真核表达载体pcDNA3.1(-)-转化生长因子β3的构建

目的为研究成纤维细胞基因转染的可行性创造条件，从而为转化生长因子（TGF）83转基因治疗创面与病理性瘢痕的研究奠定基础。方法应用基因重组技术和限制性内切酶酶切构建并鉴定pcDNA3．1（-）-hTGFβ3真核表达载体，经脂质体Lipofectamlne^TM 2000介导质粒转染NIH3T3细胞后应用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）检测hTGFβ3 mRNA在真核细胞中的表达。结果重组真核表达载体pcDNA3，1（-）-hTGFβ3经限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切，电泳后显示1253hp的hTGFβ3目的片段和5．40kb的pcDNA3．1（-）载体片段，测序证实酶切片段与GenBank中登记的TGFβ3全长序列相同，证实pcDNA3．1（-）-hTGFβ3真核表达载体构建成功，经RT-PCR检测了hTGFβ3在转录水平mRNA的表达情况，表明质粒转染NIH3T3细胞后hTGFβ3 mRNA的表达明显增强。结论重组真核表达载体构建正确，并能在NIH3T3成纤维细胞中表达hTGFβ3 mRNA，为其在创面与病理性瘢痕的转基因治疗奠定了基础。     

pcDNA3-hBMP2基因转染成纤维细胞及其稳定表达

目的 探讨外源性hBMP2基因在成纤维细胞获得稳定表达的可行性。方法 将hBMP2的cDNA连入真核表达载体pcDNA3,形成重组真核表达载体pcDNA3-hBMP2,在脂质体介导下,将其导入小鼠成纤维细胞株（NIH3T3）。通过G418筛选获得阳性克隆,并继续培养4周,然后用原位杂交和免疫组织化学方法检测BMP2基因在成纤维细胞NIH3T3内的稳定表达情况。结果 经原位杂交和免疫组织化学证实,转染 pcDNA3-hBMP2后的成纤维细胞NIH3T3内有大量hBMP2 mRNA的转录和蛋白的表达。结论 在脂质体介导下,hBMP2基因能够导入成纤维细胞内并在其内获得稳定表达。     

pcDNA3-hBMP2转染对成纤维细胞 生物学性状的影响

目的 探讨人BMP2基因转染对成纤维细胞NIH3T3生物学性状的影响。方法 构建重组真核表达载体pcDNA3-hBMP2,并在脂质体介导下,将其导入NIH3T3成纤维细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用细胞原位杂交和免疫组织化学方法检测hBMP2基因在NIH3T3成纤维细胞内的表达情况;MTT法和FCM检测pcDNA3-hBMP2转染pcDNA3-hBMP2后成纤维细胞超微结构的改变,碱性磷酸酶的检测观察转染pcDNA3-hBMP2后成纤维细胞向成骨细胞分化情况。结果 转染pcvDNA3-hBMP2后的NIH3T3细胞内有大量hBMP2mRNA的转录及其蛋白的表达;转染pcDNA3-hBMP2对成纤维细胞增殖和细胞周期无影响;转染pcDNA3-hBMP2后的成纤维细胞超微结构可见粗面内质网丰富,囊腔扩张明显其内充满中等电子密度的蛋白分泌物;碱性磷酸酶活性显著上升。结论 pcDNA3-hBMP2转染对成纤维细胞NIH3T3增殖和细胞周期无影响。转染后的成纤维细胞不仅可形成BMP2,而且具有向成骨细胞系分化的特性。     

