不同冻存液对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

观察不同冻存液对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)冻存复苏后生物学特性的影响,优化冻存方法.方法 脐带取自2011年1月至2011年12月在中山大学附属第三医院产科剖宫产的足月健康产妇.从脐带分离得到的hUC-MSC培养传代,取第3代细胞.根据冻存液不同分为3组,A组冻存液为二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO):胎牛血清(fetal bovine serum,FBS):低糖杜氏培养基(low glucose Dulbecco's modified Eagle's medium,LG-DMEM)为1∶2∶7,B组为DMSO:FBS:LG-DMEM为1∶5∶4,C组为DMSO∶ FBS为1∶9,不含LG-DMEM.经冻存12个月,复苏细胞,以第3代未冻存细胞悬液作为对照组,采用台盼蓝染色法比较hUC-MSC的细胞存活率,采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法比较细胞的生长情况绘制生长曲线,倒置显微镜下观察细胞的生长状况,采用流式细胞仪检测各组细胞的表面标记.结果 A、B、C三组的细胞存活率分别为(20±4)%、(71±8)%和(85±7)%.与C组比较,A组和B组的细胞存活率降低,差异有统计学意义(均为P <0.05).细胞生长曲线显示,与对照组相比,C组hUC-MSC在各时间点细胞生长迅速,但差异无统计学意义(P>0.05);B组hUC-MSC在24 h、48 h、72 h细胞生长差异无统计学意义(P>0.05),在96 h时间点生长速率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而A组hUC-MSC在各个时间点细胞生长减慢,差异有统计学意义(均为P<0.05).形态学观察显示,A组细胞胞体宽大多角,并且较多分支,B组和C组细胞饱满,折光性好,呈长梭形、纺锤形或多角形.A组细胞复苏后细胞数目过少无法进行表面标记,B组和C组hUC-MSC表面标记物CD31、CD34、CD45、人类白细胞抗原(HLA)-DR表达阴性,CD105、CD90、CD44表达阳性.结论 含高浓度血清的冻存液适合hUC-MSC的长期保存,含90% FBS的冻存液为hUC-MSC的最佳冻存保护液.     

冻存复苏人脐带间充质干细胞体外扩增和向脂肪细胞分化的研究

目的：分离培养人脐带间充质干细胞（human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells hUCMSCs）,观察其冻存复苏后向脂肪细胞定向分化的能力。方法：将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小块培养,得到贴壁细胞,观察细胞生长及检测其表面抗原。将第1代的hUCMSCs采用梯度冷冻技术冻存5个月,复苏后培养至第12代时,加入成脂诱导剂培养。当诱导至21天时行油红O染色,7天及14天时用RT—PCR技术分别检测成脂转化基因过氧化物酶增殖剂受体（PPAR γ-2）和脂蛋白酯酶（LPL）。结果：组织块培养法收获的单个核细胞培养传代后,能获得均一贴壁的间充质干细胞,hUCMSCs冻存复苏后,活细胞约为86％,流式细胞仪分析这些细胞表达CDI3、CD44和CD71等MSCs标志物,不表达CD14、CD34和HLA—DR表面抗原。复苏细胞在成脂诱导剂的作用下,细胞中有脂滴产生,通过油红0染色显示细胞核周围有脂滴聚集,通过RT—PCR检测有LPL及PPARγ2 mRNA的表达。结论：采用组织块贴壁培养法分离获得的人脐带间充质干细胞可冷冻保存。复苏后培养至第12代仍具有向脂肪细胞分化的潜能,可作为脂肪组织工程种子细胞来源。     

