NSPc1相互作用蛋白的筛查及其与组蛋白乙酰化酶HBO1相互作用的验证

目的 寻找多梳家族(polycomb group)蛋白NSPc1的体内可能的相互作用蛋白.方法 通过酵母双杂交实验筛选与NSPc1相互作用的蛋白.使用Pull-down实验,Co-IP实验以及细胞内荧光共定位实验进一步证实双杂交中发现的相互作用.结果 分别以NSPc1蛋白的全长、N端和C端作为诱饵筛查人3月胎脑cDNA文库,发现N端诱饵可以与组蛋白乙酰化转移酶HBO1相互作用,该相互作用在体内外实验中都得到了验证.结论 组蛋白乙酰化酶HBO1是NSPc1的相互作用蛋白之一,该相互作用可能参与NSPc1对靶基因转录的表观抑制活性的发挥.     

视神经蛋白结构域的功能性作用

视神经蛋白 （OPTN） 是一种多功能蛋白,与一系列蛋白质相互作用,参与多种细胞功能,与青光眼和肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病有关。OPTN 含有多个结构域使其能够参与多种细胞功能调节,包括 NF-κB 调节、膜运输、 胞吐、囊泡运输、维持高尔基体形态、细胞周期控制、泛素化调节和自噬。OPTN结构和功能的多样性,为探讨其参与疾病的具体作用机制带来了挑战。本文梳理了近年来有关OPTN的研究文献,总结了OPTN各个结构域参与的功能性作用,为进一步理解OPTN在神经退行性疾病中所发挥的作用提供了思路和参考。     

CRISPR/Cas9结合Cre-loxP技术制备溴结构域蛋白4基因敲除小鼠

背景:目前CRISPR/Cas9结合Cre-loxP技术制备溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)基因敲除小鼠的实验方法非常少见.目的:运用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠基因组中BRD4基因片段,构建BRD4基因敲除小鼠.方法:根据BRD4基因的外显子序列,设计...     

与接头蛋白Bam32相互作用的蛋白分子的鉴定

目的:研究接头蛋白(adaptorprotein)Bam32在B细胞抗原受体(Bcellantigenreceptor,BCR)信号转导级联反应中的作用。方法:以Bam32全序列为诱饵,应用酵母双杂交技术筛选能与Bam32相互作用的蛋白分子,并用293T细胞共转染和免疫共沉淀法加以证实。结果:应用酵母双杂交技术筛选出能与Bam32相互作用的蛋白分子,其中1个出现强阳性反应的克隆编码酪氨酸激酶Lyn。用293T细胞共转染和特异性免疫共沉淀法证实,Bam32可在哺乳动物细胞中与Lyn共沉淀。应用抗磷酸化酪氨酸抗体检测显示,Bam32与Lyn相互作用可导致Bam32磷酸化。结论:Bam32可同Lyn相互作用,导致Bam32磷酸化,这在激活下游产物的级联反应中可能起重要作用。     

人cubilin蛋白与其配体白蛋白结合特定结构域的预测

目的 同源模建cub8功能域的三维模型,并以计算机辅助的分子对接方法预测cub8功能域与白蛋白的候选结合氨基酸残基.方法 采用insightⅡ工作站对cub8蛋白进行同源模建,对cub8蛋白和白蛋白进行分子对接,寻找白蛋白和cub8的候选结合氨基酸残基.结果 cub8蛋白三维结构为两个反平行的β片层结构,中间以β转角相连.cub8蛋白片段与白蛋白通过正负电势的吸引完成受体与配体的结合.Asp59-Tyr60-Leu61-Glu62-Leu-Tyr64和Arg72-Tyr73肽段可能是cubilin与白蛋白结合的关键氨基酸残基.结论 利用计算机辅助的分子对接技术,获得cub8和白蛋白相互作用的两个候选结合域,为进一步研究cubilin与白蛋白相互作用奠定基础.     

与PIH1D1相互作用的蛋白分析

目的分析细胞中与PIH1D1相互作用的蛋白。方法构建稳定表达FLAG-HA双标签标记的PIH1D1蛋白的HEK293T细胞株,利用FLAG-HA串联亲和纯化(TAP)双标签纯化实验,对目的条带进行质谱分析。结果成功构建稳定表达FLAG-HA双标签标记的PIH1D1细胞株。通过质谱分析得到了PIH1D1相互作用的蛋白数据,包括细胞质内RNA PolⅡ组装复合物成员RPAP3、UXT、PFD2和PFD6等,凋亡复合物成员MONAD/WDR92等,钙调蛋白信号通路中的PIP和CALM1以及代谢通路中的PKM和LCN1等。结论 PIH1D1与细胞中RPAP3、UXT、PFD2、PFD6、MONAD/WDR92、PIP、CALM1、PKM和LCN1等相互作用,提示PIH1D1可能参与细胞中RNApolⅡ组装、细胞凋亡、钙调蛋白通路等多种生理过程。     

