SD大鼠胰腺导管上皮细胞培养技术的研究

目的 分离纯化SD大鼠胰腺导管上皮细胞，为将其转分化为胰岛细胞提供细胞来源。方法 用酶消化法培养SD大鼠胰腺导管上皮细胞，观察细胞增殖动态，用CK-19进行免疫组化鉴定。结果 胰腺导管上皮细胞可在体外有效扩增，有效去除成纤维细胞是扩增的关键。结论 低血清培养和反复贴壁法可获得较纯的胰腺导管上皮细胞。     

胰腺干细胞移植研究进展

糖尿病是严重威胁人类健康的疾病，患者出现胰岛β细胞功能障碍，胰岛素抵抗或分泌减少造成糖代谢紊乱。并继发眼、肾、神经、心血管等脏器损害，估计到2025年患者将超过3亿。细胞替代疗法（即补充β细胞的功能，如胰岛移植）是糖尿病治疗的重要方法，它较目前临床常用的胰岛素治疗具有一定的优势，但也存在难以克服的问题：①供体数量严重不足。需12000个胰岛细胞／kg体质量，即2-4个供体才能满足一个受体的需要；②免疫排斥问题，异体取得的胰岛都存在免疫排斥，而且许多免疫抑制剂本身（如糖皮质激素等）也有致糖尿病作用。     

体外诱导干细胞分化为胰腺β细胞的途径及研究近况

查阅了近年来关于研究胰岛素分泌细胞(ISC)来源的相关中、外文献,提示干细胞作为主要的ISC来源治疗糖尿病已成为可能,综述了以干细胞为主要来源的几种诱导分化为胰腺β细胞的途径及其研究近况。     

成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离?培养及鉴定

目的:建立成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养及鉴定的方法.方法:V型胶原酶溶液灌注消化成年大鼠胰腺组织,并经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织,培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,而后加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)继续培养,7天可形成单层细胞,用0.25%胰酶-EDTA消化并传代培养.取第2代细胞利用免疫荧光染色和RT-PCR方法检测CK19、Pdx-1、Nestin、insulin及glucagon的表达.结果:经胶原酶灌注消化胰腺导管上皮,再经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织,可使胰腺导管细胞得到较好的纯化.免疫荧光结果示:胰腺导管细胞CK19、Pdx-1和Nestin染色呈阳性,阳性细胞率分别为(88.6±6.2)%、(84.6±8.6)%和(79.3±10.5)%,而insulin及glucagon染色为阴性.RT-PCR结果显示该细胞表达CK19、Pdx-1和Nestin基因.结论:该方法可较好的分离出胰腺导管细胞.经鉴定该法培养所获细胞具有胰腺干细胞的特性.     

胰腺干细胞诱导分化方法的研究进展

供体的缺乏和移植排斥反应制约了胰岛移植的广泛应用,因此寻找干细胞分化为有功能的成熟胰岛细胞的有效方法日益受到人们的关注,本文将着重对目前在胰腺干细胞增殖分化中所运用的有效方法及存在的问题进行探讨。     

新生大鼠胰腺干细胞的分离和培养及初步鉴定

目的探讨分离、培养及初步鉴定新生大鼠胰腺干细胞的方法。方法取30只无特定病原体(SPF)级新生大鼠的胰腺组织,用完整胰腺胶原酶消化法分离胰岛。以低糖改良Eagel培养液为基础培养液,于不同时期分别添加血清、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、白血病抑制因子、神经干细胞原代培养的无血清培养液中的营养因子B27、神经元培养的无血清培养液中的营养因子N2等进行培养,倒置相差显微镜下观察其形态学特征及生长特性。应用免疫细胞化学法对培养不同时期的细胞进行巢蛋白(Nestin)及细胞角质蛋白19(CK-19)检测,并进行初步鉴定。结果 1新生大鼠胰腺内纤维组织少,体积小,完整胰腺胶原酶消化法简化了胰岛分离步骤,减少了污染机会,有利于进一步培养。2培养24 h可见细胞贴壁,但贴壁细胞数量较少,改用无血清培养后,贴壁细胞快速生长,10~15 d形成单层细胞汇集,细胞形态较一致。3培养所得细胞一直较多表达胰腺干细胞的标志物Nestin,随培养时间延长,表达CK-19的细胞数量逐渐增多。结论新生大鼠胰腺消化后,获得的细胞于不同时期表达胰腺干细胞的标志物Nestin、CK-19。     