人羊水来源间充质干细胞冻存后生物学特征研究

目的体外分离培养人羊水间充质干细胞(human amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells,HAFMSCs),观察低温冻存复苏后HAFMSCs生物学特征,为进一步研究奠定理论基础。方法取12份自愿捐赠的孕16～20周羊水标本,采用改良两步法分离培养HAFMSCs,用含量不同的FBS、DMSO冻存液冻存细胞,液氮冻存12周后42℃水浴复苏,锥虫蓝染色检测细胞存活率,MTT法检测细胞增殖速度并绘制生长曲线,流式细胞仪检测冻存复苏后HAFMSCs表型。对冻存复苏后的HAFMSCs进行成脂、成骨诱导分化培养,并分别采用油红O、von Kossa染色进行鉴定;实时荧光定量PCR分析细胞冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达差异。结果细胞冻存12周后,不同的冻存方案对细胞存活率影响有差异,优化的冻存方案为DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%。冻存复苏后的HAFMSCs呈漩涡状排列,生长曲线呈S形,与冻存前细胞生长曲线相似。流式细胞仪检测示冻存复苏后细胞的MSCs表型CD29、CD44、CD73、CD90为阳性,造血干细胞表型CD34、CD45为阴性。成脂、成骨诱导21 d,油红O、von Kossa染色均呈阳性。实时荧光定量PCR检测示冻存前后Oct-4、Nanog mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HAFMSCs具有体外增殖快、分化能力强的优势;并可耐受短期冻存,复苏后细胞存活率高,生物学特征及分化潜能未发生明显变化,冻存液DMEM/FBS/DMSO=50%/40%/10%是较好冻存方案。     

蜕皮甾酮和骨髓间充质干细胞对早期创面抗炎作用的初步研究

目的:研究蜕皮甾酮(EDS)及骨髓间充质干细胞(BMSC)对烫伤创面的早期抗炎作用.方法:新西兰大耳白兔18只,每只兔用烫伤仪制备4个创面并经病理证实为深Ⅱ度,随机标记为空白对照组(A组)、EDS组(B组)、BMSC(C组)、EDS+BMSC(D组).烫伤后5、10、15 d各处死6只家兔,观察炎性细胞浸润度、创面愈合...     

冻存对人脐血间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察冻存复苏对人脐血（human umbili calcord blood）间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）生物学特性的影响。方法体外分离、培养人脐血MSCs，传代后，将第3代的MSCs加入含10％二甲基亚砜（DMSO）和90％胎牛血清的细胞冻存液中，-196℃液氮保存4周，观察比较冻存前及冻存复苏后MSCs的形态、增殖及多向分化能力。结果冻存前及冻存复苏后，MSCs形态无明显差别，均呈典型的梭形，MSCs贴壁生长；MSCs生长曲线相似，冻存复苏后的细胞生长曲线略有下降，但差异无统计学意义（P〉0．05）；MSCs经脂肪诱导液诱导2周后，细胞浆中出现脂肪细胞所特有的脂肪滴，经0．5％油红0染色，脂肪滴染为红色，说明MSCs有向脂肪细胞分化的能力；Mscs经成骨诱导液诱导4周后，VonKossa染色可见黑色的矿化结节沉积，钙结节的形成为成骨细胞特有，说明Mscs有向成骨细胞分化的能力。提示冻存复苏后Mscs经诱导仍然可以向脂肪细胞和成骨细胞分化，与冻存前无明显差异。结论人脐血MSCs经冻存复苏后，其生物学特性可获良好保持。     

人脐带间充质干细胞应用研究进展

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于中胚层的一种具有自我更新多向分化潜能的成体干细胞,存在于全身结缔组织和器官间质中.人脐带间充质干细胞成功克服了骨髓间充质干细胞含量低、受年龄影响大等诸多限制,而且具有来源广泛、免疫原性低等优点.Mitchell[1]首次自脐带华尔通氏胶中成功地分离出成纤维样细胞并证实其具有多能干细胞的分化潜能以后,对于脐带来源的MSCs便引起了人们的广泛关注.近年来实验研究表明脐带间充质干细胞在组织工程、神经系统、肝脏疾病、心血管系统、免疫疾病、肿瘤疾病等方面取得了巨大的进展.本文主要在脐带间充质干细胞应用方面予以综述.     

