新型超顺磁性氧化铁在干细胞活体示踪中的应用研究

目的：研究超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxide,SP10）标记干细胞的效率及其在磁共振活体示踪中的应用价值。方法：以3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTS）修饰Fe2O3配制成SP10,用SP10转染标记骨髓间充质干细胞（MSCs）,对标记后的MSCs行普鲁士蓝染色鉴定、MTT测试细胞相对数量。最后将标记后的MSCs移植入大鼠脑内,磁共振（MRI）扫描示踪显示。结果：普鲁士蓝染色可直接显示SP10高效率标记MSCs,MTT测试表明SP10标记对MSCs增殖数量及其活力无明显影响,MRI检查发现脑内移植的SP10标记MSCs在T2上呈明显的低信号。结论：APTS修饰Fe2O3配制而成的新型SP10对细胞无明显毒性,没有多聚赖氨酸（PLL）等转染剂仍可直接高效率标记MSCs,MRI活体显影示踪效果良好。     

超顺磁性氧化铁纳米粒子标记成肌细胞及其对细胞活性的影响

目的 研究超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)标记成肌细胞方法及其对成肌细胞活性的影响.方法 常规方法进行成肌细胞培养,应用不同浓度的SPIO标记成肌细胞,Prussian blue染色检测标记率,JC-1及MTT等方法检测SPIO标记对成肌细胞毒性及细胞活力的影响.结果 普鲁士蓝染色证实了每个标记细胞胞质内含有多少不等的蓝染铁颗粒,SPIO标记有效率为100%.低浓度的SPIO对成肌细胞的活性无明显影响,当SPIO浓度达89.6 μg/ml时影响成肌细胞的活性.结论 SPIO标记成肌细胞简单、高效,低浓度时对细胞的活力无明显影响,可用于磁共振对标记细胞进行活体内外无创动态示踪研究.     

多聚赖氨酸修饰SPIO标记骨髓间充质干细胞体外磁共振成像研究

目的利用多聚赖氨酸（PLL）修饰的超顺磁性氧化铁粒子（SPIO）,即超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIO-PLL）标记大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,探讨其对BMSCs生物学特性的影响以及3．OT磁共振成像（Mm）上T2信号的改变。方法将传代培养BMSCs与不同铁浓度的SPIO—PLL溶液共同孵育24h后行普鲁士蓝染色。观察BMSCs对不同浓度SPIO-PLL的摄取。确定SPIO—PLL标记干细胞的最佳浓度。同时采用四唑盐比色法分析不同浓度SPIO—PLL溶液对大鼠BMSCs生长活性的影响。取最适浓度的SPIO-PLL标记BMSCs．经3．0TMRI,观察T2WI信号的改变。结果SPIO．PLL标记BMSCs生物活性没有明显影响,与未标记细胞的生长活性比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;同时铁浓度不同（10、40、80μgFe／mL）的SPIO-PLL溶液标记细胞成像可使T2WI图像信号降低,3种浓度的信号变化率比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论SPIO—PLL可以标记BMSCs,且对BMSCs的生物学活性没有影响,MRIT2WI序列可敏感显像磁性标记的干细胞．有望为MRI和光学成像活体示踪BMSCs提供技术基础。     

超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞移植治疗兔急性胰腺炎的磁共振活体示踪

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）是由各种原因引起胰酶被激活,导致胰腺组织自身消化、水肿、出血和坏死的炎症反应,常继发感染性腹膜炎、休克、全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征等严重并发症,预后极差.目前的治疗措施主要是对症治疗、支持治疗、预防胰腺感染和坏死,疗效仍不佳.近年来,骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）移植治疗急性胰腺炎的实验研究认为MSCs可分化为有功能的胰腺干细胞,对损伤的胰腺进行修复,为治疗重症SAP提供了一种薪的思路和手段,而细胞移植后在活体内示踪成为随之而来的研究难点.近年来,随着超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒标记细胞技术的成熟,磁共振成像（MRI）活体示踪SPIO标记细胞成为新的研究热点[3].本实验拟采用SHO标记兔MSCs并移植入SAP模型兔行MRI扫描,探讨干细胞移植治疗SAP过程中,MRI活体示踪移植干细胞的可行性.     