体外胰腺导管上皮细胞与胰腺腺体培养对比分析

目的:比较以胰腺导管上皮和腺细胞培养获取胰岛细胞的差别,以探寻获取胰岛细胞的可靠途径.方法:用胶原酶消化法,获取胰腺导管上皮细胞和胰岛细胞,进行体外培养,观察其细胞形态、细胞纯度和胰岛素分泌量,比较两种细胞来源获取胰岛细胞的差异性.结果:在光镜下见胰腺导管上皮细胞组(Ⅱ组)具有较强的增殖能力,能够产生胰岛样细胞团;硫腙(DTZ)染色阳性细胞团纯度记数高于腺体细胞组(Ⅰ组)(87.6%/73.7%);胰岛素分泌量明显高于后者(237.23±52.41/566.07±55.66;162.87±38.17/431.22±57.59;105.89±31.47/359.68±62.27;P<0.01),但组内则无统计学意义的差别(P>0.05),Ⅰ、Ⅱ组胰岛素分泌量随时间延长而衰减,其第4、6天分泌量分别为第2天的68%、44%和75%、63%.结论:胰腺导管上皮细胞具有较强的转分化为胰岛细胞的能力,在胰岛细胞培养取材过程中,不能忽视或丢弃,它可能是可转分化为胰岛细胞的胰腺干细胞之一.     

大鼠全胰腺腹腔内移植模型的观察

采取胰管开放、供胰腹腔动脉、门静脉与受体一侧肾动、静脉吻合进行血管重建的胰腺移植术式。二组共２０只受体大鼠均存活,无手术死亡。说明该动物模型安全可行。切取长时间存活出现排斥后的移植胰,见纤维组织包裹造成胰管阻塞,故利用该模型长期观察移植胰有功能存活时,需考虑胰管阻塞使腺泡纤维化影响胰岛功能的因素。     

LHF保存液低温保存大鼠胰腺的实验研究

目的 研究自制ＬＨＦ器官保存液对ＳＤ大鼠胰腺的保存效果。方法 ＬＨＦ和高渗枸椽酸腺嘌呤保存液保存大鼠胰腺１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ后进行胰岛细胞分离，观察保存前、后细胞形态、功能的变化。结果 ＬＨＦ液保存大鼠胰腺３６ｈ内，组织含水量无显著的增加，保存液中胰淀粉酶、胰岛素含量低、细胞色素氧化酶活力无显著性降低。胰岛细胞分离后，细胞形态结构完整、分泌功能良好，其保存效果明显优于高渗枸椽酸腺嘌呤保存液。结论     

