定量PCR检测巨细胞病毒在肾移植中的应用

巨细胞病毒（CMV）感染是肾移植受者发病和死亡的重要原因。本文就定量PCR在预测肾移植受者CMV感染的症状发作期及监测更昔洛韦的疗效等方面的价值进行阐述。     

荧光定量PCR快速检测婴儿中枢神经系统巨细胞病毒

目的探讨荧光定量PCR技术快速诊断中枢神经系统损伤婴儿人巨细胞病毒(HCMV)感染的临床价值,为婴儿HCMV先天性感染的快速特异性诊断提供实验依据。方法分别用实时荧光定量PCR技术和ELISA法检测84例疑似先天性HCMV感染的中枢神经系统损伤婴儿中尿液HCMV-DNA及血清HCMV-IgM。结果 84例中枢神经损伤婴儿尿液中,29例HCMV-DNA阳性,检出率为34.5%。活动性HCMV感染病毒载量介于5.9×105～7.6×102 copy/mL。HCMV-IgM阳性15例,检出率17.8%。两种方法阳性检出率差异有统计学意义(χ2=6.87,P<0.01)。结论婴儿先天性HCMV感染是引起其中枢神经系统损伤的重要原因之一。在连续动态检测患儿HCMV多种指标时,实时荧光定量PCR法可快速、特异地定量检测HC-MV-DNA,有效反映体内HCMV的活动性感染,在HCMV感染的快速诊断、疗效观察方面具有更好的临床应用价值。     

荧光定量PCR检测血清巨细胞病毒DNA的临床应用

目的建立一种区分巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)潜伏性感染与活动性感染并适于临床大量标本CMV DNA检测的常规检测方法。方法利用血清作为待检标本,通过优化实验方案,建立血清CMV DNA的荧光定量PCR(fluorogenic quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测方法;并利用FQ-PCR技术对54例疑似CMV感染的患儿(1个月～15岁,抗CMV IgM阳性或IgM与IgG双阳性)及32例患非感染性疾病的患儿(3个月～14岁,抗CMV IgM检查均阴性,部分患儿抗CMV IgG阳性)血清CMV DNA进行检测。结果54例CMV疑似感染患儿中,CMV DNA检测大于1×10~3拷贝/ml者占40.74%,而32例非感染性疾病患儿中,CMV DNA检测大于1×10~3拷贝/ml者只占18.75%,两者比较有显著性差异(P<0.05)。采用FQ-PCR技术,在LightCycler和Rotor-Gene检测仪上检测具有相同的灵敏度,且具有可比性。结论FQ-PCR定量检测血清CMV DNA的方法能够更灵敏地反映CMV活动性感染,假阴性率低,重复性好,结果可靠。FQ-PCR定量检测血清内CMV DNA的方法可作为临床CMV DNA的检测的常规方法。     

聚合酶链反应检测尿内人巨细胞病毒

２７例尿标本同时采用超速离心法，酚氯仿法抽提法、及原尿直接法、然后分别用于人类巨细胞病毒的聚合酶链反应检测。其阳性检出率分别为８５．１９％，５１．８５％和４８．１５％。经配比资料统计学分析表明，超速离心处理的阳性检出率显著高于抽提法和直接法。实验表明，原尿直接法的假阴性十分明显；而酚氯仿抽提处理亦无实际应用价值。唯有超速离心处理法可显著地提高尿巨细胞病毒的检测敏感性。     

聚合酶链反应检测尿内人巨细胞病毒

２７例尿标本同时采用超速离心法，酚氯仿法抽提法、及原尿直接法，然后分别用于人类巨细胞病毒的聚合酶链反应检测。其阳性检出率分别为８５．１９％，５１．８５％和４８．１５％。经配比资料统计学分析表明，超速离心处理的阳性检出率显善高于抽提法和直接法。实验表明，原尿直接法的假阴性十分明显；而酚氯仿抽提处理亦无实际应用价值。唯有超速离心处理法可显著地提高尿巨细胞病毒的检测敏感性。     

荧光定量PCR检测巨细胞病毒感染的临床分析

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）又称人类疱疹病毒5型，属于疱疹病毒亚科。HCMV是有包膜的DNA病毒，为双链线性DNA分子，其基因组长约240kb。HCMV具有高度种属特异性，只能在人成纤维细胞中培养增殖，并可产生典型的细胞病变：细胞膨胀增大，细胞核及胞浆内出现包涵体。HCMV在体内除了可感染人成纤维细胞外，还可感染表皮细胞、内皮细胞、精子细胞及巨噬细胞等，引起巨细胞包涵体病、输血后传染性单核细胞增多症、先天畸形、肝炎、间质性肺炎及视网膜炎等疾病。     

