Wnt/β-catenin与NF-κB信号通路在邻苯二甲酸二丁酯诱导雄性大鼠发生尿道下裂中的表达

目的: 利用邻苯二甲酸二丁酯(DBP)孕晚期暴露诱导子代SD大鼠发生尿道下裂,验证Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)及核因子κB(NF-κB)信号通路中关键蛋白在胎鼠生殖结节中的差异表达,探讨该通路在DBP致大鼠生殖系统发育异常过程中的作用机制?方法:孕SD大鼠20只,随机分为DBP组和对照组,在妊娠(GD)14~18天,每天分别通过灌胃给予DBP和大豆油800 mg/kg,于GD 19天处死后取胎鼠,鉴别出DBP组中发生尿道下裂的雄性胎鼠及对照组中的雄性胎鼠,分为尿道下裂组与正常对照组,提取生殖结节组织,Western blot检测β-catenin?糖原合成酶-3β(GSK-3β)和NF-κB的表达情况?结果:DBP染毒后子代雄性胎鼠出生体重较对照组明显下降,肛门生殖器距离(AGD)明显缩短,尿道下裂发生率为46.7%,同时尿道下裂组与正常对照组中β-catenin相对表达量的比值为0.505±0.014(P < 0.05),GSK-3β与NF-κB相对表达量的比值分别为1.903±0.018和3.661±0.021(P均< 0.05)?结论:DBP可能通过干预生殖结节中Wnt/β-catenin和NF-κB信号通路的正常表达导致尿道下裂的发生?     

邻苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯通过氧化应激、凋亡诱导大鼠尿道下裂

目的 探讨邻苯二甲酸二-(2-乙基己基)酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]诱导大鼠发生尿道下裂的发生机制.方法 20只成年孕SD大鼠[10 ～ 12周龄,体质量(240 ±20)g]按完全随机分为:玉米油对照组[750 mg/(kg·d),n=10]和DEHP暴露组[750 mg/(kg·d),n=10],于妊娠期(gestation day,GD)第8.5 ～18.5日每日灌胃,于GD19.5时剖宫取出胎鼠,以有无睾丸分辨雌雄,并在解剖显微镜下观察有无尿道下裂的发生,将DEHP暴露组有尿道下裂的列入尿道下裂组,以玉米油对照组雄性无尿道下裂的胎鼠作为正常对照组.测量雄鼠胎鼠的肛门生殖器距离(anogenital distance,AGD)和肛门生殖指数(anogenital index,AGI),扫描电镜和HE染色观察阴茎组织形态改变情况,高效液相色谱法检测胎鼠肝脏中的维生素A、E水平,Westem blot检测阴茎组织中氧化应激相关蛋白Nrf2、HO-1、SOD1、Gpx和凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax、Bcl2的表达水平,TUNEL法检测阴茎组织中的细胞凋亡.结果玉米油对照组胎鼠无尿道下裂发生,DEHP暴露组胎鼠出现尿道下裂,发生率为27.59％.与正常对照组相比,尿道下裂组AGD、AGI均明显降低(P＜0.05);尿道下裂胎鼠阴茎出现腹侧尿道皱褶融合障碍及尿道口开口异常;此外,尿道下裂胎鼠体内维生素A、E的水平明显降低(P＜0.05);阴茎组织中Nrf2、HO-1、Gpx、SOD1和Bcl2蛋白表达水平明显下降(P＜0.05),cleaved caspase-3和Bax蛋白表达水平则明显增高(P＜0.05),细胞凋亡显著增加(P＜0.05).结论DEHP诱导SD大鼠发生尿道下裂,可能与机体氧化应激失衡、Nrf2-HO-1信号通路被抑制后阴茎组织中细胞凋亡异常增加有关.     

