基质过度降解,可能促进受压组织不可逆损伤.     

七氟烷预处理对大鼠离体心肌缺血/再灌注损伤线粒体细胞色素C释放的影响

目的 探讨七氟烷预处理对大鼠离体心肌缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/RI)时心肌细胞凋亡及线粒体细胞色素C释放的影响.方法 40只SD大鼠应用随机数字表法随机分为4组(每组10只):对照组(C组),0.75％、1.5％、3.0％七氟烷预处理组(S1、S2、S3组).应用Langendorff离体心脏灌注模型,经主动脉用Krebs-Henseleit( K-H)液逆行灌注.各组均缺血30 min,再灌注60 min.S1、S2、S3组在缺血前分别以含相应浓度七氟烷的K-H液灌注10 min,再冲洗5 min,重复2次.记录平衡灌注末、缺血前即刻、再灌注30、60 min时的心功能指标.再灌注60 min时用DNA原位末端缺口标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labelling,TUNEL)测定凋亡细胞,提取心肌线粒体,免疫印迹法测定线粒体和胞浆的细胞色素C水平.结果 与C组比较,S1、S2、S3组再灌注30、60 min时左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)降低、左室发展压(left ventricular developed pressure,LVDP)升高(P＜0.05);与C组比较,S1、S2、S3组凋亡率明显下降(P＜0.05或0.01),再灌注末心肌细胞凋亡率C、S1、S2、S3组分别为(33.10±2.57)％、(28.03±3.11)％、(25.20±3.04)％、(24.06±2.58)％;与C组比较,S1、S2、S3组心肌线粒体细胞色素C释放减少,胞浆细胞色素C的量明显降低(P＜0.05或0.01).结论 七氟烷预处理能够通过抑制心肌线粒体细胞色素C释放到胞浆,降低心肌细胞凋亡率,减轻心肌I/RI.     

二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时PI3K mRNA和Akt mRNA表达的影响

目的 评价二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K) mRNA和蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(Akt) mRNA表达的影响.方法 培养SD大鼠心肌微血管内皮细胞,以1×106个/ml密度接种于96孔培养板(100μl/孔)或培养皿(2 ml/皿),采用随机数字表法,将其随机分为4组(n=25).正常对照组(C组)不作任何处理;缺氧复氧组(H/R组)、二氮嗪预先给药组(DZ组)、二氮嗪预先给药+线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-羟葵酸组(DZ+ 5-HD组)均进行缺氧2h,复氧2h.DZ组和DZ+ 5-HD组在缺氧前2h分别加入100 μmol/L二氮嗪、100μnol/L二氮嗪+ 100 μmol/L 5-羟葵酸.于复氧2h时测定细胞活力、细胞凋亡率、PI3K mRNA和Akt mRNA表达.结果 与C组比较,H/R组细胞活力降低,细胞凋亡率升高,PI3K mRNA和Akt mRNA表达上调(P＜0.05或0.01);与H/R组比较,DZ组细胞活力升高,细胞凋亡率降低,PI3K mRNA和Akt mRNA表达上调(P ＜0.05或0.01);5-羟葵酸可逆转二氮嗪预先给药导致的上述改变(P＜0.05或0.01).结论 二氮嗪预先给药减轻大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧损伤的机制与激活线粒体ATP敏感性钾通道,促进PI3K和Akt基因的转录有关.     

