GIT1发夹结构干扰MLC的分布及其磷酸化

目的:探索G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein1,GIT1)的RNA发夹结构(hairpin)(GIT1-RNAh)对成骨细胞内肌球蛋白轻链(myosinlightchain,MLC)的分布及磷酸化的影响,并分析其机制。方法:取培养至第6代的鼠成骨细胞,随机分成两组,分别用包含GIT1-RNAh(实验组)和绿色荧光蛋白(green fluoresence protein,GFP)的发夹结构(GFP-RNAh)的腺病毒(对照组)感染12h,再将每组分成有、无血小板衍生生长因子(platelet-drived growth factor,PDGF)刺激的两组,免疫荧光染色方法检测成骨细胞内MLC的位置,Western blot检测MLC的磷酸化。结果:免疫组织化学观察:和对照组相比,实验组明显扰乱了成骨细胞MLC的分布;Western blot观察:和对照组相比,实验组明显抑制了MLC的磷酸化(P<0.05)。结论:GIT1的发卡结构过表达可干扰MLC的分布和其磷酸化。     

TAP1基因慢病毒载体的构建

目的:构建TAP1基因慢病毒过表达载体及检测其过表达效率,为制备前列腺癌的免疫细胞疫苗提供基础。方法:将pDONR223-TAP1质粒和pLenti6.3-IRES-EGFP构建形成pLenti6.3-TAP1-IRES-EGFP表达质粒,采用慢病毒包装试剂盒包装产生慢病毒;感染293T细胞后RT-PCR检测目的基因TAP1的表达;采用荧光FACS计算病毒活性滴度。RT-PCR检测转染PC-3细胞后TAP1表达。结果:PCR和测序证实pLenti6.3-TAP1-IRES-EGFP慢病毒质粒构建成功;包装纯化后收集的病毒液滴度经流式细胞仪检测滴度为2.87×107 TU/ml;转染后的PC-3后,TAP1转染组TAP1的表达量显著高于对照组。结论:成功构建人TAP1基因慢病毒过表达载体,可以上调PC-3细胞TAP1的表达。     

人支架蛋白IQGAP1-shRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的 制备携带人支架蛋白IQGAP1基因小分子干扰RNA的重组慢病毒.方法 分别设计合成针对IQGAP1的4个shRNA慢病毒干扰载体;分别转染293T细胞,利用Western blot验证shRNA的沉默效果,选择其中一个沉默效果较好的shRNA慢病毒干扰载体同源重组产生Lentivirus- IQGAP1-shRNA并测定病毒滴度.结果 测序证实,构建携带IQGAP1-shRNA的慢病毒载体具有较好的沉默靶基因的效果,包装慢病毒,病毒滴度为2.0×l010TU/ml.结论 成功制备携带IQGAP1-shRNA的重组慢病毒载体并包装出具高效感染力的慢病毒颗粒.     

GIT1蛋白通过调节血管形成促进骨折愈合

目的:探讨G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(GIT1)在骨折愈合过程中的作用?方法:应用GIT1基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠制作股骨骨折模型,每组30只?造模成功后7?14?21 d,应用X线?micro-CT?PECAM1免疫荧光染色等方法分析骨痂体积及新生血管情况?结果:与野生型小鼠相比,GIT1基因敲除小鼠骨折愈合延迟,骨痂内新生血管的体积和数量减少?结论:GIT1基因缺失导致骨痂区新生血管减少,从而延迟骨折愈合?     

RANTES-K慢病毒载体的构建及其慢病毒的产生和鉴定

目的：构建含CC细胞内趋化因子（CC-intrakine,RANTES-K）基因的慢病毒载体,为研究Ⅰ型人免疫缺陷病毒（HIV-1）感染的基因治疗奠定基础．方法：应用PCR技术,扩增目的基因片段RANTES-K,纯化后的PCR产物定向连接入pLenti6／V5-D-TOPO载体,构建慢病毒载体pLenti6／V5-R-K,并在293FT细胞中建立慢病毒株,最后转染HeLa细胞观察RANTES蛋白的表达．结果：成功构建了慢病毒载体pLenti6／V5-R-K,并证实RANTES蛋白可在人宫颈癌HeLa细胞系内表达．结论：慢病毒载体可介导CC-intrakine（RANTES-K）基因高效稳定转染HeLa细胞,可用于抗HIV-1感染的基因治疗．     

