HPV16型E5基因重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-E5的构建与鉴定

目的构建HPV16型E5基因重组逆转录病毒表达载体。方法根据HPV16型E5基因已知序列,用PCR方法扩增E5片段,利用逆转录病毒载体pLEGFP-N1构建重组质粒pLEGFP-E5。酶切电泳验证重组质粒pLEGFP-E5后,利用脂质体将重组质粒pLEGFP-E5转染入包装细胞PA317。收集PA317病毒上清转染NIH3T3细胞。结果 PCR结果显示扩增片断大小约252bp,与预期相同。重组质粒酶切后显示其大小约7300bp。pLEGFP-E5成功转染检测细胞。结论重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-E5基因构建成功,能有效感染靶细胞。     

Stathmin特异性siRNA表达质粒抑制stathmin的表达

目的:构建微管解聚蛋白stathmin基因的特异性siRNA质粒表达载体,以便研究stathmin在鼻咽癌中的生物学作用。方法:合成stathmin特异性DNA片段,退火形成的双链DNA片段克隆于质粒表达载体pGenesil-1.3;载体经扩增后,进行酶切和测序鉴定;采用QIAGEN公司脂质体(effectenetransfectionreagent)将鉴定后的重组质粒转入鼻咽癌CNE2细胞;RT-PCR与Westernblot检测stathmin基因表达。结果:酶切和测序分析表明,插入siRNA质粒表达载体中的DNA片段,其碱基序列和插入方向正确。表达分析证实特异性siRNA质粒表达载体能有效抑制鼻咽癌CNE2细胞中stathmin的表达。结论:构建的siRNA质粒表达载体对stathmin的表达有很好的抑制作用。     

1型糖尿病防治新方法:构建COX-2siRNA表达载体阻断COX-2基因表达

目的:构建具有特异性阻断环加氧酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)基因功能的siRNA表达系统,为1型糖尿病的防治提供新的方法。方法:根据Genbank提供的mRNA序列,应用siRNA设计软件设计特异性的短链寡核苷酸,化学合成后经退火形成双链siRNA片段,克隆到pSilencerTM1.0-U6siRNA载体中,用酶切方法和测序法对重组体进行鉴定;最后将构建的COX-2siRNA表达载体转染胰岛细胞,观察其对细胞COX-2基因表达的影响。结果:酶切和序列测定表明,成功构建了COX-2siRNA表达载体,COX-2siRNA能够抑制细胞内COX-2的表达。结论:本研究构建的COX-2siRNA表达载体,具有阻断COX-2基因表达的功能,为胰岛β细胞功能保护的研究和1型糖尿病的早期防治提供了有效的方法和手段。     

靶向转酮醇酶样基因1 siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建针对转酮醇酶样基因1(TKTL1)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体并检测其沉默效应。方法采用人U6 SnRNA启动子,分别把被9 bp序列间隔的19 bp长短的TKTL1靶序列的反向重复序列,置于pEGFP-C1-U6质粒载体中,构建成TKTL1短发夹环RNA,产生重组质粒pEGFP-C1-U6/TKTL1,分别用PstⅠ和SalⅠ酶切鉴定及测序分析,并将重组质粒转染人结肠癌细胞株LoVo,通过RT-PCR检测TKTL1基因表达水平的变化。结果酶切鉴定与DNA测序分析证明,TKTL1基因的siRNA表达载体构建正确,RT-PCR结果表明转染重组质粒的LoVo细胞TKTL1基因的表达水平明显降低。结论成功构建了针对TKTL1基因的siRNA表达载体,转染LoVo细胞后可显著抑制TKTL1基因表达。     

SARS-CoVS蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的：克隆表达SARS-CoVS蛋白，构建SARS全长基因疫苗。方法：从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoV S1和S2蛋白的编码序列，再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1，构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染Vero E6细胞，用Western检测S蛋白的表达。结果：PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段，两片段插入pVAX1构建重组表达载体后，经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染Vero E6细胞，收集细胞总蛋白，Western检测获得特异蛋白带。结论：成功克隆并表达了SARS-CoVs蛋白，为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

组织因子途径抑制物2基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建人组织因子途径抑制物2(tissuefactorpathwayinhibitor2,TFPI-2)基因的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2,并对其进行酶切鉴定。方法:实验于2006-09/12在安徽省立医院中心实验室完成。实验方法:①从人胎盘组织中提取总RNA,反转录合成cDNA,以特异性引物扩增TFPI-2基因全长mRNA。②扩增产物回收纯化后用限制性内切酶酶切,与经同样处理的载体pEGFP-C1进行连接反应,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α。③碱变性法提取质粒进行限制性内切酶酶切分析,并进行DNA序列测定。结果:①成功克隆了708bp的TFPI-2基因片段。②构建了人TFPI-2基因的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2,经限制性内切酶酶切,电泳分析后得到了大小分别为708bp的目的基因片段和4.6kb的载体片段,测序结果与TFPI-2mRNA的cDNA序列吻合。结论:通过基因重组技术,构建了稳定表达TFPI-2的人TFPI-2的真核表达载体pEGFP-C1-TFPI-2。     