热休克蛋白90对大鼠缺氧心肌细胞丝氨酸苏氨酸蛋白激酶表达的影响

目的探讨内源性热休克蛋白90（HSP90）在缺氧心肌细胞丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（AKT）相关信号通路中的作用。方法建立新生Wistar大鼠心肌细胞缺氧模型，将细胞分为正常组、缺氧组、加入HSP90特异性阻断剂格尔德霉素后再缺氧组（格尔德霉素＋缺氧组）。于缺氧后1、3、6、12、24、48h用噻唑蓝法检测心肌细胞的活力；缺氧24h，原位缺口末端标记法检测心肌细胞凋亡指数（AI）；缺氧1、3、6、12、24h，蛋白质印迹法检测大鼠心肌细胞中内源性HSP90及AKT表达水平。结果（1）缺氧24、48h，缺氧组、格尔德霉素＋缺氧组细胞活力均较正常组明显下降（P〈0．05）；格尔德霉素＋缺氧组细胞活力缺氧12h即开始明显下降，缺氧48h时明显低于缺氧组（P〈0．05）。（2）缺氧24h，缺氧组细胞AI为（10．7±1．2）％，明显高于正常组[（1．9±0．3）％．P〈0．05]；格尔德霉素＋缺氧组细胞AI为（26、3±5．3）％，明显高于缺氧组（P〈0．01）。（3）缺氧12h，缺氧组心肌细胞内源性HSP90及AKT表达水平高于正常组与格尔德霉素＋缺氧组；缺氧24h，缺氧组有所下降．格尔德霉素＋缺氧组则下降更明显。结论内源性HSP90对维持心肌细胞的活力有重要作用．缺氧心肌细胞AKT表达水平可受内源性HSP90表达水平的影响。     

微管干预剂对大鼠缺氧心肌细胞能量生成的影响

目的 了解缺氧条件下微管干预剂对大鼠心肌细胞能量生成的影响。方法 常规分离、培养大鼠心肌细胞，分为单纯缺氧组、缺氧＋秋水仙碱（微管解聚剂）组及缺氧＋5、10、15 mmol／L紫杉醇（微管稳定剂）组。每组细胞加入刺激剂后，缺氧培养0．5、1．0、3．0、6．0、12．0、24．0h。采用锥虫蓝染色检测细胞死亡率，常规比色法检测细胞肌酸激酶（CK）活性，高效液相色谱法检测细胞腺苷三磷酸（ATP）及腺苷二磷酸（ADP）含量。结果 （1）缺氧＋秋水仙碱组及缺氧＋15mmol／L紫杉醇组细胞培养1．0～24．0h死亡率均高于单纯缺氧组（P〈0．01）；缺氧＋5、10mmoL／L紫杉醇组6．0～24．0h时均低于单纯缺氧组（P〈0．05）。（2）缺氧＋秋水仙碱组培养1．0～12．0h时CK活性均高于单纯缺氧组（P〈0．01）。0．5～12．0h时，缺氧＋15mmoL／L紫杉醇组CK活性均高于单纯缺氧组（P〈0．01）；缺氧＋5、10mmol／L紫杉醇组低于单纯缺氧组（P〈0．05或P〈0．01）。（3）缺氧＋5mmol／L紫杉醇组培养0．5～6．0h ATP含量[（49．9±2．8）、（40．7±2．0）、（25．8±1．9）、（19．1±1．2）μg／10^6个细胞]高于单纯缺氧组[（42．9±5．8）、（29．5±1．8）、（18．2±0．9）、（14．1±0．7）μg／10^6个细胞，P〈0．05或P〈0．01]。0．5～12．0 h时，缺氧＋秋水仙碱组低于单纯缺氧组（P〈0．01）；缺氧＋15mmol／L紫杉醇组低于单纯缺氧组及缺氧＋10mmol／L紫杉醇组（P〈0．01）。各组ADP含量变化趋势与ATP相反。结论 微管解聚剂和高浓度微管稳定剂可使缺氧心肌细胞ATP含量锐减。适宜浓度的微管稳定剂在缺氧早期可促进心肌细胞能量生成，对心肌具有保护作用。     