CXCL1基因重组慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：采用第2代慢病毒表达载体系统,构建CXCL1基因的慢病毒表达载体,摸索出较传统转染方法更为高效、可靠的转基因方法,为今后进一步的基因靶向治疗研究打下良好的基础。方法：首先扩增CXCL1全长序列,将其与慢病毒载体pWPI连接后测序,通过BLAST检索,鉴定慢病毒表达载体构建成功。将重组慢病毒质粒转染293T细胞,48h后荧光显微镜鉴定,慢病毒转染并包装成功。结果：重组慢病毒质粒CXCL1-pWPI测序结果经BLAST对比分析,与CXCL1基因的同源性达100％。结论：成功的构建了CXCLl基因的重组慢病毒表达系统。     

NY-ESO-1抗原T细胞受体基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建NY-ESO-1抗原T细胞受体基因（TCellReceptor,TCR）的慢病毒载体并获得重组慢病毒。方法设计特异性NY-ESO-1TCR的引物,用聚合酶链反应（PCR）对我们前期已克隆的NY-ESO-1TCRcDNA进行体外扩增,双酶切后定向插入到pCL20c-MSCV-GFP质粒,构建NY-ESO-1抗原特异性TCR基因的重组慢病毒载体pCL20c-MSCV-ESOTCR,并经酶切、PCR及测序鉴定。用pCL20c-MSCV-ESOTCR﹑pCL20c-HIV-gp、pCAG4-RTR2和CAG-VSV-G共转染T293包装细胞,获得上清,上清浓缩后感染Hela细胞,观察ESOTCR基因及蛋白水平的表达。结果经PCR及测序证实,成功构建重组慢病毒载体pCL20c-MSCV-ESOTCR,包装产毒后感染Hela细胞,RT-PCR法及荧光显微镜均能检测及观察到基因及蛋白水平的表达。结论成功构建了表达NY-ESO-1抗原T细胞受体基因（TCellReceptor,TCR）的重组慢病毒载体。     

CRBP-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠视黄醇结合蛋白-1(cellular retinol-binding protein-I,CRBP-1)基因RNAi(RNA interfer-ence,RNAi)慢病毒载体。方法:针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的含CRBP-1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论:成功构建大鼠CRBP-1基因RNAi慢病毒载体。     

人NESG1基因慢病毒载体的构建及其在293FT细胞中的表达

目的克隆人NESG1基因,构建与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体pGC-FU-NESG1-EGFP,包装慢病毒,感染293FT细胞并进行鉴定。方法以NESG1全长克隆为模板扩增其编码框序列,通过限制性内切酶AgeI酶切、T4 DNA连接酶连接,将NESG1插入慢病毒载体pGC-FU-EGFP,构建pGC-FU-NESG1-EGFP重组载体。质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经PCR及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染人胚肾细胞系293FT,进行慢病毒包装并测定病毒滴度。病毒感染293FT细胞,荧光显微镜下观察感染效率,Western blot方法检测NESG1-EGFP融合蛋白的表达情况。结果成功构建慢病毒表达载体pGC-FU-NESG1-EGFP,三质粒共转染293FT细胞后可见大量绿色荧光;浓缩病毒后测定其滴度为2×107 TU/ml;以复感染系数MOI为1感染293FT细胞,感染效率在90%以上。Western blot证实细胞表达NESG1。结论成功构建NESG1慢病毒表达载体,包装得到高滴度慢病毒,为后续感染鼻咽癌细胞,探索其在鼻咽癌发生和发展中的作用奠定了基础。     

ABCE1特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定ABCE1基因短发夹状干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,以便进一步研究ABCE1的功能。方法针对已经筛选确定的ABCE1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/GFP载体连接、转化,产生pLV-sh-ABCE1慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLV-sh-ABCE1、pHelper 1.0和pHelper 2.0 3种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR和测序证实,成功构建ABCE1shRNA的慢病毒载体pLV-sh-ABCE1。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×108TU/ML。结论成功构建ABCE1基因shRNA慢病毒载体,为应用RNAi研究ABCE1功能奠定基础。     

持续性压力通过影响ERK1/2和GIT1的结合促进大鼠成骨细胞的迁移

目的:探讨持续压力对体外培养的大鼠成骨细胞内ERK1/2及GIT1蛋白相互关系及对大鼠成骨细胞迁移能力的影响.方法:取1～2天龄SD大鼠颅盖顶骨进行成骨细胞原代培养,采用压缩空气在密闭容器内对第2代细胞施以300 kPa的静压力,分别于未加压,加压后0.5、1.0、2.0 h提取细胞总蛋白,Western blot检测各组成骨细胞在Src抑制剂PP2不干预和干预下ERK1/2和GIT1的表达及其磷酸化,免疫共沉淀分析GIT1同活化的ERK1/2(phospho-ERK1/2,pERK1/2)相互作用的变化.Image-Pro Plus 5.0软件检测成骨细胞在Src抑制剂PP2不干预和干预下加压前后面积.结果:Western blot结果显示pERK1/2和pGIT1的表达在持续加压组较对照组明显增加;PP2干预下持续加压组的成骨细胞内的pERK1/2和pGIT1的表达较对照组无统计学差异;免疫共沉淀结果显示GIT1-pERK1/2结合力在持续加压组较对照组明显增加;持续加压后成骨细胞面积明显增加:PP2干预下持续加压后成骨细胞面积较对照组无统计学差异.结论:300 kPa左右的持续性压力能通过激活Src的活性,从而诱导ERK1/2,GIT1的磷酸化,同时增加pERK1/2和GIT1的相互结合,促进大鼠成骨细胞的迁移,Src-GIT1/ERK1/2途径可能是成骨细胞力学信号转导过程中的重要通路之一.     