hTGFβ_1基因转染对NIH3T3成纤维细胞增殖的影响

目的　探讨在体外培养条件下转化生长基因 β1(hTGFβ1)转染对成纤维细胞生物学功能的影响。　方法　用脂质体介导共转染法将hTGFβ1质粒DNA转染至NIH 3T3成纤维细胞中 ,并设NIH 3T3转染空载体组和NIH 3T3对照组 ,用细胞生长计数、四唑氮蓝流式细胞法 (MTT)和软琼脂集落形成试验分别进行检测。　结果　 (1)转染hTGFβ1后 ,成纤维细胞的生长速度下降 ,以 4～ 6d尤为显著。DNA合成下降 ,G1比例增高 (从 39.9%升至 6 6 .2 % ,P <0 .0 5 ) ;(2 )转染空载体组与对照组的各细胞周期未见明显的变化 ;(3)MTT法与细胞计数法间有良好的相关性 (相关系数达 0 .992 ) ;(4 )转染hTGFβ1后 ,成纤维细胞的软琼脂克隆形成率明显下降 (从 1.18%降至 0 .5 5 % ,P <0 .0 5 )。　结论　hTGFβ1基因转染可抑制成纤维细胞的增殖。原因可能是TGFβ1阻碍了成纤维细胞的DNA合成 ,即G1期与S期之间发生了阻碍     

稳定表达人骨形成蛋白-2基因的成纤维细胞体内诱导成骨作用

目的 探讨稳定表达人骨形成蛋白—2(hBMP—2)基因的成纤维细胞是否具有体内诱导成骨能力。方法 构建置组真核表达载体pcDNA3—hBMP—2，在脂质体介导下，将其导入NIH3T3细胞，通过G418馈选获得阳性克随，并继续培养4周，用细胞原位杂交和免疫组织化学方法观察hBMP—2基因在NIH3T3细胞内的稳定表达，并观察了稳定表达hBMP—2的成纤维细胞碱性磷酸酶(ALP)活性的变化，将稳定表达hBMP—2的成纤维细胞植入裸鼠肌袋内观察其体内诱导成骨作用。结果 成功构建重组真核表达载体pcDNA3—hBMP—2，经细胞原位杂交和免疫组织化学证实，转染pcDNA3—hBMP—2后的NIH3T3细胞内有大量hBMP—2mRNA的转录及其蛋白的稳定表达，稳定表达hBMP—2的成纤维细胞ALP活性显著上升，植入裸鼠肌袋内4周有大量软骨形成。结论 稳定表达hBMP—2的成纤维细胞具有体内诱导成骨能力。     

VEGF15基因表达载体的构建和鉴定

目的：构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-VEGF165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的特异表达,为重组VEGF165进一步的生物学活性和临床研究奠定基础.方法：采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,在脂质体介导下将重组质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3,以抗生素培养基筛选抗性细胞,并对抗性细胞进行单克隆化,采用双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blotting等方法对目的蛋白在细胞中的特异表达进行分析鉴定.结果：完成真核表达载体pcDNA3.1（＋）-VEGF165的构建,并成功转染NIH/3T3细胞,筛选到一批G418抗性的阳性细胞,单克隆化的阳性细胞（吸光度值0.345±0.064）与空载体转染（吸光度值0.114±0.012）的对照比较,有显著的VEGF165表达（P〈0.01）,SDS-PAGE和Western Blotting检测到VEGF165在扩大培养的克隆细胞中的特异表达.结论：应用pcDNA3.1（＋）-VEGF165载体转染的NIH/3T3细胞可高效表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白.     

经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物的构建及其对创面愈合作用的实验研究

目的:构建经血管内皮生长因子(VEGF)165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,观察其在促进大鼠深度创面愈合过程中的作用.方法:采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA31(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至经传代培养的鼠成纤维细胞(NIH/3T3),再将转染后的NIH/3T3接...     

β-葡萄糖醛酸苷酶基因对人膀胱癌T24细胞的转染及表达

目的：探讨β-葡萄糖醛酸苷酶（βG）基因对人膀胱癌T24细胞的转染及表达的可行性。方法：采用基因工程技术构建带βG基因的真核表达载体，利用脂质体介导法在体外将βG基因导入人膀胱癌T24细胞，利用mRNA打点杂交、原位杂交、免疫组织化学、Western bloting 方法检测βG基因的转录和表达情况。结果：成功克隆出含人βG基因全长的真核表达载体pcDNA3.1-βG，以阳离子脂质体LipofectAMINE为载体将βG基因转染T24细胞后，经400mg/L的G418筛选后可形成抗性克隆；βG基因打点杂交和原位杂交结果显示转基因细胞中有βGmRNA的高表达；免疫组织化学和Western bloting证实转基因细胞中有βG蛋白的强阳性高表达。结论：βG基因可被成功转染入人膀胱癌细胞并能有效表达。     