酵母双杂交技术筛选并回转验证在胞内与PML-C结构域相互作用的蛋白

目的 利用酵母双杂交技术在活细胞内筛选并回转验证与PML-C结构域相互作用的蛋白质.方法 通过诱饵质粒pGBKT7-PML-C,利用酵母双杂交系统从白血病细胞cDNA文库中筛选与PML-C结构域相互作用的蛋白质.结果 利用酵母双杂交技术筛选到43个能与PML-C结构域相互作用的克隆;经进一步的归类与酵母回转试验得到9个阳性克隆.结论 在细胞内PML-C结构域能与多种蛋白质有相互作用.中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)介导的急性早幼粒细胞白血病的发生可能与这些相互作用所致的生物学功能改变有关.     

运动神经元生存蛋白SMN与Sm蛋白的结合作用

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是一类与运动神经元存活基因(survival of motor neurons gene,SMN gene)突变有关的神经系统变性疾病,而SMN基因的转录产物即为SMN蛋白(survival of motorneurons protein,SMN protein).SMN蛋白与多种蛋白结合后发挥作用,如SMN-Sm蛋白的相互作用在富含尿嘧啶的小核核糖核蛋白体(uridine-rich small ribonucleo-proteins,UsnRNPs)转运装配中有重要意义.SMN蛋白是通过其Tudor结构域与剪接体Sm蛋白的二甲基化修饰的富含精氨酸-氨基乙酸域(arginine and glycine-rich,RG)结合.     

ataxin-3相互作用蛋白的筛选及鉴定

目的 筛选ataxin-3的相互作用蛋白并进行互作结构域分析，探讨ataxin-3的功能和脊髓小脑型共济失调Ⅲ型／马查多-约瑟夫病的发病机理。方法应用酵母双杂交系统3，从成人脑eDNA文库中筛选和鉴定突变型ataxin-3的互作蛋白，构建ataxin-3蛋白羧基端Bait质粒，进行互作结构域分析。应用激光共聚焦显微镜观察ataxin-3与所筛到的互作蛋白在哺乳动物细胞中的共定位情况。结果分离获得5个新的ataxin-3互作蛋白，视紫红质-二磷酸鸟苷解离抑制因子α、苏素-1、氨氯吡嗪脒敏感性神经元阳离子通道2和2个未知新序列。结构域分析显示除1个未知蛋白与ataxin-3蛋白羧基端互作外，其余4个均与氨基端互作。在SH-SY5Y细胞的细胞核内，野生型ataxin-3与苏素-1共定位，突变型ataxin-3所形成的核内蛋白聚合体也与苏素-1共定位。结论 发现1个未知蛋白可能与ataxin-3蛋白羧基端互作，苏素1可能与ataxin-3蛋白氨基端互作，苏素化可能参与了ataxin-3蛋白的翻译后修饰和脊髓小脑型共济失调Ⅲ型/马查多-约瑟夫病的发病过程。     

VLDL-R配体结合结构域的克隆与表达

目的构建含VLDL-R配体结合结构域融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达与纯化。方法利用PCR技术扩增LBR1-8的DNA片段,将其克隆至原核表达载体pET28a( )中,随后将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌Rosetta中,利用IPTG诱导蛋白表达并优化其表达条件,表达产物经Ni -NTA亲和层析柱纯化回收,并采用SDS-PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR,酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主经过IPTG诱导成功表达了LBR1-8,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建pET28a( )-LBR1-8表达质粒,表达并经纯化得到了LBR1-8。     

酵母双杂交筛选与转录因子ZNF580相互作用的蛋白

目的: 寻找可能与锌指转录因子ZNF580存在相互作用的蛋白。方法: 以ZNF580基因开放阅读框作为模版,PCR扩增后连接入酵母表达质粒pGB。诱饵质粒pGB-ZNF580经测序验证后转化酵母菌株Y190,人胎脑cDNA文库亦转化到能稳定表达诱饵蛋白的Y190酵母菌株中,并铺到含有营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-His/-Leu)的培养皿上进行初步筛选。所得阳性克隆再进行β-半乳糖苷酶克隆转移滤纸实验进一步去除假阳性。随机挑取部分阳性克隆,逐一转化入含有诱饵质粒的Y190 酵母菌进行一对一验证。分离阳性克隆质粒测序,并应用生物信息学方法分析阳性克隆cDNA编码的蛋白。结果: 确定了14种与ZNF580可能存在相互作用的蛋白。结论: 初步探讨了ZNF580的功能及其可能参与的信号转导通路,为进一步研究转录因子ZNF580参与动脉粥样硬化的机制奠定了实验基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白与载脂蛋白AⅠ相互作用的研究

erase Reporter Assay System检测荧光素酶强度.结果 CoIP试验显示有共沉带的出现,且大小正确.转染pACT-apoA Ⅰ和pBIND-core组,相对荧光素酶活性值较pACT和pBIND空载体组明显升高.结论 HCV-core可与apoA Ⅰ在体内相互作用,为慢性丙型肝炎致肝脂肪变的机制研究提供理论依据.     