缺氧对人脐静脉内皮细胞株增殖与活力的影响

目的了解缺氧对人脐静脉内皮细胞增殖与活力的影响。方法将体外培养的人脐静脉内皮细胞株 EA.hy926分为常氧组和缺氧组。常氧组常规培养,缺氧组细胞充入混合气体(含体积分数94%N_2、5%CO_2、1%O_2)后置于37℃缺氧培养1、3、6、12 h。提取两组细胞总蛋白,用蛋白质印迹法检测血管内皮生长因子(VEGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平;以噻唑蓝法检测细胞活力,并用流式细胞仪检测细胞周期。结果与常氧组比较,缺氧组细胞培养1 h VEGF 表达增高,6 h 达高峰,12 h 降低但仍明显高于常氧组;培养3 h 时细胞 PCNA 蛋白表达开始升高,6 h 达峰值并持续至12 h。培养1、3 h,缺氧组细胞活力较常氧组明显增高(P<0.05),6 h 开始下降,至12 h 时低于常氧组但差异无统计学意义(P>0.05)。缺氧组细胞培养1、3、6 h,G_0/G_1期细胞均较常氧组少,S 期和 G_2/M 期细胞增多,增殖指数(PI)各为(43±9)%、(39±11)%、(40±11)%,均高于常氧组(32±9)%,其中3、6 h 时差异有统计学意义(P<0.05);12 h 时 PI 为(27±4)%,降至常氧组水平以下(P<0.05)。结论缺氧早期可促进人脐静脉内皮细胞增殖,但随着缺氧时间的延长细胞增殖将受抑制。     

缺氧早期大鼠心肌细胞微管损害的观察

目的 了解缺氧早期心肌细胞微管损害程度。方法将分离培养的Wistar大鼠心肌细胞分为正常组、缺氧组（建立缺氧细胞模型并设缺氧10、20、30、60min为观察时相点）。用激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察2组细胞微管分布、形态变化，对微管蛋白荧光强度进行半定量分析．用蛋白质印迹法检测2组细胞游离d微管蛋白的表达。结果 与正常组比较，缺氧10min后，缺氧组细胞微管念珠状结构消失，但排列尚有规律、数量无明显减少；缺氧20min不仅念珠状结构消失，而且微管排列散乱，远离胞核区出现微管缺失；缺氧30、60min时微管发生扭曲、断裂，纹理紊乱，完全丧失规律性。缺氧组心肌细胞微管蛋白荧光强度较正常组下降，且随缺氧时间延长愈加明显；缺氧组心肌细胞内游离的α微管蛋白表达（缺氧10min为46644±145）高于正常组（13357±98），两组比较，差异有统计学意义（P〈0．01），随缺氧时间的延长此升高趋势愈加明显。结论在缺氧状态下，心肌细胞微管发生解聚时间较早，其结构和分布规律被破坏。微管解聚在缺氧所致心肌细胞早期病理损害中的作用值得深入研究。     

Blockade of calcium influx through L-type calcium channels attenuates mitochondrial injury and apoptosis in hypoxic renal tubular cells

In hypoxia, ATP depletion causes cellular Ca(2+) increase, mitochondrial injury, and apoptosis in renal tubular cells. However, the molecular basis of these observations is incompletely delineated. IRPTC, a rat renal proximal tubular cell line, was treated with antimycin A, and disturbances in cytoplasmic calcium ([Ca(2+)]c) and mitochondrial calcium ion concentration ([Ca(2+)]m), dissipation of mitochondrial membrane potential (DeltaPsi(m)), cytochrome c release, and resultant apoptosis were examined. Pharmacologic targeting of L-type Ca(2+) channels in vitro and in vivo was used to clarify the involvement of voltage-dependent Ca(2+) channels during this process. In vitro studies indicated that ATP depletion-induced apoptosis was preceded by increased [Ca(2+)]c and [Ca(2+)]m before activation of mitochondrial signaling. Antagonizing L-type Ca(2+) channels offset these findings, suggesting [Ca(2+)]c and [Ca(2+)]m involvement. Azelnidipine administration ameliorated cellular and mitochondrial Ca(2+) accumulation, mitochondrial permeability transition, cytochrome c release, caspase-9 activation, and resultant apoptosis (15.8 +/- 0.8% versus 8.9 +/- 0.7%; P < 0.01). Similar effects of azelnidipine were substantiated in an in vivo ischemia/reperfusion injury model. There were fewer terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick-end labeling-positive cells in the azelnidipine-treated group (0.322 +/- 0.038/tubule) as compared with the vehicle-treated group (0.450 +/- 0.041; P < 0.05), although the antiapoptotic effect was smaller in vivo than in vitro, partly as a result of distinct levels of Bax expression. It is proposed that voltage-dependent Ca(2+) channels are involved in cellular and mitochondrial accumulation of Ca(2+) subsequent to ATP depletion and play an important role in regulating mitochondrial permeability transition, cytochrome c release, caspase activation, and apoptosis.     

