染料木黄酮对体外人LECs增生的抑制作用

目的研究染料木黄酮对人晶状体上皮细胞（LECs）增生的影响。方法通过集落实验和四唑溴盐（MTT）比色法观察不同质量浓度染料木黄酮作用12、24、48、72h后对LECs增生的影响，流式细胞仪检测其对人LECs周期的影响及凋亡的诱导作用。结果12．5、25、50、75mg／L组对细胞集落形成均有抑制作用（P〈0．05），随质量浓度增加，集落形成率减少。作用12h、24h组质量浓度75mg／L、48h组质量浓度12．5、25、50、75mg／L以及72h组各质量浓度对LECs的抑制作用与对照组相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。流式细胞仪结果显示随质量浓度的增大，S期细胞明显增多。作用12h、24h诱导凋亡不明显；48h组12．5mg／L组出现凋亡峰，50mg／L组凋亡明显；72h组6．25mg／L组出现凋亡，随质量浓度的增加凋亡细胞数量增加。结论不同质量浓度的染料木黄酮可以抑制LECs的增生，有剂量效应关系和时间效应关系；作用一定时间，达到一定浓度可诱导人LECs凋亡。     

RGDRGD肽对人晶状体上皮细胞黏附与增生作用的影响

背景RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的小分子多肽,其在抑制肿瘤细胞黏附、转移和肿瘤新生血管的生成中起重要作用。研究证实RGD肽能够抑制晶状体上皮细胞（LECs）的黏附和增生,RGDRGD肽串联起来作用增强。目的研究RGDRGD肽对体外培养的人LECs黏附与增生的影响,并与RGD肽的作用进行比较。方法将在体外分离培养的LECs中分别加入250、500、1000mg／L的RGDRGD肽和RGD肽作为实验组,仅加入细胞培养液作为对照组。将LECs以2×10。／ml密度接种到含有纤维连接蛋白（FN）和I型胶原蛋白预孵化的96孔培养板中,培养1h后用MTT比色法检测RGDRGD肽与RGD肽对细胞黏附率的影响。将LECs接种于培养板,分别加入250、500、1000、2000mg／L的RGDRGD肽和RGD肽培养24、48、72h,检测RGDRGD肽和RGD肽对LECs增生的影响。结果RGDRGD肽对人LECs黏附率的抑制呈明显的剂量依赖性,随着其质量浓度的增加,对细胞黏附的抑制作用越强,500mg／L的RGDRGD肽比RGD肽抑制人LECs黏附的作用更强（P〈0．01）。RGDRGD肽对人LECs增生的抑制呈明显的时间剂量依赖性,1000mg／L的RGDRGD肽作用48h比RGD肽对人LECs增生的抑制作用更强（P〈0．01）。结论RGDRGD肽抑制LECs黏附与增生的作用强于RGD肽,为进一步临床应用提供了理论依据。     

硫酸镍对正常人眼晶状体上皮细胞抑制作用的研究

目的 探讨硫酸镍对体外培养的正常人晶状体上皮细胞(LECs)的抑制作用.方法 四甲基偶氮唑蓝法测定不同质量浓度的硫酸镍(100、200、300、400、500μg/mL)对人LECs增生的抑制作用,观察时间-效应关系;透射电镜观察细胞的超微结构改变.结果 不同质量浓度的硫酸镍作用24 h、48 h后,LECs的增生抑制率随质量浓度的增加而增高,呈明显的质量浓度-效应关系(r=0.964).作用24 h后LECs的半数抑制质量浓度(IC50)为162.71 μg/mL;作用48 h后为129.31μg/mL;电子显微镜下观察到细胞核染色质凝集、固缩,核碎裂,大量凋亡小体出现等典型的细胞凋亡的形态学改变.结论 硫酸镍对人LECs的增生具有明显的抑制作用,呈明显的质量浓度-效应关系,并能诱导人LECs凋亡.     