携带人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶( APE1)基因重组慢病毒载体的构建及体外表达检测

目的:构建携带人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶-1 (Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1,APE1)基因重组慢病毒载体内英文摘要中,并检测其体外表达目的基因的水平.方法:应用基因克隆技术将人APE1基因克隆入慢病毒载体LV中,经过PCR、酶切和测序鉴定后,与包装四质粒系统共转染293T细...     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.     

Rac1-GTPase慢病毒的构建及生物学活性鉴定

目的构建携带绿色荧光蛋白的Rac1-GTPase显性负效突变体(Rac1N17)和组成型活性突变体(Rac1L61)的慢病毒。方法构建Rac1N17和Rac1L61慢病毒表达质粒,并以酶切和测序等方法鉴定。利用ViraPowerTM慢病毒表达系统包装制备Rac1-GTPase突变体慢病毒上清,用其感染大鼠前皮质神经元,分别进行Rac1生物学活性检测、细胞转染效率鉴定与神经元形态学观察。结果构建的Rac1N17和Rac1L61慢病毒表达质粒经酶切与测序鉴定正确,包装的慢病毒滴度为1×106TU/ml。用制备的慢病毒上清感染原代培养的前皮质神经元,Rac1生物学活性检测结果显示Rac1N17慢病毒显著抑制表皮生长因子诱导的Rac1活性的升高,而Rac1L61慢病毒感染神经元Rac1活性显著升高。感染效率鉴定显示病毒上清可感染80%以上的前皮质神经元。形态学观察显示经慢病毒感染后的神经元其胞体与树突分支清晰可见。结论成功制备了Rac1N17和Rac1L61慢病毒,并成功实现了慢病毒感染前皮质神经元,为进一步研究Rho蛋白家族信号通路提供了一个重要工具。     

人microRNA149抑制表达慢病毒载体的构建及对黑色素瘤细胞增殖及迁移的影响

目的 构建人microRNA149(Hsa-miR-149)抑制表达慢病毒载体,并探讨抑制miR-149表达对黑色素瘤Mel-RM细胞增殖及迁移的影响.方法 由miRBase及NCBI数据库查找获得miR-149序列,设计合成其引物序列,通过退火反应获得双链DNA寡核苷酸片段,与载体pBS-hU6-1连接,将连接后的载体与FG12连接,经测序鉴定后获得重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与包装辅助质粒共转染至293T细胞中,包装产生病毒,进行病毒滴度测定,再用包装后的病毒感染Mel-RM细胞,利用实时荧光定量PCR法检测miR-149表达水平.同时用MTT法及细胞迁移实验分别检测细胞增殖和迁移能力.结果 成功构建了抑制miR-149表达的慢病毒载体,测序证实了所插入的基因序列正确.在荧光显微镜下观察到转染后的297T细胞表达大量绿色荧光蛋白,收集病毒,用梯度滴定法测得的重组载体病毒滴度为3.2×1010 TU/L.将病毒感染Mel-RM细胞显示可有效降低miR-149的表达水平(P＜0.05).MTT法结果显示与感染空载FG12病毒的对照组相比,感染抑制miR-149表达重组质粒的实验组中活细胞数明显减少(P＜0.05).细胞迁移实验结果显示与对照组相比实验组明显抑制了Mel-RM细胞的迁移(P ＜0.001).结论 成功构建抑制miR-149表达的慢病毒载体,抑制miR-149的表达可以抑制Mel-RM细胞的增殖和迁移.并为后续进一步研究miR-149对黑色素瘤细胞发生发展的影响提供依据.     

