人晶状体上皮细胞系细胞膜Ca2+-ATPase同工异构体2的表达

目的　检测人晶状体上皮细胞系B 3(HLEB 3)中,细胞膜钙ATP酶(PMCA)的同工异构体之一,PMCA2的表达情况。 方法　细胞培养HLEB 3,当细胞培养达 90%融合时,提取其总mRNA,用PMCA2特异性引物,用反向聚合酶链反应(RT PCR)法检测PMCA2在mRNA水平上的表达。提取细胞膜蛋白,经SDS PAGE电泳以及蛋白免疫印记法(Westernblot),用抗 PMCA2的特异抗体检测其在蛋白质水平上的表达。 结果　RT PCR显示PMCA2特异性引物在HLEB 3细胞扩增出唯一 550bp的片段。蛋白免疫印记法证实PMCA2的表达,相对分子质量约为126 000。 结论　HLEB 3细胞中,在mRNA水平以及蛋白质水平均有PMCA2的表达。并有可能在HLEB 3细胞的钙离子平衡调节中发挥重要作用。     

紫外线B照射对人晶状体上皮细胞质膜钙ATP酶3表达的影响

背景 细胞质膜钙ATP酶3（PMCA3）参与维持晶状体上皮细胞（LECs） Ca2＋的平衡,可能与白内障的病理过程有关,紫外线B（UVB）是引起白内障的重要因素之一,但UVB对LECs中PMCA3表达的影响少有报道. 目的 研究UVB对人LECs系B-3（HLE B-3） PMCA3表达的影响. 方法 对HLE B-3细胞进行培养和传代,当细胞达80％以上融合时分别暴露于用不同剂量（0、5、10、20 mJ·s/cm2）的UVB分别照射0、20、40和80 s,然后继续培养24、48和72 h,用MTT法检测不同剂量UVB照射后细胞的生存率;用JC-1染色法检测UVB照射后细胞线粒体膜电位（△ψm）的变化;以DCFH-DA染色法检测UVB照射后细胞内活性氧簇（ROS）的变化;采用annexin V-FITC/PI染色法检测UVB照射后细胞的凋亡情况;用Fluo-3/AM染色法检测细胞内Ca2＋浓度的变化;分别采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）法和Western blot法检测UVB照射后细胞中PMCA3 mRNA及PMCA蛋白的表达变化. 结果 随着UVB照射剂量的增加和照射时间的延长,细胞生存率均明显下降,差异均有统计学意义（F分组=72.411,P=0.000; F时间=36.588,P=0.000）,其中10 mJ·s/cm2、20 mJ·s/cm2 UVB照射后24 h HLE B-3细胞的生存率分别为（75.3±2.2）％和（48.7±4.5）％,明显低于对照组的（100.0±0.0）％,差异均有统计学意义（P=0.001、0.000）;5、10、20 mJ·s/cm2 UVB照射后48 h细胞的生存率分别为（84.9±1.2）％、（69.3±17.4）％和（32.8±4.5）％,均明显低于对照组的（100.0±0.0）％,差异均有统计学意义（P=0.047、0.000、0.000）;5、10、20 mJ·s/cm2 UVB照射后72 h细胞的生存率分别为（55.1±3.0）％、（42.1±1.9）％和（26.1±4.7）％,与对照组的（100.0±0.0）％相比生存率明显降低,差异均有统计学意义（均P=0.000）.JC-1染色法检测表明,对照组细胞内可见红色荧光,5mJ·s/cm2 UVB照射后细胞内出现绿色荧光,10 mJ·s/cm2及20 mJ·s/cm2 UVB照射组出现绿色荧光增强,红色荧光减弱.5、10、20 mJ· s/cm2 UVB照射后细胞内的ROS由0.4％分别增加至35.8％、51.9％和76.7％.0 mJ·s/cm2 UVB照射组凋亡和坏死细胞比例为2.0％,5、10、20 mJ·s/cm2 UVB照射组凋亡和坏死细胞率分别为4.2％、7.6％和15.1％.10 mJ·s/cm2和20 mJ·s/cm2 UVB照射组细胞内Ca2＋水平分别为0 mJ·s/cm2照射组的（1.2±0.1）倍和（1.3±0.1）倍,差异均有统计学意义（P=0.039、0.004）.5、10和20 mJ·s/cm2 UVB照射组HLE B-3细胞PMCA3 mRNA表达量均明显低于对照组,差异均有统计学意义（P=0.001、0.004、0.000）,各组细胞中的PMCA蛋白相对表达量也均明显低于对照组,差异均有统计学意义（P=0.000、0.000、0.001）. 结论 UVB照射可导致白内障发生的机制可能与人LECs中PMCA3表达量下降和诱导LECs凋亡有关,UVB的作用呈剂量和时间依赖性.     