LY294002对bFGF诱导的兔晶状体上皮细胞增生的影响

目的探讨LY294002对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导的兔晶状体上皮细胞（LECs）增生的影响。方法兔眼LECs经培养后,将10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4mol／LLY294002分别加入LECs培养基中培养48h为LY294002组。另将10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4mol／LLY294002＋bFGF（10mg／L）加入培养基中培养LECs48h。bFGF（10mg／L）诱导LECs增生48h为阳性对照组,空白对照组仅用无血清DMEM。MTT比色法测定吸光度（A）值,分析各组药物对LECs增生的抑制率,流式细胞仪检测各细胞周期的LECs百分率。结果bFGF组与空白对照组相比A值升高,LY294002组随着药物浓度的增加,4值明显降低,差异有统计学意义（P〈0．01）。bFGF＋LY294002组与LY294002组相比,A值下降更明显,差异有统计学意义（P〈0．01）。流式细胞仪分析LY294002对LECs的抑制作用与MTT呈现相同趋势,随着LY294002浓度的增加,处于G0／G1期的LECs逐渐增加（P〈0．01）,而S期和G2／M期逐渐减少。结论LY294002可明显抑制体外培养的bFGF诱导的兔LECs的增生,并呈剂量依赖关系,为临床筛选防治后发性白内障的药物提供依据。     

核心蛋白多糖对兔晶状体上皮细胞增生的抑制作用

背景 研究发现,白内障囊外摘出术后组织修复反应可诱导房水中活性转化生长因子β(TGF-β)的增加,残留的晶状体上皮细胞(LECs)移行、分化,细胞外基质沉积,引起上皮-间质转化,导致后囊膜混浊(PCO)的发生.寻求有效的抑制LECs增生的药物对于临床上防治PCO的发生具有重要意义. 目的 探讨核心蛋白多糖( decorin)对兔LECs增生的抑制作用及其剂量-效应与时间-效应的关系. 方法 兔LECs细胞株进行培养和传代,将处于指数生长期的细胞以8×106个/L密度接种于96孔板,将0.1、1.0、10.0 mg/Ldecorin分别加入培养基中培养24、48、72 h,加入体积分数0.1％ DMSO培养的细胞为阳性对照组,常规培养基培养的细胞为空白对照组.MTT比色法分别测定不同质量浓度的decorin作用于LECs不同时间后的细胞生长抑制率;采用流式细胞技术测定各组细胞的细胞周期,用ELISA法检测各组培养液上清中TGF-β的水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定TGF-βmRNA在LECs中的表达,免疫细胞化学法观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达.结果 ELISA检测结果表明,各组培养基上清液中TGF-β表达量的差异有统计学意义(F=39.24,P=0.03),不同质量浓度组TGF-β水平均明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),1.0 mg/L、10.0 mg/L decorin组TGF-β水平均明显低于0.1 mg/L decorin组(P＜0.05).MTT比色法结果显示,≥1.0 mg/L decorin组LECs增生的抑制率明显高于空白对照组,各质量浓度decorin组药物作用48 h和72 h后LECs增生的抑制率明显高于24 h的值,药物作用72 h后LECs增生的抑制率明显高于48 h的值,差异均有统计学意义(P＜0.05),各质量浓度decorin组G0/G1期LECs所占比例均较空白对照组明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR检测显示,TGF-β mRNA的表达随着decorin质量浓度的升高而降低.免疫组织化学染色表明,10.0 mg/L decorin组α-SMA在LECs中的表达明显弱于空白对照组. 结论 Decorin可以抑制LECs的增生,也可以诱导LECs凋亡,其效应呈明显的剂量和时间依赖性,有望成为最具潜力的防治PCO的药物之一.     