昆明小鼠胰腺导管上皮细胞转分化为胰岛样细胞的实验研究

目的:培养小鼠胰腺导管上皮细胞并使之转分化为胰腺干细胞及胰岛样细胞,为胰岛移植治疗糖尿病提供细胞来源.方法:分离培养昆明小鼠胰腺导管上皮细胞,以添加有角化细胞生长因子(KGF)、肝细胞生长因子(HGF)和烟酰胺的DMEM/F12培养基培养,分别于光镜和电镜下观察细胞形态和超微结构的变化.采用细胞免疫化学染色检测第1天和16天时CK-19、PDX-1蛋白的表达,RT-PCR检测第1天和16天时胰岛素和胰高血糖素基因的表达,第21天行双硫腙染色试验及葡萄糖刺激的胰岛素释放试验.结果:培养第7～10 d,细胞快速增殖成鹅卵石样;培养第16～21 d,细胞逐渐聚集,最终形成胰岛样细胞团;培养第16 d,细胞超微结构的变化表明上皮细胞在向干细胞转分化.免疫化学染色显示,分离第1天,大部分细胞CK-19染色阳性,偶见PDX-1弱阳性细胞,第16天时,CK-19阳性细胞快速增殖形成细胞团,大部分细胞PDX-1染色阳性.RT-PCR显示培养第16天,细胞胰岛素和胰高血糖素表达较培养第1天明显增强(P<0.01).培养第21天,胰岛样细胞团更加成熟,双硫腙着色阳性,且在高糖(15 mmol/L)刺激下的胰岛素释放较低糖(5.6 mmol/L)刺激时增加了1.6倍(P<0.05).结论:小鼠胰腺导管上皮细胞在体外培养条件下可增殖,并具有干细胞潜能,可转分化为胰岛素分泌细胞.     

胎胰蛋白促进人脂肪来源的间充质干细胞向胰岛素及C-肽阳性细胞的分化及细胞鉴定

目的：利用大鼠胚胎胰腺组织蛋白提取物诱导人脂肪来源的间充质干细胞(hASCs)向胰岛素分泌细胞分化,为临床胰岛移植寻找新的细胞来源。方法：将新生SD大鼠的胚胎胰腺匀浆后提取胎胰蛋白,重建胰腺微环境,诱导hASCs向胰腺方向分化。诱导组为胎胰蛋白培养组,对照组不添加胎胰蛋白,其余培养条件相同,诱导20 d后,荧光定量PCR技术检测2组胰腺发育相关基因的表达水平,ELISA法检测细胞悬液胰岛素水平,荧光免疫组织化学检测细胞C-肽蛋白表达。结果：在胎胰蛋白诱导过程中,hASCs重要标志基因Oct3/4及Nanog的表达持续降低,说明hASCs逐渐失去全能干细胞的特性;在诱导的第6天开始检测到PDX-1和CK-19的表达上调,诱导细胞出现了胰腺方向的分化,12 d开始检测到胰岛素的阳性表达。所获分化细胞基础相分泌胰岛素量为（287.17± 15.67） mIU•L^-1,高糖刺激下为（401.09±28.94 ）mIU•L^-1,二者比较差异有统计学意义（P<0.01）,且均明显高于对照组的（4.85±1.04） mIU•L-1 (P<0.01);免疫荧光检测,诱导组可见C肽阳性细胞,对照组未见C-肽阳性细胞。结论：模拟的微环境可诱导hASCs分化为有功能的胰岛素产生细胞,具有替代胰岛细胞治疗糖尿病的潜在可能性。     