bcl-2及其重要功能结构域在调节成纤维细胞NIH3T3凋亡中的研究

目的 以成纤维细胞NIH3tT13作为细胞模型,探讨bel-2 Loop Domain结构域在成纤维细胞凋亡中的作用地位.方法 构建正常和Loop Domain结构域突变bcl-2基因的真核表达质粒,用于成纤维细胞转染;脂质体介导,分别将(1)空载体质粒(2)携带bcl-2基因质粒和携带突变基因的质粒转染成纤维细胞(NIH3T3),转染后用肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激NIH3T3细胞诱导凋亡,应用流式细胞仪(FCM)检测各组细胞凋亡,应用华联小鼠全基因表达谱芯片检测各组细胞基因表达谱的变化.结果 成功构建bcl-2基因和Loop domain中突变的真核表达载体;成功将携带突变基因、野生基因的质粒转染入NIH3T3细胞;各组转染后用TNF-α刺激细胞诱导凋亡,FCM检测发现,TNF-α刺激细胞17 h后,NIH3T3未转染细胞凋亡明显增加,细胞凋亡率为(53.18 ±8.18)%,NIH3T3转染野生型bcl-2质粒组与NIH3T3未转染细胞组比较细胞凋亡率明显下调;NIH3T3转染突变bcl-2质粒组与NIH3T3未转染细胞组比较细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);NIH3T3转染野生型bcl-2质粒组与NIH3T3转染突变bcl-2质粒组比较细胞凋亡率明显上调;基因芯片检测发现:转染bcl-2基因的NIH3T3细胞凋亡基因与转染空质粒组下调,转染Loopdomain突变的真核表达载体的NIH3T3细胞凋亡基因比转染bcl-2基因的NIH3T3细胞上调.结论 证实bcl-2基因Loop domain结构域突变对bcl-2基因功能产生明显影响,bcl-2基因Loop domain结构域突变使NIH3T3细胞凋亡产生明显变化.     

核心蛋白聚糖对肾间质成纤维细胞特性作用的研究

目的 通过基因转染技术,将核心蛋白聚糖(DCN)转染成纤维细胞,观察DCN在成纤维细胞中的表达,及其表达的DCN对肾间质成纤维细胞特性的影响,探索肾脏疾病基因治疗的途径。方法 在成功构建重组逆转录病毒载体pL(DCN)SN的基础上,采用LipofectAMINE脂质体介导质粒DNA转染逆转录病毒包装细胞PA317,进行逆转录病毒的包装。以NIH 3T3细胞作为指标靶细胞进行病毒滴度测定。重组逆转录病毒在Polybrene的辅佐下感染正常大鼠肾间质成纤维细胞,并应用G418筛选。所得抗G418细胞克隆FB(LDCNSN)应用PCR和逆转录-PCR分析外源基因的整合和表达。采用Western印迹检测转基因细胞FB(LDCNSN)培养细胞上清液中DCN蛋白的检测。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和流式细胞仪分别测定细胞增殖和细胞周期,观察DCN对肾间质成纤维细胞增殖和细胞周期的影响。结果 重组逆转录病毒载体pL(DCN)SN的质粒DNA经LipofectAMINE介导,转染PA317包装细胞。G418筛选出抗性克隆,扩增。收集含重组逆转录病毒细胞上清液,在Polybrene的辅佐下感染大鼠肾间质成纤维细胞,并获得抗G418的细胞克隆FB(LDCNSN)。PCR和逆转录-PCR分析外源基因DCN的整合和表达,电泳可见1.1kb的条带。Western印迹分析FB(LDCNSN)细胞培养上清液中DCN蛋白质,证实FB(LDCNSN)表达DCN蛋     