改良共有引物PCR法检测宫颈癌组织中的人乳头瘤病毒

本文采用人乳头瘤病毒高保守序列区共有引物两步温控ＰＣＲ法检测ＨＰＶ，并应用限制性内切酶进行酶切，确定型别，该法省时特异，简便易行，便于基层推广应用，对宫颈癌的普查筛检和回顾性研究将十分有益。     

应用PCR方法检测精液人类巨细胞病毒与优生优育关系的研究

介绍一种应用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）对人类精液进行人类巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）检测的方法。结果表明：在提高人口素质方面，精液标本的ＨＣＭＶ检测是防止胎儿宫内感染进而导致先天畸形最有效的方法。它可鉴定男方在要求生育时是否带有ＨＣＭＶ。此技术具有特异性强、快速、简便等优点，如果将其推广应用到围产保健及监测妊娠前的ＨＣＭＶ感染、婚前检查、精子库供精者的筛选，将对优生优育起巨大的推动作用。     

套式聚合酶链反应检测巨细胞病毒的初步研究

目的建立套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）加限制性酶切分析方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）。方法在ＨＣＭＶ直接早期蛋白ＥｃｏＲＩＪＤＮＡ片段内，自行设计两对引物，建立套式ＰＣＲ检测ＨＣＭＶＤＮＡ，同时结合病毒分离检测临床标本。结果２３例新生儿肝炎综合征患儿中，１０例病毒分离及套式ＰＣＲ均阳性；１例病毒分离阴性，但套式ＰＣＲ阳性。对５８例妊娠早期孕妇血标本进行检测，套式ＰＣＲ阳性率为９％，病毒分离阳性率则为７％。结论套式ＰＣＲ加限制性酶切分析是一种临床检测ＨＣＭＶ的快速有效手段，值得临床推广。     

献血员巨细胞病毒DNA的检测及意义

目的 检测献血员血液中巨细胞病毒DNA，了解献血员感染巨细胞病毒的情况，防止由于输血而发生医源性感染。方法 采用快速，敏感，特异的聚合酶链反应（PCR）电泳法及PCR-ELISA法对212例献血员进行人类巨细胞病毒9HCMV）DNA的检测。结果 18例HCMV-DNA阳性，占被检对象的8.49%(18/212)；同时显示HCMV-DNA阳性率与献血员性别，年龄段差异无显著性相关。结论 由于献血者中存在着HCMV感染的情况，故在临床治疗用血时，应对献血者进行HCMV的检测，以保证受血者生命安全。     

套式PCR快速诊断新生儿巨细胞病毒感染

套式ＰＣＲ用于检测新生儿及随访ＣＩＤ患儿白细胞及尿中ＨＣＭＶＤＮＡ。两对引物序列取自ＨＣＭＶＩＥＡ基因区，第一对引物扩增７２１ｂｐ片段，第二对引物扩增１６７ｂｐ片段，后者穴居于前者之中，结果３３例可疑新生患儿检出ＣＭＶ感染２１例，７例随访患儿中４例尿或血中仍有ＣＭＶＤＮＡ存在。ＰＣＲ与病毒分离相比，既快速又敏感，尿标本用于ＰＣＲ检测ＣＭＶＤＮＡ较之血本具有检出率高，标本采取及处理均简便的优点。     

骨髓移植患者血及尿中巨细胞病毒感染核酸标志物的检测

目的 为骨髓移植患者寻找较好的诊断和治疗巨细胞病毒（ＣＭＶ）感染的分子生物学依据。方法 用聚合链反应（ＰＣＲ）方法测尿中ＣＭＶ－ＤＮＡ,逆转录（ＲＴ）－ＰＣＲ法测血中ＣＭＶ－即刻早期抗原（ＩＥ）ｍＲＮＡ。结果 在被测的２７例患者１０３份标本中,发现１０例ＣＭＶ感染者的尿ＣＭＶ－ＤＮＡ及血ＩＥ ｍＲＮＡ几乎同时阳转。在连续使用抗病毒药甘昔洛瓦（ＤＨＰＧ）治疗的６例患者中,ＩＥ ｍＲＮＡ约一周左右阴转     

PCR和巢式PCR直接检测血清中HIV核酸序列

采用ＰＣＲ和巢式ＰＣＲ方法对５３例ＨＩＶ抗体阳性和阴性标本进行了检测，以扩增ＨＩＶ特异性ＤＮＡ序列，结果美国ＡｂｂｏｔｔＨＩＶ阳性血清２份，新加坡阳性血清２份，国内阳性血清２份及ＨＩＶ－１病毒培养物１份，两套ＰＣＲ扩增反应物均为阳性，对其中一套ＰＣＲ扩增的ｇａｇ基因序列进行巢式ＰＣＲ也为阳性。采自西南边境地区的２３份ＥＬＩＳＡ和ＷＢ阳性血清，各种ＰＣＲ反应均为阳性；１１份ＥＬＩＳＡ可疑阳性、ＷＢ阴性标本中，有两例血清呈ＰＣＲ阳性，探针杂交亦为阳性。而１２例ＳＩＶ、ＳＲＶ及猴血清标本ＰＣＲ反应均为阴性。上述结果表明，采用ＰＣＲ方法检测血清中ＨＩＶ核酸序列是一种很有前途的ＨＩＶ感染诊断方法。     