胰腺干细胞和胰岛细胞在糖尿病 大鼠治疗中的疗效观察

目的 探讨大鼠胰腺干细胞与胰岛细胞移植在大鼠糖尿病治疗中的疗效。方法 通过链脲菌 素复制1 型糖尿病大鼠模型并随机分为胰岛细胞组和胰腺干细胞组。用胶原酶V 分别消化新生和成年大鼠 胰腺,Percoll 梯度离心分离胰岛细胞和胰腺干细胞。采用Bonner-Weir 法诱导胰腺干细胞分化,DTZ 染色 检测移植物纯度,AO/PI 检测移植物活性。分别记录手术前后大鼠血糖水平、胰岛素水平及移植物存活时 间;高糖刺激实验和腹腔糖耐量评价移植物功能;取各组大鼠移植部位标本行HE 染色和免疫组织化学染 色,观察组织形态学变化。结果 胰岛细胞组和胰腺干细胞组血糖分别在术后3 和5 d 恢复正常（P <0.05）, 两组大鼠术后不同时间点的血糖有差异（P <0.05）,胰腺干细胞组的降糖能力强于胰岛细胞组（P <0.05）。 两组大鼠移植后7 d 血清胰岛素水平均较术前升高（P <0.05）。高糖刺激实验表明,各组移植后15 和65 d 高糖刺激后的C 肽水平较刺激前升高（P <0.05）,胰岛细胞组移植后65 d 高糖刺激后C 肽水平低于胰腺 干细胞组（P <0.05）,胰岛素和C 肽水平监测结果表明胰腺干细胞组移植物胰岛素分泌维持时间长于胰岛 细胞组。移植后腹腔糖耐量实验结果表明移植物均功能良好。胰岛细胞组和胰腺干细胞组移植物的中位 存活时间分别为73 和88 d,Kaplan-Meier 曲线分析提示胰腺干细胞组移植物生存时间较胰岛细胞组延长 （P <0.05）。HE 染色提示肝脏门静脉移植区域可见新生血管包绕的胰岛细胞团,免疫组织化学染色证实细 胞团胰岛素阳性。结论 胰腺干细胞分化后经门静脉移植能安全有效地发挥降糖作用,疗效优于胰岛细胞 移植。     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导为胰岛样细胞体外实验

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）在不同葡萄糖浓度培养基中诱导效果的差异.方法：采用电镜观察细胞形态学变化、双硫腙（DTZ）染色鉴定胰岛素分泌细胞的存在;放射免疫分析法观察诱导后BMSCs细胞对葡萄糖刺激试验的反应;免疫细胞化学分析鉴定细胞内胰岛素分泌以及Real-timePCR鉴定胰岛β细胞相关基因mRNA表达水平.结果：电镜观察可见诱导后的细胞具备典型分泌细胞特点,DTZ染色显示各诱导组细胞团为棕红色,细胞浆中富含锌离子,而对照组则无染色,表明胰岛素分泌样细胞的存在.经不同浓度葡萄糖诱导后其吸光度值A值：低糖5.5mmol/L诱导组（4.75±1.87）,中糖11.1mmol/L诱导组（10.96±2.06）,高糖25mmol/L诱导组（12.53±2.04）,且各诱导组吸光度值A值随着培养基葡萄糖浓度的不断增加,A值也在不断增高.Real-timePCR定量分析结果显示,诱导后胰岛β细胞相关基因GK,PDX-1,ngn3,GLP-1mRNA的表达水平变化显著,差异具有统计学意义（P〈0.01）.胰岛素分泌量高糖25mmol/L诱导组（6.64±0.46）IU/L高于其他各组,差异具显著性（P〈0.01）.结论：培养基葡萄糖浓度对大鼠BMSCs诱导为胰岛样细胞具有一定影响,以高糖培养基的诱导效果较好.     

胰岛新生相关蛋白肽方案诱导人脂肪源性干细胞体外分化成为胰岛样细胞团的效果评价

目的： 探讨胰岛新生相关蛋白(INGAP)联合细胞因子诱导人脂肪源性干细胞(hASCs)分化为胰岛样细胞团的效果。方法：分离、纯化、鉴定人脂肪源性干细胞。应用胰岛新生相关蛋白肽(INGAP-pp)联合细胞因子进行四步法诱导,RT-PCR、实时定量PCR及细胞免疫荧光检测诱导后细胞胰腺发育及功能基因的表达变化,在不同浓度（5.6和25.0 mmol·L^-1）葡萄糖刺激下,检测分化细胞胰岛素及C肽分泌量。结果: 在诱导过程中,干细胞相关基因Oct3/4表达降低至原始水平的1/20,而与胰腺系分化发育相关的基因(Ck19、nestin、pdx-1及nkx2.2均显著升高。在诱导分化后期,INGAP-pp/Scramble-pp 诱导组均出现了胰岛样细胞团,INGAP-pp诱导组细胞团的直径为150～200 μm,而Scramble-pp诱导组细胞团的直径为50～100 μm,前者更接近天然胰岛直径。免疫荧光检测显示,胰岛样细胞团中存在胰岛素和C肽双阳性的细胞群,对不同浓度的葡萄糖刺激有反应,分泌量约占天然胰岛细胞的1/15～1/10。 结论：INGAP-pp诱导方案可诱导hASCs向胰腺系细胞分化,在体外形成具有胰岛素分泌功能的胰岛样细胞团。提示hASCs有望替代胚胎干细胞及骨髓来源间充质干细胞,成为细胞移植治疗糖尿病的种子细胞。     