Akt信号通路在邻苯二甲酸二丁酯诱导雄性胎鼠发生尿道下裂中的表达研究

目的:邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)孕晚期暴露诱导子代Spraque-Dawley大鼠发生尿道下裂,探讨Akt信号通路及其下游关键蛋白核转录因子κB(nuclear factor-κ-gene binding,NF-κB)在胎鼠生殖结节中的差异表达,研究该通路在DBP致大鼠生殖系统发育异常过程中的作用机制?方法:孕SD大鼠20只,随机分为染毒组和对照组,在妊娠时间(gestation day,GD)14~18 d,每天通过灌胃分别给予DBP 800 mg/kg和大豆油,在 GD19时提取染毒组发生尿道下裂胎鼠与对照组胎鼠的生殖结节组织,用Western blot检测磷酸化Akt(p-Akt)?Akt和NF-κB的表达情况,同时用免疫组化分析p-Akt的表达情况?结果:尿道下裂组与对照组中p-Akt?Akt和NF-κB相对表达量的比值分别为3.057 ± 0.026?2.624 ± 0.073和3.524 ± 0.035(n = 10,P < 0.05),且尿道下裂组中p-Akt蛋白相对量在总蛋白中所占的比例较对照组高?p-Akt定位于生殖结节上皮细胞,尿道下裂组p-Akt染色明显强于对照组? 结论:DBP干预大鼠生殖结节中Akt信号通路及其下游NF-κB的正常表达,进而影响了上皮细胞增殖?凋亡及尿生殖褶的融合,这可能是尿道下裂发生的机制之一?     

邻苯二甲酸二丁酯诱发大鼠尿道下裂模型的建立

目的:尝试用邻苯二甲酸二丁酯(DBP)建立尿道下裂大鼠模型。方法:孕鼠30只,随机分成2组:①实验组(DBP)15只;②对照组(大豆油)15只。在大鼠怀孕12～20天期间,2组每天分别给予灌胃,实验组予DBP500mg/(kg·d),对照组予大豆油,灌胃容积均为每只1ml/d。待孕鼠分娩完毕,即对新生大鼠计数并在解剖显微镜下测量雄性新生鼠的肛门生殖器距离(AGD)和称体重。在雄性仔鼠出生后70天逐个检查尿道下裂的发生情况。结果:①DBP成功诱导出了雄性大鼠尿道下裂畸形,对照组大鼠的生殖器未见异常改变;②实验组新生大鼠的AGD缩短,但无统计学差异;实验组新生大鼠体重明显减轻,有显著统计学差异。结论:①成功建立了尿道下裂大鼠模型;②为人类小儿尿道下裂的病因学研究和防治提供科学的实验依据。     

细胞外信号调控激酶在邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯诱导的尿道下裂大鼠中的表达

目的在邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]诱导的先天性尿道下裂大鼠模型上,研究细胞外信号调控激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)1/2在DEHP暴露后的胎鼠阴茎中的表达变化,探讨尿道下裂发生机制。方法将SD孕鼠完全随机分为DEHP组[750 mg/(kg·d)DEHP+1.5 mL大豆油]和对照组(1.5 mL大豆油),每组20只,2组分别于母鼠怀孕天数(GD)第12～19天持续经口灌注给药。2组分别取10只孕鼠让其正常分娩,并计数每窝产雄性活仔鼠数量;出生后1、3、7、14、21、30日龄时称取雄性仔鼠体质量并测量肛门生殖器距离(anogenital distance,AGD);30日龄时逐个检查尿道下裂的发生情况。余孕鼠在GD20行剖宫产取雄性胎鼠,应用实时定量聚合酶链反应(qPCR)和免疫组化方法分别检测胎鼠阴茎组织中ERK1/2 mRNA和蛋白表达水平。结果 DEHP组孕期暴露诱导的尿道下裂发生率为28.2%。DEHP组每窝产雄性活仔鼠数量、各日龄雄性仔鼠体质量及AGD较对照组明显减少或缩短(P<0.01)。与对照组比较,DEHP组胎鼠阴茎组织中ERK1和ERK2 mRNA表达水平明显增加(P<0.05);DEHP组ERK1/2磷酸化蛋白表达水平有增加趋势。结论 DEHP诱导先天性尿道下裂发生可能与胎鼠阴茎组织中ERK信号的过度表达有关。     