构建和鉴定神经生长因子-β腺相关病毒穿梭质粒

目的 构建能够表达神经生长因子-β重组腺相关病毒穿梭质粒,为进一步包装腺相关病毒奠定基础.方法 利用高保真酶分别扩增pAAV-MCS的结构元件和pGenesil-1.1的功能元件,连人T-easy载体,限制性核酸内切酶酶切并回收目的片段,T4酶连接,得到含U6和CMV双启动子的重组腺相关病毒穿梭质粒pAAV-U6/CMV-EGFP;培养人MIApaca-2细胞,提取总RNA,进行RT-PCR得到人ngf-β基因,插入T-easy载体,得到T-easy-ngf-β;将ngf-β插入pAAV-U6/CMV-EGFP,构建ngf-β重组腺相关病毒穿梭质粒.结果酶切pAAV-U6/CMV-EGFP可见4250 bp、800 bp条带,质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白表达;质粒T-easy-ngf-β酶切可见3 kb、736 bp条带,测序显示基因序列正确;酶切pAAV-U6/CMV-ngf-β可见4300 bp、736 bp条带;质粒pAAV-U6/CMV-ngf-β测序显示载体中的基因序列正确.结论 成功构建ngf-β重组腺相关病毒穿梭质粒,包装表达神经生长因子的腺相关病毒,为进一步深入研究脊髓损伤的修复提供了实验基础.     

穿膜肽-TDRGl重组蛋白原核表达载体的构建

构建穿膜肽TAT与TDRG1融合蛋白的原核表达载体。以p YD5-TDRG1载体为模板,设计N端和C端含有flag序列和不同酶切位点的引物,利用PCR技术扩增TDRG1基因片段。同时利用内切酶对已构建好的载体pET28aTAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT进行酶切处理,再把扩增产物插入已处理好的线性载体pET28a(含有TAT)中,构建成重组质粒pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT,热激转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选,送测序比对验证。PCR扩增出TDRG1基因片段,目的插入片段长约344bp,产物行限制性内切酶酶切后连接到预先酶切处理好的线性载体pET28a上,并成功转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选后挑选阳性克隆抽质粒送测序,测序比对序列完全一致。成功构建了原核表达载体pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT。     

维生素D受体野生型及FokⅠ突变型真核表达载体的构建

目的:克隆人维生素D受体(VDR)全长,构建VDR野生型及FokⅠ突变型重组真核表达质粒.方法:提取总RNA,RT-PCR方法扩增将产物用EcoRⅠ和Hind Ⅲ进行双酶切后与pcDNA3.1(-) B-myc/his载体连接形成重组载体;对野生型VDR基因行定点诱变,构建突变型FokⅠ VDR质粒.结果:重组质粒被酶切为两条带,一条为1 300 bp(代表人VDR),一条为5 500 bp(空载体);片段大小与理论值相符.测序结果与Genbank序列完全相同.结论:成功克隆了人VDR基因全长并成功构建了人野生型和突变型FokⅠVDR重组真核表达载体pcDNA3.1(-)B-myc/his hVDR,为进一步研究VDR基因变异与相关肿瘤易感性的分子机制奠定了实验基础.     

靶向survivin的siRNA表达载体的构建及生物活性鉴定

目的 构建靶向survivin的siRNA表达载体。方法 设计合成靶向Survivin的siRNA相应DNA模板单链,将其克隆入空质粒pRNAT-U6．1／Neo,模板链两端分别设计两个不同的酶切位点,退火形成siRNA载体插入片段。用限制性酶切将空载体线性化,T4DNA连接酶将siRNA片段插入空载体中,对该重组表达载体进行鉴定,获得RNA干扰质粒载体pRNAT-U6．1／Neo-sur-vivin。脂质体法将pRNAT-U6．1／Neo-survivin导入膀胱癌T24细胞株,实时定量PCR法检测对T24细胞survivin基因表达的抑制情况。结果 PCR、酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。重组载体能干扰T24细胞survivin基因的表达,并具有新霉素抗性。能够用G-418筛选稳定转化的细胞株。结论 成功构建了靶向survivin基因表达的RNA干扰质粒载体pR-NAT-U6．1／Neo-survivin。并转染膀胱癌细胞株,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。