体外诱导Balb/C小鼠ES细胞定向分化为胰岛样细胞团的形态观察

目的 体外诱导Balb/C小鼠胚胎干细胞定向分化为胰岛样细胞团,观察细胞表面形态学的变化。方法 选用Balb/C小鼠ES细胞,经过拟胚体(EB)发育分化4d后开始定向诱导培养,不同时间段分别向细胞培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1和尼克酰胺和N等细胞生长因子,使ES细胞定向分化为胰岛样细胞团。免疫细胞化学检测表达胰岛素和胰高血糖素的阳性细胞。原子力显微镜(AFM)原位扫描阳性细胞团。结果 EB细胞生长为大小不一、境界清楚的细胞团,细胞团内细胞排列紧密。胰岛B细胞数量多,主要分布在细胞团的中央,边缘少,染色较淡。而表达胰高血糖素的A细胞主要分布在细胞团的边缘,数量相对较少。AFM扫描可见表达胰岛素的阳性细胞团,其表面有很多类似神经纤维的纤维束,连接成网络状。在细胞质中,还有很多类圆形的颗粒物质,其大小几乎一致,粒径都处于0.5~1.0 μm间。结论 诱导分化得到的细胞团不仅有形态和功能上的成熟,而且还具备良好的组织结构,为细胞的移植疗法提供了可靠的凭据。     

Differentiation of marrow-derived islet-like cells and their effects on diabetic rats

In recent years, islet transplantation for diabetes has shown signs of the treatment efficacy, but its application is limited due to lack of donor organizations, sources and immune rejection. Bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） have become a new resource of islet cell substitutes. One focus of the current research is the application of a specific inducing agent or a culture system to get directed differentiation of BMSCs, which may have part characteristics of islet cells and then be used in autologous transplantation for the treatment of diabetes.     

大鼠诱导性多能干细胞向神经前体细胞诱导分化研究

目的探讨大鼠来源的诱导性多能干细胞(iPS细胞)向神经前体细胞(NPC)定向诱导分化的方法。方法在大鼠iPS细胞培养到悬浮类胚体阶段加入维甲酸(RA)诱导分化,对分化获得的细胞,分别通过免疫荧光染色和实时定量PCR方法检测NPC标志物、用BrdU免疫荧光染色检测其增殖能力、并通过大鼠视网膜下腔移植对其存活、整合情况及分化能力进行检测。结果经诱导分化获得的细胞能够在贴壁培养条件下形成Rosette结构、表达NPC标志物并且绝大多数呈BrdU阳性,移植到大鼠视网膜下腔后能分化为神经元和胶质细胞。结论大鼠iPS细胞能够通过悬浮EB加RA诱导的方法分化为NPC,有可能作为细胞移植治疗视网膜退行性疾病的供体细胞。     

多种生长因子诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素生成细胞团

目的探讨体外联合应用激活素A、全反式维甲酸(ATRA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和烟酰胺4种生长因子能否将小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导分化为胰岛素生成细胞团。方法先后以激活素A、ATRA、bFGF和烟酰胺4种生长因子诱导小鼠ESC 14 d后,应用RT-PCR、DTZ染色和免疫荧光检测分化细胞胰岛素表达。结果分化细胞可检测到胰岛素mRNA表达,DTZ染色和免疫荧光染色阳性。结论体外联合应用激活素A、ATRA、bFGF和烟酰胺4种生长因子能够将小鼠ESC诱导分化为胰岛素生成细胞团。