超顺磁性氧化铁作为细胞标记试剂的可行性研究

目的:评价目前临床使用的磁共振对比增强剂超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)进行骨髓间充质干细胞(MSCs)标记的安全性、有效性.方法:从中华小型猪髂骨处抽取骨髓,体外培养扩增MSCs.将SPIO和MSCs共同孵育培养36 h.普鲁士蓝染色评价细胞的标记效率;通过MTT比色实验评价SPIO对细胞生长能力的影响;台盼蓝染色检测标记后细胞的活性;使用Costar Transwell方法评价铁离子对细胞迁移能力的影响;用细胞分化诱导液培养标记后的细胞评价其向成脂肪细胞和成骨细胞的分化能力.结果:①MSCs经SPIO标记后普鲁士蓝染色阳性率在95%以上,电镜切片观察可见高密度铁颗粒位于细胞浆内.②MSCs经SPIO标记后,MTT比色实验发现随着培养液中SPIO浓度的增加细胞增殖能力没有明显改变;台盼蓝染色显示98%的细胞保持活性;仍可保持原有的细胞形态,可继续培养、传代;细胞迁移试验发现MSCs对SDF-1和VEGF诱导的迁移能力没有明显的减弱;细胞仍可向成脂肪细胞和成骨细胞分化.结论:SPIO可以安全、有效地标记MSCs.     

超顺磁性氧化铁作为细胞标记试剂的可行性研究

目的:评价目前临床使用的磁共振对比增强剂超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO)进行骨髓间充质干细胞(MSCs)标记的安全性、有效性.方法:从中华小型猪髂骨处抽取骨髓,体外培养扩增MSCs.将SPIO和MSCs共同孵育培养36 h.普鲁士蓝染色评价细胞的标记效率;通过MTT比色实验评价SPIO对细胞生长能力的影响;台盼蓝染色检测标记后细胞的活性;使用Costar Transwell方法评价铁离子对细胞迁移能力的影响;用细胞分化诱导液培养标记后的细胞评价其向成脂肪细胞和成骨细胞的分化能力.结果:①MSCs经SPIO标记后普鲁士蓝染色阳性率在95%以上,电镜切片观察可见高密度铁颗粒位于细胞浆内.②MSCs经SPIO标记后,MTT比色实验发现随着培养液中SPIO浓度的增加细胞增殖能力没有明显改变;台盼蓝染色显示98%的细胞保持活性;仍可保持原有的细胞形态,可继续培养、传代;细胞迁移试验发现MSCs对SDF-1和VEGF诱导的迁移能力没有明显的减弱;细胞仍可向成脂肪细胞和成骨细胞分化.结论:SPIO可以安全、有效地标记MSCs.     

磁标记神经干细胞移植治疗脑梗死大鼠MRI示踪及形态学研究

目的:利用磁共振成像(MRI)技术追踪移植的超顺磁性氧化铁标记神经干细胞(NSCs),无创、动态地监测NSCs在活体脑内的存活和迁移。方法:大鼠32只制备右侧大脑中动脉瘤局灶脑缺血/再灌注(MCAO)模型,BrdU标记NSCs,立体定向磁标记NSCs脑内移植,MRI下活体动态追踪脑内移植的磁标记NSCs,实验动物于磁标记NSCs脑内移植第1、5和14天达到观察时相点后,取脑组织做石蜡切片及HE染色。结果:24只大鼠出现明显的神经功能缺失症状。MRI追踪示:磁标记NSCs脑内移植1d后,针道和侧脑室部位有低信号物质存在;磁标记NSCs脑内移植5d后,低信号物质沿胼胝体腹侧迁移;磁标记NSCs脑内移植2周,右侧(病灶侧)侧脑室部位低信号物质向缺血区迁移,其前端已达到缺血区的边缘。脑组织病理学检测:BrdU阳性磁标记NSCs沿胼胝体腹侧向缺血/再灌注区迁移。随着脑内磁标记移植时间的推移,侧脑室区的NSCs向缺血/再灌注区迁移数量逐渐增加。结论:超顺磁性氧化铁颗粒和BrdU双标记的神经干细胞移植至脑梗死大鼠脑内后可迁移到病灶区;MRI成像能够在活体内连续示踪观察神经干细胞的迁移及分布情况。     