Bcl-2反义寡核苷酸抑制视网膜色素上皮细胞增生的实验研究

目的 探讨不同浓度的Bcl-2反义寡核苷酸(bcl-2AS-ODN)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞增生活性的影响。方法 使用不同浓度(0、15、30、45、60μmol／L)的bcl-2AS-ODN和bcl-2 S-ODN处理人RPE细胞24h后，使用MTT、氚-标记脱氧胸苷掺人试验(^3H-TdR)测定RPE细胞增生的抑制率及DNA合成抑制率；使用流式细胞仪检测其对RPE细胞周期的影响；使用免疫组织化学染色法检测不同浓度bcl-2 AS-ODN作用下的RPE细胞bcl-2的表达。结果 不同浓度bcl-2 AS-ODN处理过的RPE细胞的抑制率和DNA合成抑制率随bcl-2 AS-ODN浓度的增高而升高，bcl-2 AS-ODN将RPE细胞阻滞在G0／G1期，免疫组化结果显示：bcl-2 AS-ODN可抑制RPE细胞bcl-2的表达。结论 bcl-2 AS-ODN对RPE细胞的增生有抑制作用且呈浓度依赖性，这一结果有可能成为增生性玻璃体视网膜病变(PVR)基因治疗的一个新靶点。     

多聚赖氨酸-乙二胺四乙酸交联物抑制兔晶状体上皮细胞生长的研究

背景后囊膜混浊（PCO）是现代白内障囊外摘出术后引起视力下降的主要原因。研究证实多聚赖氨酸-乙二胺四乙酸（EDTA）交联物（PLE）能够降低兔PCO的发生率。目的研究PLE对体外培养的兔晶状体上皮细胞（LECs）生长的抑制作用及有效药物浓度。方法取3月龄新西兰白兔晶状体前囊膜进行体外植块培养获得兔LECs并进行传代,取第2～3代传代培养的LECs消化后按1×10^5个／ml密度接种于96孔培养板中。在培养皿中加入12．5、25．0、50．0、100．0μmol／L的PLE,培养皿中加入DMSO培养液作为对照组。PLE作用48h用MTT比色法测定PLE对兔LECs增生的抑制作用并计算各浓度PLE组的吸光度（A490）值及其抑制率。结果≤25．0μmol／LPLE组可见细胞生长及形态改变不明显。≥50．0μmol／LPLE各组可见细胞生长及形态有明显改变,增生缓慢,生长差,数量减少,贴壁能力减弱。12．5、25．0、50．0、100．0μmol／L的PLE组LECs的A490值分别为0．278±0．013、0．266±0．028、0．260±O．022和0．247±0．012,均明显低于DMSO对照组的O．311±0．038（P=0．035、0．011、0．009、0．013）,且呈明显的剂量一效应依赖关系。12．5、25．0、50．0、100．0μmol／LPLE组对兔LECs的抑制率分别为10．61％、14．47％、16．40％和20．58％。结论PLE可以浓度依赖的方式抑制兔LECs的生长,可为临床筛选出防治PCO的药物提供依据。     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导牛晶状体上皮细胞凋亡的观察

目的 观察蛋白酶体抑制剂MG132对晶状体上皮细胞(LECs)凋亡的诱导作用.方法 用不同浓度的MG132分别处理牛LECs 12、24、36h,通过MTT法检测细胞活力,流式细胞术(FCM)检测MG132对牛LECs凋亡的影响.结果 在作用时间相同的条件下,随着MG132浓度的增高(0、2、5、10μmol/L),对牛LECs增生的抑制作用逐渐增强(P＜0.01).当作用时间达36h时,半效抑制浓度IC50为2.03μmol/L.同时,MG132能够明显诱导牛LECs凋亡:FCM分析结果表明,浓度为2μmol/L的MG132作用12h,细胞早期凋亡率为20.24%±1.51%,对照组为0.98%±0.20%(P＜0.01,n=3).结论 蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导牛LECs凋亡,蛋白酶体活性的丧失可能在白内障的形成中起重要作用.     