邻苯二甲酸二丁酯孕期暴露仔鼠阴茎组织乳酸脱氢酶B差异表达

目的:探讨邻苯二甲酸二丁酯(DBP)孕期暴露对仔鼠阴茎组织乳酸脱氢酶B(L-lactate dehydrogenase B,LDH-B)的影响,以进一步探讨LDH-B在DBP导致的尿道下裂中的作用机制。方法:将20只受孕大鼠随机分成2组,实验组10只,对照组10只。在大鼠怀孕第14～18天(GD14～18)2组分别给予灌胃,实验组给予DBP每天800mg/kg染毒孕鼠,对照组给予大豆油每天5ml,妊娠19天(GD19)分别取出仔鼠阴茎组织提取总蛋白,通过Western-blot及免疫组化检测LDH-B的表达。结果:实验组及对照组阴茎组织中均有LDH-B的表达,实验组的相对表达量为0.078±0.02(n=10),对照组的相对表达量为0.137±0.03(n=10),实验组中表达明显减少(P<0.05)。LDH-B主要定位于大鼠阴茎组织细胞的胞浆中。结论:孕期大鼠暴露邻苯二甲酸二丁酯后仔鼠阴茎组织中LDH-B表达明显减少,可能与DBP造成机体缺氧有关。     

邻苯二甲酸二丁酯干预Fgfs信号通路致雄性仔鼠尿道下裂发生的分子机制研究

目的:通过验证邻苯二甲酸二丁酯(DBP)孕期染毒所致尿道下裂雄性仔鼠生殖结节内成纤维细胞生长因子(Fgfs)及其受体(Fgfr)信号通路中关键基因的表达异常,探讨其在DBP生殖毒性过程中的作用机制.方法:孕鼠20只,随机分2组,在怀孕(GD)14～18天期间,每天分别灌胃给予大豆油、DBP 750 mg/kg,出生后第1天(PND1),统计仔鼠出生数、尿道下裂发生率,称量雄性仔鼠体重,肛门至生殖器距离(AGD);PND7,取尿道下裂雄性仔鼠生殖结节,用实时定量(real-time quantitative)RT-PCR方法检测生殖结节中Fgf8、Fgf10、Fgfr2的mRNA表达水平.结果:DBP染毒后导致新生仔鼠与正常组相比数量明显减少,雄性仔鼠体重明显下降、AGD明显缩短,雄性仔鼠尿道下裂的发生率为48.83%.同时,与对照组相比,DBP致尿道下裂雄性仔鼠生殖结节中Fgf8、Fgf10、Fgfr2的mRNA的表达水平明显下降.结论:DBP对母体有着明显的毒性作用,DBP干预了Fgfs信号通路中关键基因的表达,这可能是DBP导致生殖结节发育异常,引起尿道下裂的重要原因.     

邻苯二甲酸二乙酯诱导的大鼠尿道下裂与Mafb的表达相关:基于转录组测序结果

目的通过转录组测序筛选大鼠尿道发育过程中相关差异基因,并进行验证;探究邻苯二甲酸二乙酯（DEHP）诱导SD大鼠 尿道下裂的发生机制。方法40只成年SD孕鼠随机分成4组（n=10）,前两组予以空白对照处理,分别于妊娠期16 d（GD16组） 和GD19 d（GD19组）剖宫产取出雄性胎鼠,将收集好的胎鼠阴茎组织进行转录组测序,lllumina HiSeq 2000筛选出差异表达基 因（DEGs）,然后对DEGs进行差异基因功能（GO）和pathway显著富集性分析;选取其中的DEG（Mafb）进行免疫荧光验证。后 两组分别予以玉米油（对照组）和DEHP [750 mg/(kg·d)]（DEHP暴露组）于GD12 d至GD19 d每日灌胃处理,GD19 d剖宫产取 出雄性胎鼠,并判断有无尿道下裂的发生。扫描电镜和HE染色观察阴茎组织形态学改变,免疫荧光和Western blot检验阴茎组 织中Mafb、β-catenin的表达水平。结果GD19组胎鼠阴茎组织与GD16组胎鼠阴茎组织转录组测序结果示1360个DEGs（其中 上调797个,下调563个）,差异基因主要富集于细胞粘着斑信号通路、轴突导向信号通路、细胞外基质受体作用信号通路等,选 取DEG（Mafb）进行免疫荧光验证,发现Mafb的表达随发育显著增加,与测序结果相符。而DEHP暴露组胎鼠阴茎组织与对照 组胎鼠阴茎组织相比,Mafb、β-catenin表达水平显著下调（P<0.01）。结论随着大鼠阴茎组织的正常发育,Mafb的表达逐渐增 加;而DEHP暴露组较对照组Mafb、β-catenin表达显著下调,提示β-catenin信号通路影响Mafb表达可能与DEHP诱导大鼠尿道 下裂发生相关。     