大鼠神经干细胞和雪旺细胞体外共培养生长特性

目的：探讨雪旺细胞（SC）对神经干细胞（NSC）的生物作用，为临床移植神经细胞提供依据和方法。方法：将神经干细胞分别在有雪旺细胞骨架、分泌物及活雪旺细胞饲养层的不同环境中培养，同时设立各自对照组，观察神经干细胞迁徙、贴壁能力、分化、细胞代谢、轴突生长、免疫组化神经丝染色情况。结果：与雪旺细胞有关的实验组神经干细胞大量分化为具有细长突起的细胞，神经丝（NF）标记阳性细胞多，突起长（特别是经胎牛血清培养过的雪旺细胞实验组），细胞贴壁力强，细胞生长代谢旺盛，突起粗壮并且生长速度快。结论：雪旺细胞能促进神经干细胞分化，并促进其生长。     

超声微泡增效骨髓干细胞移植效率的实验研究

目的在动物水平研究超声联合微泡增效骨髓干细胞(BMSCs)心肌移植的作用,为临床上提高心肌梗死后BMSCs移植效率提供一种新的思路。方法12只中国家猪分别体外分离纯化BMSCs,超顺磁性氧化铁颗粒标记;介入法建立急性心肌梗死模型,成功后14d经冠状动脉注入自体BMSCs;实验组先注入微泡后再注入BMSCs,同时行超声辐射。术后行磁共振检查;心肌做病理切光镜、透射电镜观察。结果①两组在心肌梗死区和梗死周边区磁共振上均见SPIO标记的BMSCs形成的低密度区;②实验组较对照组普鲁士蓝染色阳性细胞明显增多(P<0.01);③两组心肌超微结构无差异,但B1组见血管内皮间隙增宽。结论超声辐射微泡可增加自体BMSCs心脏的移植效率。     

PKH26标记和分子荧光活体成像技术在软骨组织工程研究中的应用

目的 探讨PKH26荧光标记和分子荧光活体成像技术在软骨组织工程中的应用。方法 用PKH26荧光标记犬软骨细胞,种植到多孔支架上,体外培养1周后异位移植到裸鼠背部,4周后用分子荧光活体成像系统示踪,并与X线检查结果对比。然后处死裸鼠取材,与免疫组织化学染色和免疫荧光观察结果对比。结果 4周分子荧光活体成像系统观察裸鼠背部标本处呈圆形强荧光,表明组织工程软骨在裸鼠体内生长良好。组织学切片结果显示番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色和甲苯胺蓝染色阳性,荧光显微镜下观察结果显示组织工程化软骨中细胞均呈红色荧光,Ⅱ型胶原免疫荧光染色呈绿色荧光,叠加后呈黄色荧光。结论 PKH26荧光标记和分子荧光活体成像2种方法结合应用于软骨组织工程中,能够较理想地且大体无创伤性评估组织工程化软骨组织在体内的生长情况。     