雷帕霉素对人视网膜色素上皮细胞增生和凋亡的影响

背景雷帕霉素（RAPA）是哺乳动物RAPA靶蛋白（mTOR）特异性抑制剂,能有效抑制晶状体上皮细胞（LECs）及多种肿瘤细胞增生并具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,研究其对视网膜色素上皮（RPE）细胞是否具有类似作用对临床上预防和治疗增生性玻璃体视网膜病变（PVR）具有重要意义。目的研究RAPA对体外培养的人RPE细胞增生和凋亡的影响。方法对人RPE细胞（D407细胞株）进行体外传代培养,按照培养基中加入药物的不同将培养的细胞分为9组,空白对照组进行常规培养;二甲基亚砜（DMSO）对照组在培养基中加入质量分数0．1％。DMSO;实验各组将5、10、20、40、80、160、320nmol／LRAPA分别加入培养基中并分别培养12、24、48h。应用噻唑蓝（MTT）法检测各组吸光度（A490）值并计算各组人RPE细胞增生的抑制率,应用Hoechst染色法检测各组人RPE细胞的凋亡率,评价上述各浓度RAPA作用不同时间后对人RPE细胞增生和凋亡的影响。结果不同浓度RAPA组对人RPE细胞的抑制率随浓度的增高而明显升高,差异有统计学意义（F=484．451,P〈0．01）,20～320nmol／LRAPA组在各时间点所测细胞增生抑制率均明显高于DMSO溶剂对照组,差异均有统计学意义（P〈0．01）。RAPA对细胞增生的抑制率随作用时间的延长明显增加,差异有统计学意义（F=232．262,P〈0．01）,各浓度的RAPA作用24h和48h后细胞增生的抑制率均明显高于12h,差异均有统计学意义（P〈0．05）。与空白对照组及溶剂对照组比较,10nmol／LRAPA作用12、24、48h均有诱导细胞凋亡的作用,差异均有统计学意义（P〈0．05）;20～320nmol／LRAPA组细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义（P〈0．叭）。各浓度RAPA组随作用时间的延长人RPE细胞的凋亡率明显增加（F=625．584,P〈0．01）。Hoechst33258染色可见凋亡细胞核碎裂并呈块状致密浓染,染色质固缩。结论RAPA以浓度和时间依赖的方式抑制体外培养的人RPE细胞增生并诱导其凋亡。     

地塞米松对人晶状体上皮细胞核转录因子κB及其抑制蛋白α的表达和细胞凋亡的影响

背景长期全身或眼局部应用糖皮质激素可诱导皮质类固醇性白内障,但其作用机制尚不明确。目的研究地塞米松作用于人晶状体上皮细胞（LECs）后对LECs中核转录因子κB（NF—κB）／NF—κB抑制蛋白κ（IκBκ）表达的影响及LECs凋亡的发生情况,了解皮质类固醇性白内障的发病机制。方法取人LECs系（HLE283）在含质量分数20％胎牛血清的DMEM中进行培养和传代。将不同浓度的地塞米松（0．01、0．1、1、10、100μmol／L）分别加入DMSO无血清DMEM培养液中作为不同浓度地塞米松组,不含地塞米松的DMSO无血清DMEM培养液培养的LECs作为空白对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot、流式细胞术等方法,分别在基因水平、蛋白水平检测LECs中NF—κB／IκB α浓度的改变及LECs凋亡率的变化。结果扩增的基因片段与所设计片段大小一致。地塞米松作用后NF—α核蛋白在LECs中的表达量随着地塞米松浓度的增加而下降,差异有统计学意义（F=36．077,P=0．004）;IκBα蛋白的表达随着地塞米松浓度的增加而上升,差异有统计学意义（F=35．741,P=0．002）。在同浓度地塞米松组,NF—κB核蛋白在LECs中的表达量随作用时间的不同差异有统计学意义（F=16．606,P=0．01）,与地塞米松作用24h时的表达量比较,36h和48h时的NF—κB核蛋白表达量明显下降,差异有统计学意义（P=0．002;P=0．01）。与地塞米松作用24h时的表达量比较,36h和48hIκBα蛋白在LECs中的表达量明显增加,差异均有统计学意义（P=0．014;P=0．002）。流式细胞仪检测显示LECs的凋亡率随着地塞米松浓度的增加明显上升,与空白对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论地塞米松通过上调IκBα的表达而过度抑制了NF—κB的活性,并导致LECs凋亡,其作用呈浓度依赖性,这可能是皮质类固醇性白内障发生发展的细胞学和分子生物学机制之一。     