雄性大鼠生殖结节中相关lncRNA和mRNA可能参与邻苯二甲酸二丁酯诱导的尿道下裂形成过程

目的：探讨雄性大鼠生殖结节中长链非编码RNA（long non?coding RNA,lncRNA）和mRNA在邻苯二甲酸二丁酯（di?n?butyl phthalate,DBP）诱导雄性大鼠尿道下裂形成中的可能作用。方法：在孕鼠孕13~18 d时每天按体重800 mg/kg DBP溶于1 mL玉米油灌胃,对照组每天给予1 mL玉米油。于孕19 d时取出胎鼠,分别取下灌药组发生尿道下裂胎鼠和对照组雄性胎鼠的生殖结节,提取RNA,构建RNA测序文库测序。对测序结果的lncRNA进行筛选、差异分析和功能预测,再随机筛选8条lncRNA用qRT?PCR验证其表达量。结果：与对照组相比,尿道下裂组生殖结节中有598个差异mRNA,427个差异lncRNA,qRT?PCR结果与测序结果一致。在生物过程、细胞组成、分子功能方面,差异表达mRNA富集程度最高的分别是红细胞生长、血红蛋白合成、结合珠蛋白结合。分布最多的的信号通路为病毒性心肌炎通路。差异lncRNA功能最多分布在生长激素释放激素受体的结合;分布最多的信号通路为金葡菌感染通路。结论：邻苯二甲酸二丁酯诱导的尿道下裂雄性大鼠与正常雄性大鼠相比,其生殖结节中lncRNA和mRNA的差异表达显著,lncRNA可能通过与mRNA相互作用参与尿道下裂的形成过程。     

塑化剂邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯诱导大鼠尿道下裂的研究

目的采用塑化剂邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)宫内暴露诱导建立大鼠尿道下裂模型,观察DEHP的外生殖器毒性作用。方法孕鼠40只,完全随机分成4组:正常对照组和DEHP低中高3个剂量组[分别为500、750、1 000 mg/(kg.d)]。在怀孕天数(GD)第12～19天连续灌胃,出生后(PND)第1天即对新生鼠进行计数,称体质量和测量肛门至生殖器之间的距离(AGD);PND30测量阴茎长度,观察每组雄性仔鼠的尿道开口位置,判断有无尿道下裂及其严重程度并切取整个阴茎进行病理组织HE染色。结果与对照组相比,随着DEHP暴露剂量增大,每窝产活仔数及雄性活仔数均较对照组有显著减少;同时仔鼠的体质量减轻、AGD和阴茎长度缩短明显(P<0.05,P<0.01)。DEHP低、中、高剂量组诱导出雄性仔鼠尿道下裂发生率分别为10.7%、30.6%和37.0%,与正常对照组比较,差异显著(P<0.05,P<0.01);重型尿道下裂发生率分别为0、8.3%和22.2%;阴茎组织横截面石蜡切片HE染色予以验证。结论 DEHP大鼠宫内暴露成功建立尿道下裂模型,且对子代具有一定的发育和外生殖器毒性效应。     

对尿道下裂大鼠生殖结节中lncRNA表达的初步研究

目的 探讨长链非编码RNA(LncRNA)在邻苯二甲酸二丁酯(DBP)诱导的尿道下裂大鼠生殖结节中的表达 方法 在孕鼠孕13-18天时按体重800mg/kg DBP溶于1ml玉米油灌胃,对照组每天给予1ml玉米油。于孕19天时取出胎鼠,分别取下灌药组发生尿道下裂和对照组雄性胎鼠的生殖结节,提取RNA,构建RNA测序文库测序。对测序结果的lncRNA进行筛选、差异分析和功能预测,再随机筛选4条lncRNA用qRT-PCR验证其表达量。结果 与对照组相比,尿道下裂组生殖结节中有195个差异lncRNA,136个差异mRNA,qRT-PCR结果与测序结果一致。差异lncRNA功能最多分布在生长激素释放激素受体的结合;分布最多的的信号通路为金葡菌感染通路 结论 邻苯二甲酸二丁酯诱导的尿道下裂雄性大鼠与正常雄性大鼠相比,其生殖结节中lncRNA和mRNA显著改变,lncRNA可能通过与mRNA相互作用参与到尿道下裂形成过程中生殖结节的发育。     