细胞程序性坏死在急性肺损伤中作用的研究进展

 程序性坏死作为一种新的细胞程序性死亡方式参与急性肺损伤（acute lung injury,ALI）的病理过程,主要在疾病前期由各类高危因素触发,由受体相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1）、RIPK3、混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed-lineage kinase domain-like protein,MLKL）介导,导致肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、肺泡巨噬细胞等细胞死亡,直接或通过调节机体炎症反应造成严重的肺泡结构损伤及肺水肿,应用抑制剂阻断程序性坏死可以减轻肺损伤。本文就程序性坏死在ALI中的作用进行综述,以期为临床筛选高危患者和治疗提供依据。     

小鼠pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建共表达小鼠Wnt3a（mWnt3a）与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体,感染神经干细胞(NSCs),观察mWnt3a在NSCs中的表达。方法 利用同源重组技术将mWnt3a基因插入慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒重组质粒,通过瞬时转染法包装出病毒上清,感染NSCs,设为Wnt3a-NSCs组;同时设GFP感染NSCs组（GFP-NSCs组）和未感染NSCs组(NSCs组)作为对照。免疫荧光染色法对Wnt3a-NSCs组NSCs 进行nestin鉴定;Real-Time PCR检测各组细胞mWnt3a mRNA的表达;Western blotting检测各组细胞mWnt3a、β-catenin蛋白的表达。结果 经限制性内切酶检测、基因测序和绿色荧光观察证实成功构建了携带mWnt3a基因的重组慢病毒,且慢病毒滴度达3×108 TU/mL。Wnt3a-NSCs组NSCs在荧光显微镜下证实有绿色荧光,且nestin表达阳性。Real-Time PCR和Western blotting结果显示感染后7 d, Wnt3a-NSCs组mWnt3a mRNA和蛋白以及β-catenin蛋白均明显高于GFP-NSCs组和NSCs组（P<0.01）。结论 成功构建了表达mWnt3a基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功转染NSCs。     

ＧＩＴ１和ＥＲＫ１／２在兔脊髓缺血再灌注损伤中作用的初步研究

目的:研究G蛋白耦联受体激酶相互作用分子1(G-protein-coupled receptor kinase interacting protein 1,GITl),细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular sisnal-regulated kinases 1 and 2,ERK1/2)在脊髓缺血再灌注损伤过程中的作用.方法:电镜观察缺血30 min再灌注不同时间段[A组(对照组)再灌注0 min、B组再灌注30 min、C组再灌注2 h、D组再灌注8 h]脊髓组织标本的形态学改变,Western blot检测各组脊髓标本中ERK1/2和GIT1的表达及其磷酸化,免疫共沉淀分析GIT1同活化的ERKl/2(phospho-ERK1/2,pERK1/2)相互作用的变化,免疫组织化学分析pERK1/2在神经细胞内的定位表达.结果:电镜结果显示D组脊髓神经细胞出现早期凋亡的征象;Western blot结果显示pERK1/2的表达、GIT1的磷酸化在C、D二组较对照组明显增加且均随再灌注时间延长呈明显增加的趋势;免疫共沉淀结果显示GIT1-pERK1/2结合力在C、D两组较对照组明显增加;免疫组织化学结果显示pERK1/2明显滞留于C、D两组的脊髓神经细胞胞浆区内.结论:缺血再灌注损伤过程中ERK1/2的活化以及在胞核外区域的滞留可能导致了脊髓神经细胞的凋亡,而GIT1作为细胞浆内局部黏附蛋白同pERK1/2的结合可能导致了其在胞浆区的滞留.     

ART1基因沉默对小鼠结肠癌CT26细胞黏附和运动能力的影响

 目的   探讨单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1［mono(ADP ribosyl)transferase-1,ART1］基因沉默对小鼠结肠癌CT26细胞黏附、运动和侵袭能力的影响及其机制。方法   以携带ART1-shRNA的慢病毒感染小鼠结肠癌CT26细胞。将细胞分为实验组(感染ART1-shRNA慢病毒的CT26细胞),NC-shRNA对照组［感染阴性对照慢病毒(negative-control-shRNA,NC-shRNA) CT26细胞］及未处理组(未经处理的CT26细胞);RT-PCR 检测CT26细胞ART1 mRNA 表达变化,Western blot检测ART1、RhoA、integrinβ1蛋白表达的变化;用细胞基质黏附、运动和侵袭实验观察ART1-shRNA对CT26细胞基质黏附、运动和侵袭能力的影响。结果  获得稳定沉默ART1基因的CT26细胞株;RT PCR和Western blot结果均显示,实验组ART1 mRNA和ART1蛋白表达显著低于对照组(P<0.01);Western blot结果显示实验组RhoA、integrinβ1表达均显著低于对照组(P<0.01);实验组细胞黏附、运动、侵袭抑制率分别为70.72%,52.20%和60.00%。结论  单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1 (ART1)基因沉默可降低CT26细胞的黏附、运动、侵袭能力,该作用可能与ART1沉默后下调RhoA和integrin β1活性有关。