TENOMODULIN基因转染对NIH3T3和C3H10T1/2细胞系肌腱相关分子表达的作用

目的研究过表达Tenomodulin(TNMD)对NIH3T3和C3H10T1/2细胞系肌腱相关分子表达的作用。方法体外培养NIH3T3和C3H10T1/2细胞系,利用脂质体法在两种细胞系中分别转染pCAGGS空载体和pCAGGS-TNMD表达载体,G418进行稳定筛选。RT-PCR确认成功转染后,利用倒置相差显微镜观察细胞形态,同时定量PCR检测肌腱相关基因的表达情况。结果两种细胞系转染后细胞形态均无明显改变。基因水平上,NIH3T3细胞过表达TNMD后,collagenⅥ和biglycan显著降低,collagenⅠ没有显著差别。而在C3H10T1/2细胞中,collagenⅠ和biglycan显著升高,collagenⅥ没有显著差别。结论过表达TNMD对NIH3T3和C3H10T1/2细胞系的细胞形态没有影响,但能影响肌腱相关基因的表达情况。     

新型非病毒纳米微囊-VEGF复合体转染鼠成纤维细胞的体外试验研究

探讨新型纳米微囊载体应用于基因治疗的可行性，安全性、转染效率，转移方法并与阳离子脂质体、质粒DNA进行比较。方法：以血管内皮细胞生长因子(VEGF165)为目的基因，构建真核表达载体pcDNA3．1／myc-hisA-VEGF165,分别利用纳米微囊、阳离子脂质体介导VEGF。转染鼠成纤维细胞(3Y1)，转染4h后镜下观察细胞转染后表型变化，24、48h后通过绿色荧光蛋白的表达观察瞬时转染效率，通过免疫组织化学、Western Blot检测基因表达水平及定位。MTT法检测对转基因细胞的毒性。ELIsA检测经G418筛选后上清培养液VEGF蛋白持续表达情况。结果：经G418筛选后的阳性细胞克隆，为高表达VEGF的鼠成纤维细胞模型。免疫组织化学证实pcDNA3．1／myc-hisA-VEGF165在转基因的细胞中呈高表达，定位于胞浆。Western Bldt结果显示纳米微囊转染3Y1细胞48h后细胞胞浆及培养上清中均有VEGF蛋白表达。免疫荧光显示纳米微囊转染效率明显高于相应浓度的阳离子脂质体，转染4h后镜下观察细胞表型显示10mM浓度纳米微囊有较高的毒性。MTT测定示纳米微囊对3Y1细胞有显著的抑制增殖作用并随浓度梯度变化，ELISA检测发现纳米微囊、脂质体组培养上清中VEGF蛋白表达水平可维持4周，但纳米微囊组随时间变化而下降，瞬时表达水平高于脂质体组。结论：纳米微囊转基因载体作为一种新型非病毒载体，具备基因治疗应用潜能，可能为血管重建基因治疗提供了一种新的模式。     

经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物的构建及其对创面愈合作用的实验研究

目的:构建经血管内皮生长因子(VEGF)165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,观察其在促进大鼠深度创面愈合过程中的作用.方法:采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA31(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至经传代培养的鼠成纤维细胞(NIH/3T3),再将转染后的NIH/3T3接种于猪脱细胞真皮表面得到成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物;而后将此替代物与自体薄皮片移植于SD大鼠深度创面(实验组),对动物创面愈合情况进行观察.单纯脱细胞异种真皮替代物移植大鼠作为对照组.结果:构建的真核表达载体pcDNA31(+)-VEGF165可成功转染至鼠成纤维细胞,移植后实验组皮片成活率(9376±340)%,对照组皮片成活率(8501±174)%,两者差异有显著性(t=8873,P＜001).组织学观察显示,移植第4周实验组毛细血管数量明显多于对照组.结论:成功构建了经VEGF165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,且其具有明显的促进动物创面愈合作用.     