邻苯二甲酸二丁酯致大鼠隐睾睾丸和附睾病理组织学改变研究

目的：邻苯二甲酸二丁酯（DBP）孕晚期染毒诱导子代雄鼠隐睾的发生和探讨隐睾睾丸、附睾病理组织学的改变。方法：孕鼠40只，随机分组，在怀孕14-18天期间，每天分别灌胃给予大豆油（A组）、DBP100mg／kg（B组）、500mg／kg（C组）、800mg／kg（D组）。出生70天后观察雄仔鼠隐睾发生率及隐睾睾丸、附睾病理组织学改变。结果：C、D组雄仔鼠隐睾发生率为10．8％和63．5％；隐睾睾丸、附睾的脏器系数显著减轻；睾丸生精上皮萎缩，生精细胞层减少甚至消失，曲精小管体积减小；同时附睾管腔中精子缺如。电镜下隐睾睾丸中出现异常的支持细胞。结论：睾丸是DBP主要作用的靶器官；中、高剂量DBP孕晚期染毒可致雄仔鼠隐睾的发生、睾丸生精上皮的损害，从而影响其生育能力。     

氟他胺建立SD大鼠尿道下裂模型的实验研究

目的采用抗雄激素类药物氟他胺诱导建立大鼠尿道下裂动物模型,为进一步研究尿道下裂发病的分子作用机制和治疗提供理论和实验依据。方法孕鼠20只,随机分成2组:生理盐水(normal saline,NS)对照组和氟他胺(Flutamide,Flu)组,每组10只。在孕12～17d时连续6d分别经皮下注射等量生理盐水或用生理盐水配制的氟他胺溶液(12.5mg.kg-1.d-1)。于孕18d解剖两只母鼠,提取雄性胎鼠生殖结节做病理切片,同时观察睾丸位置和前列腺发育情况。待孕鼠分娩完毕,即对仔鼠进行记数,并于出生后第2、13、28天测量肛门生殖器距离(anogenital distance,AGD)和称重;观察每组雄性仔鼠的尿道口和睾丸位置、乳晕数量及拍照。结果与对照组相比,氟他胺组雄性子代大鼠尿道下裂畸形发生率为100%,单侧隐睾发生率为31.25%,解剖观察无前列腺,出现乳晕数均为12个,AGD较对照组明显缩短,有显著统计学差异,但体重随着时间的推移无明显变化。结论用氟他胺可以诱导出稳定、直观的雄性大鼠尿道下裂模型,适宜推广。     

小剂量氟他胺对大鼠性分化影响的实验研究

目的探讨低剂量抗雄激素药物氟他胺对大鼠性分化的影响,以及氟他胺诱导建立SD大鼠尿道下裂动物模型的可行性。方法60只孕鼠,随机分为5个实验组及1个对照组,从孕12～17d连续6d实验组每天腹部皮下注射用生理盐水配制的氟他胺4882．8、5078．1、5273．4、5468．7、6250．0μg／kg,对照组注射同量生理盐水。于孕18d每组解剖两只孕鼠,提取子代雄性胎鼠尿生殖结节做病理切片,同时观察睾丸位置和前列腺发育情况。并于出生后第2、13、28d观察雄性仔鼠性分化与性发育的指标．结果氟他胺染毒组雄性子一代肛殖距各组均明显小于对照组（P〈0．05）;尿道下裂的发生率依次为29．00％、40．00％、63．68％、78．72％、100％;单侧隐睾发生率分别为4．23％、6．23％、9．23％、11．52％、16．28％;乳晕延迟退化率均为100％;各组前列腺不发育或发育不全。结论小剂量氟他胺能够引起大鼠的性分化与性发育异常;并能诱导出稳定、直观的尿道下裂动物模型。     