肾移植术后受者人巨细胞病毒巢式PCR检测

目的探讨巢式PCR检测肾移植术后受者人巨细胞病毒（HCMV）DNA的方法，并与ELISA法进行比较。方法针对HCMVAD169株IEA基因设计两对巢式PCR引物，对50例肾移植术后受体血、尿标本进行HCMVDNA检测。分离血清作ELISA检测IgG、IgM。结果血液巢式PCR阳性率56％，尿液阳性率46％；ELISA法阳性率：IgG82％，IgM28％，IgG＋IgM28％。两种方法的阳性率进行统计学分析，P〈0．05，存在统计学差异。结论巢式PCR是一种敏感、快速诊断HCMV感染的方法，灵敏度及特异性均高于传统ELISA法，并能弥补ELISA的假阴性。不仅为临床HCMV疾病的诊断与治疗，同时也为选择普遍性预防抑或症状发生前的预先治疗提供可靠的实验室依据。     

巨细胞病毒即刻早期基因mRNA检测方法的建立

目的建立快速简便的逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）即刻早期（ＩＥ）基因ｍＲＮＡ。方法设计合成跨越ＨＣＭＶＩＥ基因内含子区的一对引物，分别用ＲＴＰＣＲ和ＰＣＲ技术扩增ＨＣＭＶｍＲＮＡ和ＤＮＡ，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定阳性产物。结果ＨＣＭＶＩＥ基因ｍＲＮＡ表达在感染后６小时即可出现，并持续到感染后至少９６小时，ＲＴＰＣＲ检测的最低敏感性为１００ｆｇ总ＲＮＡ，其他病毒和细胞ＲＮＡ不能被扩增。结论ＲＴＰＣＲ技术检测ＨＣＭＶｍＲＮＡ敏感、特异，有望应用于临床作为ＨＣＭＶ活动性感染的早期诊断方法     

自制人巨细胞病毒核酸室内质控物的重复性观察

摘要：目的：自制人巨细胞病毒（CMV）核酸室内质控物,并观察其重复性。 方法：收集新鲜CMV核酸阳性尿液标本制备质控物,加0.01 mg/mL 牛血清清蛋白（BSA）作为稳定剂,比较－80 ℃保存1年、－80 ℃保存6个月后－20 ℃保存的质控物荧光定量PCR检测结果。 结果：－80 ℃保存1年,不加稳定剂组12个月质控结果差异无统计学意义（F=1.202,P>0.05）,加BSA组与不加稳定剂组质控结果差异无统计学意义（F=0.205,P>0.05）,不加稳定剂组CMV拷贝数平均变异系数CV）为7.18%（范围5.30%~8.22%）,加BSA组CMV拷贝数平均CV为7.75%（范围4.08%~9.02%）。－80 ℃保存6个月后－20 ℃保存,与-80 ℃保存1年相比,质控结果差异无统计学意义（未加BSA：F=0.041;加BSA：F=0.462,P>0.05）,不加稳定剂组CMV拷贝数平均CV为7.19%（范围4.06%~9.26%）,加BSA组CMV拷贝数平均CV为8.05%（范围4.07%~10.0%）。 结论：自制CMV核酸质控物重复性较好,可用于室内质控;不建议用BSA作质控物稳定剂。     

荧光定量聚合酶链反应检测移植受者的巨细胞病毒DNA载量

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测移植后受者的巨细胞病毒感染情况。方法应用定性PCR检测59例骨髓移植受者和9例肝移植受者的150份外周血标本中的巨细胞病毒DNA,比较外周血白细胞和血浆的检出差异;应用实时荧光定量PCR检测上述150份血浆样本和54份对照血浆中巨细胞病毒DNA载量。结果以实时荧光定量PCR为参照,定性PCR检测白细胞的敏感度和特异度分别为62·5%和95·5%;检测血浆的敏感度和特异度分别为57·5%和99·1%。所检测的150份血浆样本中,定量PCR阳性率为26·7%,阳性者其病毒拷贝数介于5·065×102~3·570×105/ml之间;对照组仅1例阳性,且拷贝数小于103/ml。临床调查显示病毒拷贝数大于5×103的患者具有较高的机会发展为巨细胞病毒病。结论实时荧光定量PCR是一个快速、敏感、特异的,可用于监测移植后患者巨细胞病毒感染的方法,帮助临床及早治疗,缩短治疗时间。