低氧对人脐带间充质干细胞成脂肪分化的影响

目的：研究低氧（2%O2）对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）成脂肪分化的影响,为脂肪组织工程种子细胞的筛选提供实验依据。方法：培养条件有低氧（2%O2）、常氧（20%O2）、10%FBS完全培养基（GM）、10%FBS成脂培养基（DM）;将第3代hUCMSCs根据培养条件分为3组,对照组（常氧＋GM5天,常氧＋DM2周）、实验组1（低氧＋GM5天,低氧＋DM2周）、实验组2（低氧＋GM5天,常氧＋DM2周）;在诱导后2周分别进行油红O染色并观察其成脂效率。结果：与对照组相比,实验组1脂肪样细胞数量明显减少,实验组2脂肪样细胞数量明显增加。结论：将hUCMSCs预先进行低氧处理再转换为常氧培养可显著提高其成脂分化能力。     

人脐带Wharton胶间充质干细胞的生物学特性及雪旺细胞分化研究

[目的]研究人脐带Wharton胶间充质干细胞(WJMSCs)的生物学特性及向雪旺细胞诱导分化的可能性,为神经组织工程提供新的种子细胞.[方法]去除新鲜人脐带动、静脉和脐带外膜组织,获得Wharton胶,采用组织块培养法获得脐带Wharton胶中的干细胞,免疫荧光鉴定WJMSCs的细胞表面特异标记CD44,CD105,CD34,CD45,Stro-1,Vimentin和Nestin,评价干细胞的生物学特性;采用b-FGF和Forskolin等诱导WJMSCs向雪旺细胞分化,光镜观察诱导后细胞形态的变化;免疫荧光染色鉴定雪旺细胞特异性标记物p75和GFAP的表达;Western分析诱导前后雪旺细胞特异性标记物GFAP的表达.[结果]分离培养的WJMSCs免疫荧光染色CD44、CD105、Stro-1和Vimentin表达阳性,而CD34、CD45和Nestin表达阴性,具有间充质干细胞的生物学特性;WJMSCs经过胶质细胞生长因子的作用,光镜下发现诱导的细胞形态与雪旺细胞相似;免疫荧光染色p75和GFAP阳性;Western结果显示诱导的雪旺细胞标记物GFAP表达阳性.[结论]人脐带Wharton胶间充质干细胞可诱导分化成为雪旺样细胞,其表型和分子特征与雪旺细胞相似,诱导分化的人脐带Wharton胶间充质干细胞是一种理想的神经组织工程的种子细胞.     

人脐带间充质干细胞的生物学特性及应用前景

问充质干细胞（mesenchymal stem ceHs,Mscs）是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞,可在体外培养扩增,并能在特定条件下分化为神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等,在细胞替代治疗及组织工程等方面具有极大的应用价值。骨髓、胎儿、外周血及脐带血来源的MSCs都有其自身的劣势,而人脐带来源的MSCs有着无法比拟的优势：来源广泛、采集方便、无伦理法律限制、扩增迅速、免疫原性低、支持造血、多向分化等,在细胞治疗、基因治疗、组织工程等方面有着广阔的应用前景。     

人脐带间充质干细胞治疗脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种十分严重的综合性损伤,病情恢复十分困难。对病人的身心健康造成严重伤害,已成为新的影响人类生命质量的重要原因之一。SCI目前治疗方法很多,但干细胞移植最受大家宠爱。MSC最初的临床研究是1995年由Lazarus等     

人脐带间充质干细胞用于衰老相关疾病治疗的研究进展

随着干细胞移植技术的发展,通过输入干细胞进行抗衰老治疗或治疗退行性疾病成为人们研究的热点。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs)是一种存在于脐带沃顿胶以及血管周围组织中的独特前体细胞,具有自我更新和多向分化潜能。目前大量科学研究显示HUCMSCs通过再生和修复衰老的细胞、组织和器官达到抗衰老作用。该文对HUCMSCs的生物学特性、组织再生修复作用和抗衰老治疗机制的研究进展进行了详细回顾,并对目前HUCMSCs临床前研究现况进行了总结,提示HUCMSCs是一种具有良好应用潜力和价值的干细胞类型。     

人脐带间充质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究

间充质干细胞（MSC）在特定条件下能转化为神经元样细胞，并参与神经损伤修复，使其受到了越来越多的关注。研究表明，MSC不仅存在于骨髓，还存在于脐血，胎儿内脏等。脐带作为胎儿与母体间的营养桥梁．其中是否也含有并能否提取到足量的MSC引起本研究室的关注。本研究首次探讨从脐带获取MSC的方法及其基本生物学特性。     