原癌基因LMO3相互作用蛋白的筛选及鉴定

目的 通过筛选LMO3的相互作用蛋白,进一步了解LMO3的作用及可能机制.方法:酵母双杂交方法 筛选LMO3相互作用蛋白,并通过酵母结合试验、免疫共沉淀及荧光共定位等进行验证.结果:在初步获得相互作用蛋白CIB的基础上,在酵母中证实了LMO3与CIB的相互作用,并通过酵母结合试验确定了CIB与LMO3的相互作用位点,发...     

LIM结构域结合蛋白1在脑胶质瘤患者中的表达研究

目的 观察LIM结构域结合蛋白1(LIM-domain-binding 1,Ldb1)在脑胶质瘤患者中的表达.方法 采用Real-timePCR方法检测46例脑胶质瘤手术患者脑组织、18例正常对照和16例良性脑肿瘤对照脑组织标本中Ldb1 mRNA的表达水平;采用免疫组化EnVision二步法观察Ldb1在高级别胶质瘤中的蛋白表达定位.结果 脑胶质瘤患者脑组织Ldb1的mRNA表达高于正常对照组和良性脑肿瘤对照组.Ldb1在不同分级的胶质瘤中表达并不相同,在Ⅲ、ⅣV级中的相对表达量明显高于Ⅰ、Ⅱ级(P ＜0.001).在高级别胶质瘤中,Ldb1蛋白主要表达在肿瘤细胞核和胞浆内.结论 脑胶质瘤患者肿瘤组织中Ldb1表达增高,可能参与了胶质瘤的发生、发展过程.     

福赛斯拟杆菌与牙龈卟啉单胞菌表面蛋白间相互结合机制

福赛斯拟杆菌 (Bacteroidesforsythus,简称B .forsythus)和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,简称P .gingi valis)是人类牙髓根尖周疾病以及牙周疾病的重要致病菌 ,在慢性根尖周炎患牙根管内定植呈正相关关系。但两菌间相互结合的蛋白分子以及结合机制目前尚未见报道。本文采用Westernblot技术探讨牙龈卟啉单胞菌与福赛斯拟杆菌相互作用及其作用机制。福赛斯拟杆菌ATCC4 30 37菌细胞低温超声破碎 ,离心并分别收集上清液和沉淀全菌蛋白。牙龈卟啉单胞菌菌体蛋白和菌毛FimA蛋白及该菌全菌抗体和菌毛蛋白FimA特异抗体由日本大阪大…     

人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23与宿主蛋白IGFBP4相互作用的鉴定

目的:利用蛋白质相互作用的技术筛选与pUL23相互作用宿主蛋白,为研究pUL23蛋白对人巨细胞病毒繁殖的影响提供线索。方法:通过酵母双杂交系统从人胚肾cDNA文库筛选与pUL23相互作用的宿主蛋白;通过GST-pu ll-down技术研究二者体外物理性相互作用;免疫共沉淀技术进一步研究二者在胞内相互作用。结果:Pu ll-down技术、免疫共沉淀技术确定了宿主蛋白IGFBP4与pUL23具有相互作用。结论:上述结果为研究pUL23蛋白调节病毒自身繁殖功能提供重要依据。     

Cas9蛋白的真核拆分质粒构建及功能验证

目的 研究Cas9蛋白结构与功能的关系,拆分蛋白是否互补具有完整的特异性切割功能,进一步为微小Cas9的蛋白转导、腺相关病毒载体构建奠定基础 方法 对S.pyogenes Cas9进行改造,在第715 Gly和716 Gln之间断开,构建了Cas9-1 (1-715aa)和Cas9-2(716-1368aa)两部分拆分质粒,与HBB基冈的sgRNA转染293T细胞,研究拆分后的蛋白是否具有切割活性 结果 高分辨率溶解曲线(HRM high resolution melting)结果证明,Cas9拆分蛋白可以在体内切割DNA,Tm值与对照组相差约0.5℃;T7E1突变检测证明,同时转染两部分Cas9拆分蛋白质粒和sgRNA质粒时具有完整Cas9的切割作用,将拆分Gas9-部分与sgRNA共表达后,效率为完整Cas9蛋白的50％.