荧光蛋白表达对小鼠成纤维细胞系NIH3T3体外增殖能力的影响

目的观察不同荧光蛋白表达对体外培养的小鼠成纤维细胞系NIH3T3增殖能力的影响,为细胞示踪技术提供理论依据。方法将体外扩增培养的NIH3T3细胞随机分为对照组、pLEGFP-N1组、pEGFP-N1组、pDsRed2-C1组。对照组不作任何处理,其他3组分别采用逆转录病毒载体pLEGFP-N1和真核表达载体pEGFP-N1、pDsRed2-C1两种转染方式进行增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(RFP)标记,经G418筛选培养后,观察各组细胞荧光蛋白表达情况,并计算其阳性表达率;观察各组细胞贴壁率,绘制生长曲线并测定倍增时间。结果对照组NIH3T3细胞未见荧光蛋白表达;pLEGFP-N1、pEGFP-N1组均表达EFGP,pDsRed2-C1组表达RFP,而pLEGFP-N1组阳性表达率高于另外两组(P<0.01).各组细胞均有较高的贴壁率。pEGFP-N1组细胞倍增时间为(39.6±0.6)h,pDsRed2-C1组(40.3±0.7)h,pLEGFP-N1组(36.5±0.7)h,均明显晚于对照组(27.9±0.6)h(P<0.01).结论荧光蛋白表达对NIH3T3细胞体外增殖有一定程度的影响,但逆转录病毒载体抑制作用低于普通真核表达载体,可作为细胞移植时荧光蛋白标记的较好选择。     

linamarase稳定转染肝癌细胞系的建立及研究

目的构建含木薯linamarase(lis)基因的稳定转染肝癌细胞系,并对其生物学特性进行研究。方法应用PCR法从木薯的DNA中扩增出lis基因,将其克隆至pcDNA3.1(+)质粒中,构建重组质粒pcDNA3.1/lis。通过脂质体法将其转染人肝癌细胞系HepG2,进行G418筛选,获得稳定转染的肝癌细胞系HepG2/lis,通过免疫荧光染色、RT-PCR和Western blot法鉴定lis在细胞中的表达;采用Lambert法对细胞内lis酶的活性进行分析;采用MTT法观察稳定转染细胞系生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期,裸鼠成瘤实验分析其体内成瘤特性。结果 lis基因能稳定整合于真核细胞中,并包装出具备β-葡萄糖苷酶活性的蛋白。lis在细胞中的稳定表达对细胞形态、生长特性、细胞周期、体内成瘤性等生物学特征并无明显影响。结论成功构建含lis基因的稳定转染肝癌细胞系,为将lis自杀基因系统应用于肝癌的治疗提供了实验基础。     

SOX9基因真核表达载体转染诱导BMSCs分化为类髓核细胞

目的椎间盘退行性变的生物学治疗方法是骨科学研究热点,寻找一种有效诱导BMSCs向椎间盘细胞分化的方法成为应用细胞移植治疗椎间盘退变的必要前提。探讨重组质粒pcDNA3.1IE-SOX9 Flag体外转染诱导兔BMSCs向类髓核细胞分化的影响。方法构建真核表达载体pcDNA3.1IE-SOX9 Flag。取1月龄新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs,体外诱导BMSCs向成骨细胞分化并鉴定;流式细胞仪检测细胞表面标记。将第3代BMSCs随机分为转染组、阴性对照组和空白对照组。转染组转染pcDNA3.1IE-SOX9Flag重组质粒,阴性对照组转染质粒pcDNA3.1,空白对照组不转染任何质粒。将构建好的重组质粒pcDNA3.1IE-SOX9Flag转染第3代BMSCs,72h后加入浓度为500mg/L的G418筛选7d后,改为浓度200mg/L的G418维持筛选压力并培养转染细胞。取各组BMSCs采用RT-PCR检测SOX9和Ⅱ型胶原基因(Col2al)的mRNA表达,Western blot检测SOX9蛋白的表达,免疫组织化学染色观察Ⅱ型胶原的表达。结果 BMSCs成骨诱导7d后ALP染色呈阳性;CD44表达阳性,CD34和CD45表达阴性。成功构建了真核表达载体pcDNA3.1IE-SOX9Flag。将重组质粒转染兔BMSCs,72h后转染效率为34.32%±1.75%;转染2周后BMSCs形态改变,呈多角形或椭圆形,细胞体积增大,增殖速度减缓,与椎间盘髓核细胞生长特点十分接近。RT-PCR鉴定发现转染组细胞SOX9 mRNA和Col2al mRNA表达阳性,对照组均为阴性。Westernblot检测发现转染组SOX9基因蛋白表达阳性,对照组未见表达。转染组BMSCs的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性。结论 SOX9基因真核表达载体成功转染兔BMSCs,被转染的干细胞向类髓核细胞分化,为进一步研究应用BMSCs移植治疗椎间盘退行性变奠定了理论基础。     