人脐带间充质干细胞分泌物对肝细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC MSC)旁分泌物质在体外对肝细胞再生和凋亡的影响.方法 利用Ⅳ型胶原酶和胰酶消化法从脐带中分离间充质干细胞,制备含有HUCMSC旁分泌物质的条件培养基(mesenchymal stem cells-conditioned medium,MSC-CM),采用低浓度胶原酶原位循环灌流法分离肝细胞.试验分为对照组、2%MSC-CM组和8%MSC-CM组三组.采用MTT比色法观察不同浓度MSC-CM对正常肝细胞增殖的影响.测定上清中尿素、白蛋白的含量,观察不同浓度MSC-CM对肝细胞功能的影响.利用放线菌素D和肿瘤坏死因子α诱导肝细胞凋亡,采用细胞活性分析试剂盒检测不同浓度MSC-CM对肝细胞凋亡的影响.结果 与对照组比较,2%MSC-CM组吸光度(A)540nm值(P＜0.01)以及上清尿素和白蛋白含量显著升高(P＜0.01),肝细胞存活率增加(P＜0.05);8%MSC-CM组与对照组无显著差异.结论 低浓度的MSC-CM在体外可以刺激正常肝细胞再生,抑制受损肝细胞凋亡,改善肝细胞功能.     

人脐带间充质干细胞分泌物对肝细胞增殖和凋亡的影响

Objective To investigate the effect of human umbilical cord mesenchymal stem cell paracrine substance on proliferation and apoptosis of liver cells in vitro. Methods Mesenchymal stem cells (MSC)were separated from human umbilical cord with type Ⅳ collagenase and trypsogen digestion method and cultured in vitro. The human umbilical cord mesenchymal stem cells-conditioned medium(MSC-CM) which contain paracrine substance of human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUCMSC) was prepared. Hepatocytes were isolated from SD rats by low concentration collagenase perfusion procedure. There were three groups in the experiment, control group, 2% MSC-CM group and 8% MSC-CM group. The proliferation of normal hepatocytes were assayed with MTT method. We detected the urea and albumin level in culture supernatant to assay the hepatocyte function under different concentration MSC-CM. Hepatocytes were induced for apoptosis by Actinomycin D and tumor necrosis factor alpha (TNF-α),and the apoptosis effect of different concentration MSC-CM was assayed with LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit. Results The MTT assay showed that the absorbance of 2% MSC-CM group was significantly increased (P＜0. 01), and the urea and albumin levels of 2 % MSC-CM group were also significantly increased when compared with control group(P＜0. 01).LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit revealed that hepatocyte survival rate of 2 % MSC-CM group was increased when compared with control group(P＜0. 05), there were no significant differences in above-mentioned experiments when 8% MSC-CM group compared with control group. Conclusion The low concentration MSC-CM could stimulate normal hepatocyte proliferation, inhibit impaired hepatocyte apoptosis and improve hepatocyte function.     

人脐带间充质干细胞移植治疗晚期外伤性癫痫

目的探讨人脐带间充质干细胞移植治疗晚期外伤性癫痫的临床价值。方法对31例晚期外伤性癫痫患者进行人脐带间充质干细胞移植,观察临床效果。结果癫痫发作完全消失或仅有先兆者21例,极少发作(≤3次/年)者5例,发作明显改善(减少≥75%)者4例,无明显改善(减少<75%)者1例,满意率83.87%。结论人脐带间充质干细胞移植对治疗外伤性癫痫具有较好的效果。     