C-Met抑制剂对人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的:探讨 c-M et抑制剂 K252a 对人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用。方法 : 取原代培养人晶状体上皮细胞加入 H G F、H G F K252a,以 D M EM 为对照,应用四唑盐法(M TT法)观察 K252a 对晶状体上皮细胞生长的抑制作用,蛋白质免疫印迹(W estern blot)方法检测 K252a 对 Bcl-2,C aspase-3 蛋白表达的影响。结果:H G F (50nm ol/L) K252a(30nm ol/L)组与对照组光密度值无显著差异 (P>0.05),Bcl-2 和 C aspase-3 的表达水平变化都不明显。结论:c-M et抑制剂 K252a 对人晶状体上皮细胞增殖有抑制作用。     

乙酰肝素酶抑制剂对人脐静脉内皮细胞增生和乙酰肝素酶表达的影响

背景已有动物研究表明,乙酰肝素酶（HPA）在脉络膜新生血管（CNV）中呈高表达,提示其与新生血管的形成密切相关。确定HPA抑制剂是否可影响血管的生成和发展对研究CNV的治疗有重要意义。目的探讨HPA抑制剂硫代磷酸甘露醇戊糖（PI-88）对HPA的表达及体外培养的人脐静脉内皮细胞（UVEC）增生的作用。方法人UVEC原代细胞株采用内皮细胞培养基（ECM）进行培养和传代,第3—5代细胞用于实验。用ECM配制PI-88溶液,使其终质量浓度为400．00、200．00、100．00、50．00、25．00、12．50、6．25mg／L,分别加入内皮细胞培养基培养24、48、72h后,用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞的吸光度（A570）值;并采用免疫组织化学法观察不同质量浓度PI-88作用48h后细胞中HPA的表达。结果正常培养的第3代人UVEC呈梭形或多角形。相同质量浓度PI-88作用不同时间培养的人UVECA。值差异有统计学意义（F=9．656,P=0．002）,不同质量浓度PI-88作用相同时间培养的人UVECA。值差异无统计学意义（F=2．721,P=0．053）。PI_88作用24h,各质量浓度PI-88组与0mg／LPI-88组UVECA。值的差异均无统计学意义（P〉0．05）,当PI-88的质量浓度〉50．00mg／L时,培养72h的人UVECA。值均明显低于0mg／LPI-88组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。PI-88作用延长至48h和72h时,在〈50．00mg／LPI-88组人UVECA。值均明显高于作用24h时,差异均有统计学意义（P〈0．05）;但各时间点≥100．00mg／LPI-88组人UVECA。值差异均无统计学意义（P〉0．05）。HPA在生长旺盛的UVEC细胞质内呈强阳性表达,少数细胞核也有表达;不同质量浓度PI-88溶液干预48h,25．00mg／LPI-88组人UVEC中HPA在细胞质内表达明显减弱。结论PI-88能够抑制人UVEC的增生,尤其是当PI-88的质量浓度〉100．00mg／L,其对人UVEC增生的抑制作用呈剂量和时间依赖性．其作用机制主要是下调HPA在人UVEC中的表达。     