Brief hypoxia conditions monocytes to protect reperfused cardiocytes against cell death via the CD11b receptor.

BACKGROUND: Traditionally leukocytes have been viewed as the mediators and effectors of cell injury after tissue ischemia and reperfusion through the indiscriminate release of toxic cytokines and oxygen free radicals. This can be detrimental to functioning of the transplanted heart when reperfused after implantation. Paradoxically, evidence now suggests that certain cytotoxic cytokines and even oxygen free radicals can be cytoprotective in smaller concentrations. This study sought to determine whether cultured human monocytes can be pre-conditioned by brief hypoxia to protect cardiomyocytes from cell death after hypoxia and re-oxygenation. METHODS: Cultured human monocytes were exposed to transient hypoxia (10 minutes), after which we determined CD11b expression using flow cytometry. The 3 control groups comprised immunoglobulin G-negative controls, fMLP-positive controls, and virgin monocyte (VM) controls. We studied chick embryonic ventricular myocytes in a flow-through chamber while controlling flow rate, pH, O(2), and CO2 tension. We quantified cardiomyocyte viability using propidium iodide (5 micromol/liter). Cell systems of cardiomyocytes alone, cardiomyocytes and VM, human monocytes exposed to transient hypoxia before coculture with cardiomyocytes (PCHM-cardiomyocyte), and PCHM cocultured with anti-CD11b antibodies for 30 minutes before coculture with cardiomyocytes (CDHM-cardiomyocyte) were subjected to 1 hour of hypoxia and 3 hours of re-oxygenation, and cell death was determined. The experiment was repeated and the cell systems fixed, stained, and examined for monocytes adhering to cardiomyocytes. RESULTS: CD11b expression increased significantly with both transient hypoxia and fMLP (18.39% +/- 4.116%, n = 5, and 37.04% +/- 7.783%, n = 5, respectively, p < 0.05 vs VM 100%, n = 5). Coculture of cardiomyocytes with VM had no effects on cardiocyte death (40.6% +/- 6.1%, n = 6) compared with controls (46.5% +/- 4.0%, n = 10). The PCHM cocultured with cardiomyocytes significantly decreased cardiomyocyte death (25.2% +/- 4.7%, n = 6, p < 0.05). This protection was abrogated by the addition of CD11b-blocking antibodies to PCHM before coculture with cardiomyocytes (51.0% +/- 6.1%, n = 6, p < 0.05). The PCHM showed increased adhesion to cardiomyocytes (5.4 +/- 0.38/high-power [HP] field vs 0.67 +/- 0.24/HP field in VM, p < 0.05). The increased adhesion was abolished by CD11b-blocking antibody (0.78 +/- 0.28 vs 0.67 +/- 0.24 cells/HP field, p < 0.05). CONCLUSIONS: These results suggest that monocytes activated by transient hypoxia protect cardiomyocytes during hypoxia and re-oxygenation through expression of CD11b receptors. These cells seem to adhere to myocytes through this receptor to achieve this effect. The exact mechanism is unclear and requires further study. Autologous recipient monocytes may be pre-conditioned to protect the donor heart during reperfusion.     