pcDNA 3.1/RPs15载体构建及对皮肤成纤维细胞作用的实验研究

目的 构建核糖体蛋白s15(RPs15)基因真核表达载体，研究其对小鼠皮肤成纤维细胞的体外作用。方法 将RT-PCR法获得的鼠胚皮肤RPs15cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3．1(-)，在FuGENE6介导下转染体外培养的小鼠皮肤成纤维细胞，观察RPs15基因的表达情况及其对成纤维细胞生物学特性的影响。结果 构建的重组表达载体pcDNA3．1／RPs15经DNA测序证实序列正确。RT-PCR法检测RPs15基因在转染的成纤维细胞中获得表达，细胞生长密度下降，形态发生变化。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／RPs15，并可在体外培养的小鼠皮肤成纤维细胞中表达，为深入研究RPs15基因对皮肤成纤维细胞的作用奠定了基础。     

神经生长因子对人胆管癌细胞增殖作用的影响

目的探讨神经生长因子（NGF）对人胆管癌细胞株QBC939增殖能力的影响。方法构建β-NGF的真核表达载体pcDNA3．0-NGF，经酶切鉴定后，采用脂质体lipofectamine转染人胆管埔细胞株QBC939。Western Blot检测蛋白的表达情况。MTT法检测转染前后细胞的增殖情况。结果成功构建β—NGF的真核表达载体pcDNA3．0-NGF：转染QBC939细胞后，能稳定表达β-NGF蛋白，且表达强度随转染质粒浓度的增加而增强，与对照组相比，差异有显著性（P〈0.0001）。MTT检测转染后的细胞增殖能力增强，与空白对照组和转染空质粒组相比，差异有显著性（P〈0．01）．且表现出量效依赖关系。结论NGF具有促进胆管癌细胞株QBC939增殖的作用。     

血管内皮生长因子基因稳定转染兔骨髓基质干细胞的研究

目的 检测人血管内皮生长因子(VEGF)基因稳定转染对兔骨髓基质干细胞(BM-SC)VEGF表达的影响.方法 分离并培养兔骨髓基质干细胞,利用脂质体介导pcDNA3.1-VEGF165转染兔BMSC,G418筛选稳定表达pcDNA3.1-VEGFl65的细胞克隆,RT-PCR、Western blot法检测转染前后细胞中VEGF165 mRNA和蛋白的表达.结果 通过筛选获得了稳定表达pcDNA3.1-VEGF165的细胞克隆.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot结果显示:稳定转染组BMSC中可检测到VEGF165 mRNA和蛋白的表达,空白和空载体组未见VEGF表达.结论 pcDNA3.1-VEGF165载体转染的兔BMSC可稳定表达外源性VEGF165 mRNA和蛋白,可作为治疗骨缺损和骨缺血性坏死研究的种子细胞.     

构建人CD59真核表达载体并利用壳聚糖介导转染NIH3T3细胞

目的构建人CD59真核表达载体pSecTag2／HygroB-CD59，并利用壳聚糖（chitosan）组装成纳米微粒复合体，转染小鼠NIH3T3细胞。方法应用PCR方法，从CD59-pGEM-T Easy Vector克隆相关的DNA序列，插入到具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2／HygroB中，构建pSecTag2／HygroB-CD59真核表达质粒，并进行酶切鉴定及序列测定。利用壳聚糖包裹质粒，转染小鼠NIH3T3细胞，并用抗CD59抗体对转染细胞进行免疫组织化学染色。结果CD59基因大小为312bp，与Genbank中记载的人CD59cDNA序列结果完全一致。利用壳聚糖-CD59纳米微粒转染NIH3T3细胞24h后，免疫组织化学染色显示转染细胞CD59呈弥漫性胞浆阳性。结论成功构建了人CD59真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NIH3T3细胞，为进一步探讨及研究转基因肝脏奠定了基础。