氧化锌抑制紫外线B诱导的人晶状体上皮细胞Ca2+-ATP酶1表达

目的 研究纳米材料氧化锌在有/无紫外线B(ultraviolet B,UVB)照射下对人晶状体上皮细胞系B-3(human lens epithelial cell B-3,HLEB-3)细胞质膜Ca2+-ATP酶1(plasma membrane calcium ATPase1,PMCA1)表达的影响.方法 HLEB-3细胞进行培养和传代,在有/无UVB照射情况下,加入不同浓度的氧化锌,利用DAPI染色细胞核;Annexin V/PI染色检测细胞凋亡;Fluo-3/AM染色检测细胞内Ca2浓度的变化;实时荧光定量PCR检测PMCA1 mRNA表达水平;Western blot方法检测PMCA1蛋白表达水平.结果 DAPI细胞核染色结果显示,氧化锌以浓度依赖方式使HLEB-3细胞产生典型的细胞凋亡反应;UVB照射可增加氧化锌对HLEB-3细胞的毒性效应;在UVB照射下,经氧化锌(2.5 μg· mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg· mL-1)处理的HLEB-3细胞凋亡及细胞内Ca2浓度增加(均为P＜0.05),细胞内Ca2水平分别从(156.34±4.59) nmol·L-增加到(173.88±7.17)nmol· L-1、(289.02±9.09)nmol·L-1、(488.36±48.16) nmol·L-,差异均有统计学意义(均为P＜0.05);在无UVB照射下,2.5 μg· mL-1、5.0 μg· mL-1、10.0μg·mL-1氧化锌组细胞PMCA1 mRNA表达分别是0μg·mL-1氧化锌组的0.75倍、0.57倍和0.41倍,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05);而在有UVB照射下,各浓度氧化锌组细胞PMCA1 mRNA表达分别是0μg·mL-1氧化锌组的0.64倍、0.24倍和0.09倍,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 氧化锌和UVB照射通过Ca2信号转导通路对HLEB-3细胞有协同抑制作用,提示氧化锌在有UVB照射的情况下对后发性白内障的治疗有巨大潜在作用.     

大鼠视网膜中转化生长因子β1和β2基因表达的定量检测(英文)

目的:定量检测转化生长因子-β1(Transforming growth factor β1,TGF-β1)和转化生长因子-β2(TGF-β2)在大鼠正常视网膜中的表达水平,探讨TGF-β1和TGF-β2在视网膜中表达的差异及其意义。方法:分离取出大鼠正常视网膜,抽提RNA并逆转录,实时荧光定量PCR技术分析TGF-β1和TGF-β2的mRNA含量。结果:大鼠视网膜RNA保持完好未被降解,能够用于表达水平分析。大鼠视网膜中TGF-β2相对于β-actin的基因表达水平为0.0378±0.009,TGF-β1为0.0008±0.0003,前者明显高于后者,统计学上差异有显著性(t=12.37,P<0.001),说明在视网膜中TGF-β的表达以TGF-β2为主,TGF-β2和TGF-β1的比值为55.00±26.61。结论:实时荧光定量PCR技术能够针对性地精确分析极少量组织细胞的基因表达。TGF-β在视网膜中以TGF-β2表达为主,提示可能是TGF-β2在视网膜病变中起主导作用。     