人脐带间充质干细胞分泌物对肝细胞增殖和凋亡的影响

Objective To investigate the effect of human umbilical cord mesenchymal stem cell paracrine substance on proliferation and apoptosis of liver cells in vitro. Methods Mesenchymal stem cells (MSC)were separated from human umbilical cord with type Ⅳ collagenase and trypsogen digestion method and cultured in vitro. The human umbilical cord mesenchymal stem cells-conditioned medium(MSC-CM) which contain paracrine substance of human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUCMSC) was prepared. Hepatocytes were isolated from SD rats by low concentration collagenase perfusion procedure. There were three groups in the experiment, control group, 2% MSC-CM group and 8% MSC-CM group. The proliferation of normal hepatocytes were assayed with MTT method. We detected the urea and albumin level in culture supernatant to assay the hepatocyte function under different concentration MSC-CM. Hepatocytes were induced for apoptosis by Actinomycin D and tumor necrosis factor alpha (TNF-α),and the apoptosis effect of different concentration MSC-CM was assayed with LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit. Results The MTT assay showed that the absorbance of 2% MSC-CM group was significantly increased (P＜0. 01), and the urea and albumin levels of 2 % MSC-CM group were also significantly increased when compared with control group(P＜0. 01).LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit revealed that hepatocyte survival rate of 2 % MSC-CM group was increased when compared with control group(P＜0. 05), there were no significant differences in above-mentioned experiments when 8% MSC-CM group compared with control group. Conclusion The low concentration MSC-CM could stimulate normal hepatocyte proliferation, inhibit impaired hepatocyte apoptosis and improve hepatocyte function.     

葡萄糖和谷氨酰胺浓度对人脐带间充质干细胞体外培养的影响

目的探索葡萄糖和谷氨酰胺浓度对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外培养的影响。方法分离、培养hUC-MSCs,光学显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面抗原。采用不同浓度葡萄糖和谷氨酰胺对hUC-MSCs进行体外培养,结晶紫计数法记录细胞增殖曲线,并检测培养液中营养物质及其代谢产物。结果传代的hUC-MSCs均一地高表达CD29、CD44、CD105和CD90,不表达CD14、CD45。葡萄糖浓度增加,会促进细胞的增殖,对葡萄糖消耗、乳酸生成和谷氨酰胺消耗没有影响,但增加了氨的生成;谷氨酰胺浓度增加,对细胞增殖的促进作用有限,但可提高细胞的生长速率,从而缩短培养时间,对葡萄糖和谷氨酰胺的消耗影响不大,但增加了乳酸和氨的生成。结论葡萄糖和谷氨酰胺都可促进细胞的增殖。葡萄糖缺失时其他氨基酸充当氮源,谷氨酰胺充足时谷氨酰胺转化成乳酸的通量增大。     

人脂肪间充质干细胞冻存方法的改进

目的：探索理想的冷冻人脂肪间充质干细胞的方法。方法：采用常规方法体外培养并扩增人脂肪间充质干细胞,消化细胞并洗涤离心加入10%二甲基亚砜、30%胎牛血清、60%MEM的细胞冻存体系,直接置-70℃冰箱贮存。冻存4、8和12周后,37℃水浴复温,通过检测细胞周期﹑细胞表型和成脂的多向分化潜能,以鉴定该方法的可行性。结果：消化后不经过传统的程序性降温冻存技术,直接在-70℃冰箱贮存,其细胞生物学特性无明显改变,细胞仍存在成脂的多向分化潜能。结论：人脂肪间充质干细胞悬液直接-70℃冰箱贮存不影响其生物学特性,是冷冻保存的一种可行方法。     

脐带间充质干细胞向汗腺样细胞分化后的表型变化

目的：比较人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）向汗腺样细胞诱导前后表型特征的变化.方法：对hUC-MSCs进行分离、培养、鉴定,通过显微镜观察、免疫细胞化学、流式细胞术等方法比较hUC-MSCs经汗腺分化诱导培养液培养前后细胞形态变化及癌胚抗原（CEA）、角蛋白7（CK7）、CK8、CK14、CK18、CK19表达的差异.结果：hUC-MSCs向汗腺样细胞诱导前呈梭形,呈成纤维细胞样;流式细胞仪检测发现CD29、CD90表达阳性;而CD34、CEA、CK14、CK19表达阴性.经汗腺诱导培养基诱导后hUC-MSCs分化为外形肥大、不规则、类似铺路石样的细胞,聚集性增殖;免疫细胞化学检测显示CK7、CK8、CK18抗原表达阳性;流式细胞仪检测结果显示CEA、CK14、CK19的阳性表达率分别为77.98%,48.47%,20.85%.结论：hUC-MSCs经过汗腺分化诱导培养基培养后能够分化为表达汗腺细胞标记物抗原的汗腺样细胞.