肿瘤靶向超顺磁氧化铁纳米粒的小鼠急性毒性与抗吞噬性评价

目的:考察叶酸-羧甲基壳聚糖-超顺磁氧化铁纳米粒(FA-OCMCS-SPIO-NPs)和羧甲基壳聚糖-超顺磁氧化铁纳米粒(OCMCS-SPIO-NPs)2种造影剂的急性毒性及其抗肝、脾吞噬的能力。方法:尾静脉给予小鼠2种造影剂低、中、高剂量(278、347.5、434.5mg(Fe)·kg-1)后观察14d内的一般情况,计算半数致死量(LD50),并进行各组织病理学检查;以葡聚糖-超顺磁氧化铁纳米粒(dextran-SPIO-NPs)为阳性对照,普鲁士蓝染色法观察2种造影剂经小鼠尾静脉注射相似剂量后抗肝、脾吞噬的能力。结果:2种造影剂的LD50>434.5mg(Fe)·kg-1,所有小鼠均未出现明显的毒性反应和组织病理学改变;普鲁士蓝染色切片结果显示,dextran-SPIO-NPs无法逃避肝、脾中巨噬细胞的吞噬,而FA-OCMCS-SPIO-NPs能完全逃避吞噬,OCMCS-SPIO-NPs大部分逃避了吞噬。结论:2种造影剂的安全性高,且能全身分布,具有潜在的肿瘤靶向载体价值。     

磁标记骨髓间充质干细胞的实验研究

目的探讨不同时间及浓度超顺磁性氧化铁(SPIO)标记大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)标记效率、标记后细胞活力等情况,寻找最佳标记浓度和时间。方法配制含不同浓度SPIO培养基,加入MSCs孵育,于标记后不同时间行铁染色、细胞活力、铁含量测定。结果细胞活力检测显示标记1d和3d时,0μg/ml组与25μg/ml组,0μg/ml组与50μg/ml组,25μg/ml组与50μg/ml组的细胞拒染率差异无统计学意义(P>0.05)。铁含量测定显示标记浓度在50μg/ml,标记时间3d时铁含量最高。结论50μg/ml浓度,标记3d不仅标记效率高对细胞活力无影响,而且细胞内铁含量最多,为最佳标记浓度和时间。     

Magnetoelectroporation: improved labeling of neural stem cells and leukocytes for cellular magnetic resonance imaging using a single FDA-approved agent

Cellular magnetic resonance imaging (MRI) relies on the use of intracellular contrast agents, primarily iron oxide compounds. Several techniques have been used to efficiently shuttle iron oxides into nonphagocytic cells, but all methods used until now require a prolonged incubation of cells. We hypothesized that instant magnetic labeling of cells could be achieved using electroporation. Neural stem cells (NSCs) and leukocytes from spleen and lymph nodes were suspended in a ferumoxide labeling solution, loaded into cuvettes, and subjected to electromechanical permeabilization using electroporation. Magnetically labeled cells were assayed for labeling efficiency, as well as for potential toxicity or altered function. To confirm the method's applicability to detect cells, MRI experiments were performed at 11.7 T. Magnetoelectroporation of NSCs, as demonstrated by Prussian blue staining, anti-dextran immunostaining, and a quantitative iron uptake assay, proved to be an efficient intracellular magnetic labeling method. Leukocytes including lymphocytes, which are notoriously difficult to label because of their membrane properties and small cytoplasmic volume, also demonstrated a pronounced uptake of ferumoxide. MRI experiments showed that labeled NSCs could be visualized as single cells and cell clusters in gelatin phantoms, and as proliferating cell masses in mouse brain. We have developed a convenient technique for instant magnetic labeling of cells. Because magnetoelectroporation allows the use of ferumoxides approved by the US Food and Drug Administration without additional agents, it has excellent potential for clinical translation.     

Study of apoptosis in labeled mesenchymal stem cells with superparamagnetic iron oxide using neutral comet assay.

Mesenchymal stem cells (MSC) have special characteristics such as migration into the damaged tissues and undergoing differentiation. One of the ways for tracking MSC in the tissue is labeling cells by contrast agents such as superparamagnetic iron oxide (SPIO) and detection by magnetic resonance imaging (MRI). To study adverse effects of SPIO on labeled cells, the formation of apoptosis in labeled cells was investigated using the comet assay. MSC were grown in vitro and labeled with various doses of SPIO for various time intervals. Incorporation of iron in cells were verified both microscopically and atomic absorption spectrophotometer. Labeled cells in a sandwich of low and normal melting agarose on slides were subjected to electrophoresis. The slides were stained with ethidium bromide and analysed under a fluorescent microscope. Results show that SPIO at various doses (50-250 microg/mL) in conjunction with protamine sulphate, used as a cationic transfection agent; and treatment times of 24-72 h did not statistically affect the frequency of apoptosis in labeled MSC (p>0.05). These findings therefore, may be indicative that labeling stem cells using these agents should facilitate the translation of this method to clinical trials for evaluation of trafficking of infused or transplanted cells by MRI.     