自吞噬在脂多糖诱导HL-1心肌细胞损伤中的作用

目的 评价自吞噬在脂多糖(LPS)诱导HL-1心肌细胞损伤中的作用.方法 采用随机数字表法,将培养的HL-1细胞随机分为4组(n=15):正常对照组(C组)不予任何处理,继续培养24h;LPS组在细胞培养液中加入LPS(终浓度1 μg/ml);自吞噬诱导剂纳巴霉素组(R组)在细胞培养液中加入纳巴霉素(终浓度0.2 μg/ml),孵育48 h时加入LPS(终浓度1 μg/ml);自吞噬抑制剂三甲基嘌呤组(3-MA组)在细胞培养液中加入加入3-MA(终浓度10 mmol/L),孵育48 h时加入LPS(终浓度1μg/ml).各组孵育4h时测定自吞噬蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)表达水平,并观察线粒体超微结构,计算自吞噬体数量,测定线粒体光密度值、线粒体膜电位(JC-1).于孵育24h时测定细胞凋亡率和Caspase-3活性.结果 与C组比较,LPS组LC3Ⅱ表达水平、线粒体光密度值、细胞凋亡率和Caspase-3活性升高,自吞噬体数量增加,JC-1降低(P＜0.05);与LPS组比较,R组LC3Ⅱ表达水平和JC-1升高,自吞噬体数量增加,线粒体光密度值、细胞凋亡率和Caspase-3活性降低,3-MA组LC3Ⅱ表达水平和JC-1降低,自吞噬体数量减少,线粒体光密度值、细胞凋亡率和Caspase-3活性升高(P＜0.05).R组线粒体超微结构损伤较LPS组减轻,3-MA组较LPS组加重.结论 自吞噬可减轻LPS诱导的HL-1心肌细胞损伤,机制可能与清除受损线粒体,改善线粒体功能,抑制细胞凋亡有关.     

Isoflurane Inhibits Cardiac Myocyte Apoptosis during Oxidative and Inflammatory Stress by Activating Akt and Enhancing Bcl-2 Expression

Background: Volatile anesthetics attenuate apoptosis. The underlying mechanisms remain undefined. The authors tested whether isoflurane reduces apoptosis in cardiomyocytes subjected to oxidative or inflammatory stress by enhancing Akt and B-cell lymphoma-2 (Bcl-2).

Methods: Adult and neonatal rat ventricular myocytes and atrial HL-1 myocytes were exposed to hypoxia, hydrogen peroxide, or neutrophils with or without isoflurane pretreatment. The authors assessed cell damage and investigated apoptosis using mitochondrial cytochrome c release, caspase activity, and TUNEL assay. They determined expression of phospho-Akt and Bcl-2 and tested their involvement by blocking phospho-Akt with wortmannin and Bcl-2 with HA14-1.

Results: Isoflurane significantly reduced the cell damage and apoptosis induced by hypoxia, H2O2, and neutrophils. Isoflurane reduced hypoxia-induced mitochondrial cytochrome c release in HL-1 cells by 45 +/- 12% and caspase activity by 28 +/- 4%; in neonatal cells, it reduced caspase activity by 43 +/- 5% and TUNEL-positive cells by 50 +/- 2%. Isoflurane attenuated H2O2-induced caspase activity in HL-1 cells by 48 +/- 16% and TUNEL-positive cells by 78 +/- 3%; in neonatal cells, it reduced caspase activity by 30 +/- 3% and TUNEL-positive cells by 32 +/- 7%. In adult cardiomyocytes exposed to neutrophils, isoflurane decreased both mitochondrial cytochrome c and caspase activity by 47 +/- 3% and TUNEL-positive cells by 25 +/- 4%. Isoflurane enhanced phospho-Akt and Bcl-2 expression. Wortmannin and HA14-1 prevented the action of isoflurane (53 +/- 8% and 54 +/- 7% apoptotic cells vs. 18 +/- 1% without blockers).