表皮生长因子及睾酮对尿道下裂尿道板成纤维细胞雄激素受体活化水平的影响

目的：探讨尿道下裂尿道板成纤维细胞雄激素受体(androgen receptor,AR)的表达情况及表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和睾酮(testosterone,T)对AR活化水平的影响。方法：原代培养尿道下裂患儿的尿道板成纤维细胞,分别采用EGF和不同浓度睾酮干预,通过免疫细胞化学技术及图形分析技术检测成纤维细胞中AR活化水平的变化。结果：在生理浓度睾酮(3×10-8 mol/L)的作用下,中远端型尿道下裂组与对照组AR的活化水平差异无统计学意义(P>0.05),近端型尿道下裂组的成纤维细胞AR的活化水平与其他两组比较有明显的差异(P<0.001)。在睾酮浓度为3×10-6 mol/L时,3个组AR活化有明显差异(对照组>中远端型组>近端型组,P<0.001)。在EGF与生理浓度睾酮干预下,近端型尿道下裂组的成纤维细胞AR的活化程度升高最为明显,与对照组及中远端型组有明显差异(P<0.001),中远端型组AR的活化升高的水平与对照组相比也有提高(P=0.02)。结论：尿道下裂尿道板成纤维细胞AR的表达与活化均存在异常,EGF可提升不同类型尿道下裂尿道板成纤维细胞AR的活化水平,尤以近端型明显。     

分期岛状包皮瓣尿道板重建术在重度尿道下裂中的应用

  目的  研究分期岛状包皮瓣尿道板重建术在重度尿道下裂手术治疗中的临床效果。  方法  回顾性分析2013年11月至2022年3月昆明医科大学第一附属医院治疗的重度尿道下裂患者28例临床资料。按照手术方法的不同,分为分期岛状包皮瓣尿道板重建术式手术组（A组）和传统分期手术（即:一期伸直阴茎,二期尿道成形术）组（B组）。比较2组患者的年龄、手术时间、出血量、术后并发症的发生率,并随访亲属对治疗的满意度。  结果  分期岛状包皮瓣尿道板重建术的13例中,在首次手术时年龄2岁至34岁,尿道缺损长度3.5～6 cm;传统分期手术患者15例, 第1次手术时年龄2岁至27岁,尿道缺损长度 3～6 cm。2组患者的年龄、治疗时间、术中出血量差异无统计学意义（P > 0.05）。分期岛状包皮瓣尿道板重建术手术组术后2例发生尿道瘘,另1例发生阴茎头部尿道破裂。经再次尿道瘘修补/尿道成形治疗。传统分期手术组术后4例发生尿道瘘,2例尿道狭窄和尿道憩室。需经再次手术尿瘘修补术/尿道成形术,尿道扩张术治愈。分期岛状包皮板尿道板重建术组手术成功率为76.9%,传统分期手术组手术成功率为60.0%（P > 0.05）。且分期岛状包皮瓣尿道板重建术较传统分期手术术后满意度更高（P < 0.05）。  结论  分期岛状包皮瓣尿道板重建术已成为分期治愈尿道下裂的重要方法,对重度的尿道下裂术后安全性较好,外观比较满意,并发症发生率低,具有临床应用价值。     

Mathieu术治疗小儿阴茎体前型尿道下裂（附19例报告）

目的：介绍应用Mathieu术矫治小儿阴茎体前型尿道下裂的经验和体会。方法：阴茎体前型尿道下裂19例。手术年龄3－8岁，无明显阴茎弯曲。插入硅胶导管后，测量尿道口至龟头距离，自尿道口向龟头作两纵行切口，宽约0.5cm，尿道口近端亦作两切口，取宽约0.5-0.8cm，稍长于尿道口至龟头距离皮瓣翻转上与尿道口远端切口连续缝合成管状。结果：本组19例中，1例术后尿瘘，2例术后尿道狭窄，予尿道扩张后排尿通畅，无尿外渗和感染。结论：Mathieu术适于阴茎体前型无阴茎弯曲的尿道下裂，手术操作简单，尿瘘发生率低。