谷氨酸对视神经脑膜上皮细胞的兴奋性毒性作用及其氧化应激机制

背景 作为脑脊液-视神经屏障的主要细胞成分,视神经脑膜上皮细胞(MECs)直接与脑脊液相接触,脑脊液中的组分改变可影响MECs的功能,进而对视神经的功能产生不利影响. 目的 探讨脑脊液中兴奋性神经递质谷氨酸对MECs功能的影响,为视神经疾病发病机制的研究提供新的线索. 方法 将培养的人MECs株制备成悬液并接种于96孔培养板中,密度为1×104/孔,分别在培养液中用添加100、200、400、600、800和1 000 μmol/L谷氨酸孵育12、24、36、48和72h,未添加谷氨酸者作为正常对照组,采用MTS法测定各组MECs的增生率(吸光度A490)值.采用600 μmol/L谷氨酸分别孵育MECs 24 h和48 h,未添加谷氨酸者作为正常对照组,采用实时定量PCR法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD) mRNA和热休克蛋白90(HSP90)mRNA的相对表达量;采用ELISA法检测细胞的总抗氧化能力(T-AOC),并通过荧光探针DCFH-DA观察细胞活性氧(ROS)的荧光强度. 结果 培养MECs生长良好,培养后72 h约80％细胞达到融合.不同浓度谷氨酸培养组随着谷氨酸浓度的增加及作用时间的延长细胞增生率逐渐下降,总体比较差异均有统计学意义(F浓度=52.501,P＜0.001;F时间=8.505,P＜0.001).实验后24 h和48 h谷氨酸处理组细胞中SOD mRNA相对表达量均明显低于同时间点正常对照组,差异均有统计学意义(t=20.278、t=16.724,均P＜0.001);谷氨酸作用MECs后24 h细胞中HSP90 mRNA相对表达量明显高于正常对照组,差异有统计学意义(t=5.065,P=0.002).实验后24 h谷氨酸处理组细胞中T-AOC活性为(30.835±2.094) nmol/(min·L),低于正常对照组的(32.873±2.317) nmol/(min·L),但差异无统计学意义(t=1.599,P=1.414);实验后48 h谷氨酸处理组细胞中T-AOC活性为(29.561±1.831)nmol/(min·L),低于正常对照组的(33.680±2.039) nmol/(min·L),差异有统计学意义(t=3.682,P=0.004).谷氨酸处理组细胞中ROS荧光强于正常对照组,谷氨酸处理组处理后24 h及48 h细胞中ROS含量分别为48.110±1.712和40.982±1.853,均明显高于正常对照组的36.608±1.009和37.153±1.424,差异均有统计学意义(t=14.178,P＜0.001;t=4.012,P=0.002). 结论 谷氨酸可抑制体外培养MECs的增生,其对MECs的兴奋毒性作用与氧化应激刺激作用有关.     

c—myc反义寡核苷酸抑制半乳糖性白内障晶状体上皮细胞凋亡的机制

目的研究c-myc反义寡核苷酸（ASODN）对半乳糖性白内障晶状体上皮细胞（LECs）凋亡的影响。方法将Wistar大鼠按随机数字表法分为生理盐水组、半乳糖组和半乳糖＋c-myc ASODN组,每组36只。半乳糖组及半乳糖＋c—mycASODN组每日球后注射O．2mL20％半乳糖,制作大鼠半乳糖性白内障模型,半乳糖＋c—mycASODN组球后注射半乳糖4h后加注Lipo—mycASODN复合液0．2mL,隔日1次。分别于给药后7、14、24d处死动物,取出晶状体,检测LECs的凋亡情况,采用TUNEL法检测c—mycASODN对半乳糖诱导LECs凋亡的影响,透射电镜下观察LECs超微结构的改变。结果各组在7、14、24d的LECs凋亡率比较,差异均有统计学意义（F7 days=3418．495,P〈0．01;F14 days=1137．555,P〈0．01;F14 days=2198．871,P〈0．01）;24d时半乳糖组LECs的凋亡率为56．57±3．20,生理盐水组为0．37±0．11,差异有统计学意义（P〈0．01）;半乳糖＋c．mycASODN组细胞凋亡率为29．35±1．63,较半乳糖组明显降低（P〈0．05）。透射电镜下观察发现,半乳糖组可见LECs呈凋亡细胞的早期改变;随着高糖诱导时间的延长,凋亡细胞逐渐增多;生理盐水组几乎未见到凋亡细胞;半乳糖＋c—mycASODN组凋亡细胞数量较同期半乳糖组少。结论在白内障形成过程中半乳糖能诱导LECs凋亡,c．mycASODN能够抑制半乳糖诱导的LECs凋亡。