茶多酚对高糖条件下大鼠晶状体上皮细胞死亡率及线粒体膜电位的影响

目的探讨茶多酚对高糖条件下培养的大鼠晶状体上皮细胞死亡率（CDR）及线粒体膜电位（MMP）的影响,阐明糖尿病性白内障的发生机制及茶多酚干预的疗效及机制。设计实验研究。研究对象体外培养的大鼠晶状体上皮细胞。方法体外培养大鼠晶状体上皮细胞,培养基中葡萄糖浓度分别为5、30mmol／L（L1组和L2组）,另在30mmol／L葡萄糖浓度培养基中加入0．1μM和0．3μM的茶多酚进行干预（L3组和L4组）。流式细胞仪检测各条件下大鼠品状体上皮细胞MMP和CDR的变化。主要指标大鼠晶状体上皮细胞CDR及MMP。结果LI、L2、L3、L4组大鼠晶状体上皮细胞CDR分别为（0．68±0．32）％、（13．50±4．48）％、（0．64±0．48）％、（0．50±0．30）％,L1与L2组比较、L2与L3组比较差异均有统计学意义（P．0．04,P=0．04）,L3与L4组比较差异无统计学意义（P=0．99）。L1、L2、L3、L4组大鼠晶状体上皮细胞MMP分别为95．53±4．61、37．38±3．56、110．02±8．04、102．63±9．48,L1与L2组比较、L2与L3组比较差异均有统计学意义（P=0．01,P=0．01）,L3与L4组比较差异无统计学意义（P=1．00）。结论高糖条件下培养的大鼠晶状体上皮细胞线粒体膜电位降低、细胞死亡率明显升高。茶多酚具有稳定线粒体膜电位的作用,可延缓细胞凋亡,降低细胞死亡牢：（眼科,2009,18：104—107）     

Of men and mice: Human X-linked retinoschisis and fidelity in mouse modeling

X-linked Retinoschisis (XLRS) is an early-onset transretinal dystrophy, often with a prominent macular component, that affects males and generally spares heterozygous females because of X-linked recessive inheritance. It results from loss-of-function RS1 gene mutations on the X-chromosome. XLRS causes bilateral reduced acuities from young age, and on clinical exam and by ocular coherence tomography (OCT) the neurosensory retina shows foveo-macular cystic schisis cavities in the outer plexiform (OPL) and inner nuclear layers (INL). XLRS manifests between infancy and school-age with variable phenotypic presentation and without reliable genotype-phenotype correlations. INL disorganization disrupts synaptic signal transmission from photoreceptors to ON-bipolar cells, and this reduces the electroretinogram (ERG) bipolar b-wave disproportionately to photoreceptor a-wave changes. RS1 gene expression is localized mainly to photoreceptors and INL bipolar neurons, and RS1 protein is thought to play a critical cell adhesion role during normal retinal development and later for maintenance of retinal structure. Several independent XLRS mouse models with mutant RS1 were created that recapitulate features of human XLRS disease, with OPL-INL schisis cavities, early onset and variable phenotype across mutant models, and reduced ERG b-wave to a-wave amplitude ratio. The faithful phenotype of the XLRS mouse has assisted in delineating the disease pathophysiology. Delivery to XLRS mouse retina of an AAV8-RS1 construct under control of the RS1 promoter restores the retinal structure and synaptic function (with increase of b-wave amplitude). It also ameliorates the schisis-induced inflammatory microglia phenotype toward a state of immune quiescence. The results imply that XLRS gene therapy could yield therapeutic benefit to preserve morphological and functional retina particularly when intervention is conducted at earlier ages before retinal degeneration becomes irreversible. A phase I/IIa single-center, open-label, three-dose-escalation clinical trial reported a suitable safety and tolerability profile of intravitreally administered AAV8-RS1 gene replacement therapy for XLRS participants. Dose-related ocular inflammation occurred after dosing, but this resolved with topical and oral corticosteroids. Systemic antibodies against AAV8 increased in dose-dependent fashion, but no antibodies were observed against the RS1 protein. Retinal cavities closed transiently in one participant. Technological innovations in methods of gene delivery and strategies to further reduce immune responses are expected to enhance the therapeutic efficacy of the vector and ultimate success of a gene therapy approach.