Nanoimmunoliposome delivery of superparamagnetic iron oxide markedly enhances targeting and uptake in human cancer cells in vitro and in vivo

To circumvent the problem of reduction of the supermagnetic properties of superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles after chemical modification to conjugate targeting molecules, we have adapted a tumor-targeting nanoimmunoliposome platform technology (scL) to encapsulate and deliver SPIO (scL-SPIO) in vitro and in vivo without chemical modification. Scanning probe microscopy, confocal microscopy, and Prussian blue staining were used to analyze the scL-SPIO and assess intracellular uptake and distribution of SPIO in vitro. In vivo targeting and tumor-specific uptake of scL-SPIO was examined using fluorescent-labeled SPIO. We demonstrated that SPIO encapsulation in the scL complex results in an approximately 11-fold increase in SPIO uptake in human cancer cells in vitro, with distribution to cytoplasm and nucleus. Moreover, the scL nanocomplex specifically and efficiently delivered SPIO into tumor cells after systemic administration, demonstrating the potential of this approach to enhance local tumor concentration and the utility of SPIO for clinical applications.     

羟基喜树碱缓释片瘤内植入对C6脑胶质瘤模型大鼠的肿瘤抑制作用研究

目的:考察羟基喜树碱(HCPT)缓释片瘤内植入对C6脑胶质瘤模型大鼠的肿瘤抑制作用。方法:通过将C6脑胶质瘤细胞悬浮液接种于大鼠脑内,10d后建立C6脑胶质瘤模型,取模型大鼠分为模型对照组、空白对照组(植入不含HCPT的缓释片)、静脉注射治疗组(HCPT注射液,2mg·kg-1)、瘤内注射治疗组(HCPT注射液,约含HCPT2.4mg)、瘤内植入治疗组(HCPT缓释片,约含HCPT2.4mg),每组10只,给予相应药物,比较平均存活期,并用核磁共振成像(MRI)观测大鼠脑内肿瘤生长情况。结果:与模型对照组比较,除瘤内植入治疗组大鼠平均存活期明显延长(P<0.001)外,其余各组均无明显差异;MRI观测结果显示瘤内植入治疗组大鼠治疗后15d内肿瘤体积没有明显增大,且第15天略有缩小,其余各组肿瘤体积均增大。结论:HCPT缓释片瘤内植入明显延长了模型大鼠的平均存活期,但其本身对于脑组织的神经毒性作用还有待于考察。     

临床药师对1例肾病综合征患儿的用药分析

目的:总结肾病综合征患儿治疗的共性及个性,以进行循证加辩证的药学个体化干预。方法:通过分析1例典型的肾病综合征患儿的病情,从患儿的感染部位、抗感染指征、病情轻重、耐药监测等方面分析患儿的抗感染方案并提出建议;依循最新循证指南,从患儿高血压的原因、药物选择、治疗风险与收益等方面分析患儿高血压的治疗并提出建议;结合肾病综合征患儿的病理生理共性——低白蛋白血症,从药学专业角度分析低白蛋白血症对于药物治疗的影响并总结出监测角度。结果:患儿的抗感染方案仍可以改善;高血压治疗方案基本合理,注意治疗收益与风险的权衡;低白蛋白血症对肾病综合征患儿的药物治疗有重要的影响。结论:药师结合肾病综合征患儿的特殊病理生理特点,建立肾病综合征抗感染、降压的药物治疗思维,能更好地指导个体化用药。